Name: population and single-cell analysis of antibiotic persistence in escherichia coli
Uploaded: 2023-03-24T13:50:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli at JoVE.com

Van Melderen 연구실에서의 작업은 ARC 조치 2018-2023, Fonds National de la Recherche Scientifique(FNRS CDR J.0182.21F)의 지원을 받습니다. TO는 ULB 펠로우십의 지원을 받습니다. TS는 FRIA 펠로우십(FNRS)의 지원을 받습니다. JC는 박사후 연구원 "chargé de recherches"(FNRS)의 지원을 받습니다.

<ol>
	<li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitions+and+guidelines+for+research+on+antibiotic+persistence.">Definitions and guidelines for research on antibiotic persistence.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (7), 441-448 (2019).</li><li>Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+between+resistance,+tolerance+and+persistence+to+antibiotic+treatment.">Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 320-330 (2016).</li><li>Pribis, J. P., Zhai, Y., Hastings, P. J., Rosenberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-induced+mutagenesis,+gambler+cells,+and+stealth+targeting+antibiotic-induced+evolution.">Stress-induced mutagenesis, gambler cells, and stealth targeting antibiotic-induced evolution.</a> mBio. 13 (3), 01074 (2022).</li><li>Molina-Quiroz, R. C., Lazinski, D. W., Camilli, A., Levy, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-sequencing+analysis+unveils+novel+genes+involved+in+the+generation+of+persister+cells+in+uropathogenic+Escherichia+coli.">Transposon-sequencing analysis unveils novel genes involved in the generation of persister cells in uropathogenic Escherichia coli.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (11), 6907-6910 (2016).</li><li>Cameron, D. R., Shan, Y., Zalis, E. A., Isabella, V., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+determinant+of+persister+cell+formation+in+bacterial+pathogens.">A genetic determinant of persister cell formation in bacterial pathogens.</a> Journal of Bacteriology. 200 (17), 00303-00318 (2018).</li><li>Cui, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+involved+in+bacteriostatic+antibiotic-induced+persister+formation.">Identification of genes involved in bacteriostatic antibiotic-induced persister formation.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 413 (2018).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+genes+involved+in+Escherichia+coli+persistence+to+tosufloxacin.">Identification of novel genes involved in Escherichia coli persistence to tosufloxacin.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 581986 (2020).</li><li>Verstraeten, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obg+and+membrane+depolarization+are+part+of+a+microbial+bet-hedging+strategy+that+leads+to+antibiotic+tolerance.">Obg and membrane depolarization are part of a microbial bet-hedging strategy that leads to antibiotic tolerance.</a> Molecular Cell. 59 (1), 9-21 (2015).</li><li>Hofsteenge, N., van Nimwegen, E., Silander, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+persister+fractions+suggests+different+mechanisms+of+formation+among+environmental+isolates+of+E.+coli.">Quantitative analysis of persister fractions suggests different mechanisms of formation among environmental isolates of E. coli.</a> BMC Microbiology. 13 (1), 25 (2013).</li><li>Huemer, M., Mairpady Shambat, S., Brugger, S. D., Zinkernagel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+and+persistence-Implications+for+human+health+and+treatment+perspectives.">Antibiotic resistance and persistence-Implications for human health and treatment perspectives.</a> EMBO Reports. 21 (12), 51034 (2020).</li><li>Wilmaerts, D., Windels, E. M., Verstraeten, N., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+mechanisms+leading+to+persister+formation+and+awakening.">General mechanisms leading to persister formation and awakening.</a> Trends in Genetics. 35 (6), 401-411 (2019).</li><li>Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ploidy+is+an+important+determinant+of+fluoroquinolone+persister+survival.">Ploidy is an important determinant of fluoroquinolone persister survival.</a> Current Biology. 31 (10), 2039-2050 (2021).</li><li>Lemma, A. S., Soto-Echevarria, N., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoroquinolone+persistence+in+Escherichia+coli+requires+DNA+repair+despite+differing+between+starving+populations.">Fluoroquinolone persistence in Escherichia coli requires DNA repair despite differing between starving populations.</a> Microorganisms. 10 (2), 286 (2022).</li><li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch.">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).</li><li>Morawska, L. P., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+tolerance+in+environmentally+stressed+Bacillus+subtilis:+Physical+barriers+and+induction+of+a+viable+but+nonculturable+state.">Antibiotic tolerance in environmentally stressed Bacillus subtilis: Physical barriers and induction of a viable but nonculturable state.</a> microLife. 3, (2022).</li><li>Windels, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+persisters+enabled+by+a+&#223;-lactam-induced+filamentation+method+reveals+their+stochastic+single-cell+awakening.">Enrichment of persisters enabled by a &#223;-lactam-induced filamentation method reveals their stochastic single-cell awakening.</a> Communications Biology. 2 (1), 426 (2019).</li><li>Leygeber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+microbial+population+heterogeneity-Expanding+the+toolbox+of+microfluidic+single-cell+cultivations.">Analyzing microbial population heterogeneity-Expanding the toolbox of microfluidic single-cell cultivations.</a> Journal of Molecular Biology. 431 (23), 4569-4588 (2019).</li><li>Rojas, E., Theriot, J. A., Huang, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+Escherichia+coli+growth+rate+to+osmotic+shock.">Response of Escherichia coli growth rate to osmotic shock.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7807-7812 (2014).</li><li>Shi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Starvation+induces+shrinkage+of+the+bacterial+cytoplasm.">Starvation induces shrinkage of the bacterial cytoplasm.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (24), 2104686118 (2021).</li><li>Goode, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+Escherichia+coli+cells+have+a+lower+intracellular+pH+than+susceptible+cells+but+maintain+their+pH+in+response+to+antibiotic+treatment.">Persister Escherichia coli cells have a lower intracellular pH than susceptible cells but maintain their pH in response to antibiotic treatment.</a> mBio. 12 (4), 00909-00921 (2021).</li><li>Manuse, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persisters+are+a+stochastically+formed+subpopulation+of+low-energy+cells.">Bacterial persisters are a stochastically formed subpopulation of low-energy cells.</a> PLoS Biology. 19 (4), 3001194 (2021).</li><li>Fisher, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-dimensional+imaging+of+E.+coli+nucleoid+organization+and+dynamics+in+living+cells.">Four-dimensional imaging of E. coli nucleoid organization and dynamics in living cells.</a> Cell. 153 (4), 882-895 (2013).</li><li>Cabral, D., Wurster, J., Belenky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+persistence+as+a+metabolic+adaptation:+Stress,+metabolism,+the+host,+and+new+directions.">Antibiotic persistence as a metabolic adaptation: Stress, metabolism, the host, and new directions.</a> Pharmaceuticals. 11 (1), 14 (2018).</li><li>Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar+and+broth+dilution+methods+to+determine+the+minimal+inhibitory+concentration+(MIC)+of+antimicrobial+substances.">Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances.</a> Nature Protocols. 3 (2), 163-175 (2008).</li><li>Goormaghtigh, F., Van Melderen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+imaging+and+characterization+of+Escherichia+coli+persister+cells+to+ofloxacin+in+exponential+cultures.">Single-cell imaging and characterization of Escherichia coli persister cells to ofloxacin in exponential cultures.</a> Science Advances. 5 (6), (2019).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicrobeJ,+a+tool+for+high+throughput+bacterial+cell+detection+and+quantitative+analysis.">MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis.</a> Nature Microbiology. 1 (7), 16077 (2016).</li><li>Odsbu, I., Skarstad, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+compaction+in+the+early+part+of+the+SOS+response+is+dependent+on+RecN+and+RecA.">DNA compaction in the early part of the SOS response is dependent on RecN and RecA.</a> Microbiology. 160 (5), 872-882 (2014).</li><li>Pham, T. D. M., Ziora, Z. M., Blaskovich, M. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quinolone+antibiotics.">Quinolone antibiotics.</a> MedChemComm. 10 (10), 1719-1739 (2019).</li><li>Drlica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quinolones:+Action+and+resistance+updated.">Quinolones: Action and resistance updated.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 9 (11), 981-998 (2009).</li><li>Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+antibiotics+kill+bacteria:+From+targets+to+networks.">How antibiotics kill bacteria: From targets to networks.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (6), 423-435 (2010).</li><li>Reyes-Lamothe, R., Sherratt, D. J., Leake, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+and+architecture+of+active+DNA+replication+machinery+in+Escherichia+coli.">Stoichiometry and architecture of active DNA replication machinery in Escherichia coli.</a> Science. 328 (5977), 498-501 (2010).</li><li>Lesterlin, C., Ball, G., Schermelleh, L., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecA+bundles+mediate+homology+pairing+between+distant+sisters+during+DNA+break+repair.">RecA bundles mediate homology pairing between distant sisters during DNA break repair.</a> Nature. 506 (7487), 249-253 (2014).</li><li>Alexeeva, S., Gadella, T. W. J., Verheul, J., Verhoeven, G. S., Den Blaauwen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+interactions+of+early+and+late+assembling+division+proteins+in+Escherichia+coli+cells+resolved+by+FRET:+Bacterial+division+studied+by+spectral+FRET.">Direct interactions of early and late assembling division proteins in Escherichia coli cells resolved by FRET: Bacterial division studied by spectral FRET.</a> Molecular Microbiology. 77 (2), 384-398 (2010).</li><li>Miesenb&#246;ck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Yaginuma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+ATP+concentrations+in+a+single+bacterial+cell+population+revealed+by+quantitative+single-cell+imaging.">Diversity in ATP concentrations in a single bacterial cell population revealed by quantitative single-cell imaging.</a> Scientific Reports. 4, 6522 (2014).</li><li>Ermakova, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+genetically+encoded+indicator+for+intracellular+hydrogen+peroxide.">Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide.</a> Nature Communications. 5, 5222 (2014).</li><li>Kapuscinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAPI:+A+DNA-specific+fluorescent+probe.">DAPI: A DNA-specific fluorescent probe.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry. 70 (5), 220-233 (1995).</li></ol>

저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

이 논문에 제시된 프로토콜은 집단 및 단일 세포 수준에서 항생제 치료에 대한 반응으로 관찰된 지속성 표현형을 분석할 수 있습니다. 실험은 화학적으로 정의된 배지(MOPS 글리세롤 0.4%)에서 성장한 대장균 MG1655 균주로 수행되었습니다. Time-kill assay 및 현미경 실험은 지수 위상 배양에서 수행되었습니다. 우리는 5μg·mL-1 농도의 플루오로퀴놀론인 OFX를 사용하여 지속 세포를 밝혔습니다. 여기에 기술된 접근법은 다른 살균성 항생제, 예컨대 β-락탐, 아미노글리코시드, 또는 항미생물 화합물(31)에 적용될 수 있다. 따라서, 다른 박테리아 균주, 배지 또는 성장 조건이 사용될 수 있다. 여기에 기술된 것과 유사한 설정에서 상이한 형광 융합체를 모니터링하는 것은 항생제 치료 전, 도중 및 후에 DNA 복제(32), DNA 복구(25, 33) 및 세포 분열(34)과 같은 세포 과정을 따르는 데 유용할 수 있다. 유사하게, 형광 리포터는 세포 내 pH35, ATP 36 또는 ROS37 수준과 같은 세포 생리학의 뚜렷한 측면을 조사하기 위해 이용될 수 있습니다. 형광 융합 대신 화학 염료도 사용할 수 있습니다. 예를 들어, hupA-mCherry 융합은 DNA38을 염색하는 형광 염료인 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)로 대체될 수 있습니다. 그러나 이러한 형광 염료와 결합된 타임랩스 현미경을 수행하는 것은 이러한 염색 기술이 타임랩스 실험 중에 세포 주기의 역학을 교란시킬 수 있으므로 피해야 합니다. 대안적으로, 이러한 실험은 관련 시점들에서 스냅-샷 이미징의 시간-경과 분석에 의해 대체될 수 있다.
이러한 형광 리포터가 도움이 되기는 하지만, 위상차 이미지 분석을 통해 추출할 수 있는 정보의 양을 무시해서는 안 됩니다. 여기에서 우리는 성장, OFX 치료 및 회복 단계 전반에 걸쳐 세포 길이 진화를 모니터링했습니다. 박테리아 세포의 세포 폭, 위상차 강도 및 곡률과 같은 위상차 이미지를 기반으로 하는 다른 매개변수도 MicrobeJ27과 같은 적절한 소프트웨어를 사용하여 쉽게 추출할 수 있습니다.
요약하면, 여기에 기술된 절차는 변화하는 환경 또는 스트레스 요인에 대한 세포 반응을 모니터링하기 위해 다른 조건 및 박테리아 종에 적용될 수 있다18, 19. 다른 형광 리포터(전사 및 번역 리포터, 화학 염료)를 유세포 분석/FACS와 같은 모집단 분석과 함께 사용하면 다중 스케일 프레임워크에서 흥미로운 질문을 해결할 수 있습니다.

이 프로토콜은 단일 세포 및 집단 수준에서 특정 항생제 치료에 대한 반응으로 박테리아 지속성 표현형을 분석하는 것을 목표로 합니다. 지속성은 동종 집단 내의 작은 하위 집단이 고용량의 살균 항생제(플루오로퀴놀론, 아미노글리코사이드, β-락탐 등)를 견딜 수 있는 능력을 설명하며, 소위 지속성 세포의 최소 억제 농도(MIC)는 대부분의 집단과 동일합니다. 항생제가 있는 상태에서 시간 경과에 따른 박테리아 생존을 측정할 때 이상성 사멸 역학은 일시적으로 약물 내성 세포의 존재를 나타내며, 비지속성 세포의 초기 빠른 박멸과 지속성 세포의 사멸 속도가 훨씬 느립니다. 항생제 제거 시, 이 세포들은 동일한 항생제로 치료했을 때 유사한 살상 역학을 나타내는 유전적으로 동일한 집단을 생성한다 1,2. 지속성과 대조적으로, 항생제 내성은 집단 수준에서 정의되며 일반적으로 새로운 돌연변이 또는 내성 부여 플라스미드3의 수평 유전자 전달의 결과입니다. 내성을 담당하는 돌연변이는 대부분 약물의 표적 또는 약물 유출 펌프의 프로모터 영역에 위치하지만, 게놈 전체 및 표적 돌연변이 분석 접근법에 의해 확인된 지속성 빈도를 변경하는 유전자는 다양하고 다양한 것으로 입증되었습니다 2,3,4,5,6,7,8 . 따라서 박테리아 세포는 여러 경로 9,10,11을 통해 지속성 상태로 들어갈 수 있으며 이러한 지속성 세포의 생리학을 특성화하기 위해서는 단일 세포 수준에서 지속성 현상을 조사하기 위한 접근 방식이 필요합니다.
형광 현미경과 함께 사용되는 미세유체 도구의 최근 개발은 지속성 표현형의 특성화를 위한 길을 열었고 지속성 세포 형성에서 염색체 복제(염색체 복제) 12, DNA 복구(DNA repair) 13 및 세포 분열(cell division)14과 같은 주요 세포 과정의 역할을 강조했습니다. 이 논문에서 우리는 고용량의 오플록사신으로 처리된 기하급수적으로 성장하는 대장균 배양에서 생성된 지속성 세포를 특성화하기 위해 고전적인 미생물학 분석과 단일 세포 라이브 이미징을 결합한 통합 접근 방식을 설명합니다. 여기에 기술된 프로토콜은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)15와 같은 다른 박테리아 종에서의 항생제 지속성 현상 또는 조건(예를 들어, β-락탐 처리 후 항생제 지속성 16)을 연구하는 데 적용될 수 있으며, 표현형 이질성17,18,19과 관련된 많은 현상을 조사하기 위해 쉽게 수정될 수 있다 . 또한, 이 논문에 설명된 설정은 다른 형광 리포터와 결합하여 단일 세포 수준에서 pH20 또는 ATP21의 세포 내 수준과 같은 관심 있는 뚜렷한 세포 매개변수를 조사할 수 있으며, 이는 잠재적으로 항생제 지속성 현상에 대한 새로운 통찰력을 생성할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Axio Observer</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2.2H2O&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02382.0250</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX Microfluidic System&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CAX2-S0000&#160;</td>
			<td>Microfluidic system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX2 FG</td>
			<td>Merck</td>
			<td>ONIX2 1.0.1&#160;</td>
			<td>Microfluidic software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX2 Manifold Basic&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CAX2-MBC20</td>
			<td>Manifold system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2.6H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02539.0100</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4.5H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02790.0250</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td>Carbon source for MOPS glucose 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+)</td>
			<td></td>
			<td>BE10</td>
			<td>wt reference strain, lab strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+) hupA-mCherry::FRT-kan-FRT</td>
			<td></td>
			<td>BE16</td>
			<td>HU-mCherry fusion integrated via P1 transduction at the native locus, lab strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4.7H2O&#160;</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>24244.232</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://fiji.sc/&#160;</td>
			<td>Image software; Schindelin et al. if used in publication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>56815</td>
			<td>Carbon source for MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR&#174; multiwell culture plate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M8812-100EA</td>
			<td>24-well clear flat bottom 2ml volume culture plate for automated plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768-1KG</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu ORCA Flash 4.0 digital camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C13440-20CU</td>
			<td>Digital Image Acqusition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05099.1000</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05029.1000</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2SO4&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05153.0500</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Broth agar medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>22700041</td>
			<td>Growth medium for plating assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Broth medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12780029</td>
			<td>Growth medium for MIC determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2.6H2O&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05832.1000</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7487-88-9</td>
			<td>Dilution solution for bacterial survival assay used at 10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicrobeJ&#160;</td>
			<td>Imagej/Fiji plugin</td>
			<td>https://www.microbej.com/</td>
			<td>Microscopy image analysis plugin. Ducret et al.for in publication; Detection settings: For bacteria : Area (&#956;m2): 0,1-max; Length (&#956;m): 0,5-max; Width (&#956;m): 0,6-max; Range (&#956;m): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Plates CellASIC ONIX</td>
			<td>Merck</td>
			<td>B04A-03-5PK&#160;</td>
			<td>Plate for microfluidic system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2.4H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05927.0100</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, Free Acid ULTROL&#174; Grade</td>
			<td>Merck</td>
			<td>475898-500GM</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>SIgma-Aldrich</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)6Mo7O24.4H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01180.0250</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01145.0500</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ofloxacin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>82419-36-1</td>
			<td>Fluoroquinolone antibiotic used to treat the bacterial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4, 1x</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Dilution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENESYS 10S UV-Visible Spectrophotometer</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>&#160;840-208200</td>
			<td>UV-Visible Spectrophotometer, Single/Six Cell Holder with PrinterMeasurement of optical density OD600nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SoftMax Pro</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Microplate reader software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-[Tris(hydroxym&#233;thyl)-m&#233;thyl]-glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08602.0250</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss&#174; immersion Oil 518F</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Immersion oil to increase resolution of microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen3.2 Pro</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscopic image acquisition and processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4.7H2O&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08883.0500</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

population and single-cell analysis of antibiotic persistence in escherichia coli

항생제 지속성은 고용량의 살균성 항생제를 일시적으로 견딜 수 있는 작은 박테리아 하위 집단의 능력을 나타냅니다. 살균 항생제 처리시 박테리아 집단의 대부분이 빠르게 죽습니다. 이 첫 번째 빠른 살상 단계는 지속 세포가 생존 할 수 있기 때문에 살상 비율이 크게 감소합니다. 일반적으로 지속성은 고용량의 항생제로 수행된 시간/사멸 분석과 정의된 노출 시간에 의해 모집단 수준에서 결정됩니다. 이 방법은 지속성 세포의 수준과 사멸 동역학에 대한 정보를 제공하지만 지속성 현상의 기저에 있는 고유한 세포 간 이질성을 반영하지 못합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 실시간 형광 현미경을 사용하는 단일 세포 분석과 고전적인 시간/사멸 분석을 결합합니다. 적절한 형광 리포터를 사용하여 살아있는 세포의 현미경 이미징은 염색체 복제 및 분리, 세포 신장 및 세포 분열과 같은 세포 과정에 대한 항생제의 영향에 관한 정보를 제공할 수 있습니다. 집단과 단일 세포 분석을 결합하면 지속성 표현형의 분자 및 세포 특성 분석이 가능합니다.

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Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli

항생제 지속성은 민감한 동종 집단 내의 작은 하위 집단이 고용량의 살균 항생제를 일시적으로 견딜 수 있는 능력을 설명합니다. 현재 프로토콜은 대장균 을 치사량의 오플록사신에 노출시킨 후 분자 및 세포 수준에서 항생제 지속성 표현형을 특성화하기 위한 접근 방식을 결합합니다.

대장균의 항생제 지속성에 대한 개체군 및 단일 세포 분석

Antibiotic persistence refers to the capacity of small bacterial subpopulations to transiently tolerate high doses of bactericidal antibiotics. Upon ...

여기에 설명된 프로토콜은 높은 오플록사신 처리 후 대장균 지속성 세포를 특성화하기 위해 고전적인 미생물학 분석과 단일 세포 라이브 이미징을 결합한 통합 방법을 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 집단 및 단일 세포 수준에서 지속성 현상을 분석하는 것입니다. 집단과 단일 세포 분석을 결합하면 지속성 표현형의 분자 및 세포 특성 분석이 가능합니다.먼저, LB 한천 플레이트에 냉동 글리세롤 스톡에서 관심있는 박테리아 균주를 줄무늬로 만들고 섭씨 37도에서 밤새 15-19 시간 동안 배양하여 단일 콜로니를 얻습니다. 0.4% 포도당이 보충된 5밀리리터의 MOPS 성장 배지가 들어 있는 유리관에 분리된 콜로니를 접종하고 필요한 경우 선택적 항생제를 배지에 추가합니다. 튜브를 섭씨 37도 및 180rpm의 진탕 인큐베이터에 밤새 놓습니다.다음날, 배양액 1 밀리리터를 2, 300 g에서 3분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화하고, 펠렛을 동량의 PBS로 부드럽게 재현탁시켰다. 600 나노 미터에서 OD를 측정하고 2 밀리리터의 최종 부피에서 0.01의 초기 OD600에 필요한 부피를 계산합니다. 다음으로, 2 밀리리터의 MOPS 글리세롤 0.4 % 배지를 투명한 바닥, 24 웰 플레이트의 웰에 넣고 계산 된 하룻밤 배양 부피를 접종합니다.24웰 플레이트를 자동 마이크로플레이트 리더에 넣어 600시간 동안 OD24을 모니터링합니다. 섭씨 37도의 온도와 140rpm의 높은 궤도 회전으로 15분마다 OD600을 측정하도록 마이크로플레이트 리더를 설정합니다. LB 한천 100ml를 녹이고 플라스크를 섭씨 55도에서 비축하여 응고를 방지합니다.6개의 작은 유리 플라스크를 준비하고, 멸균 피펫을 사용하여 5밀리리터의 액체 LB 한천 배지를 각 플라스크에 피펫팅한다. 밀리리터 당 5 밀리그램의 10 마이크로 리터의 플록사신 원액을 취하여 90 마이크로 리터의 초순수로 희석하십시오. LB 한천 배지를 함유하는 6개의 유리 플라스크 각각에 희석된 오플록사신의 증가하는 부피를 첨가하여 오플록사신의 밀리리터당 0 내지 0.1 마이크로그램의 최종 농도를 얻는다.플라스크를 여러 번 회전시켜 용액을 혼합하고 항생제가 첨가된 LB 한천 배지를 6웰 배양 플레이트에 붓습니다. 한천이 응고될 때까지 식히고 사용하기 전에 플레이트를 건조시키십시오. 하룻밤 동안 박테리아 배양액을 PBS로 10 내지 7 CFU의 최종 세포 밀도로 희석한다.2마이크로리터의 희석된 배양액을 건조된 6웰 플레이트의 모든 웰에 발견합니다. 접시를 섭씨 37도의 인큐베이터에 밤새 넣기 전에 반점을 말리십시오. 다음날, 어떤 ofloxacin 농도에서 박테리아 콜로니의 성장이 억제되는지 확인하십시오.준비된 LB 한천의 약 25 밀리리터를 페트리 접시에 붓습니다. 그런 다음 5-8 개의 멸균 유리 비드를 각 응고 및 건조 된 플레이트에 첨가하십시오. 접시를 뒤집고 라벨을 붙입니다.다음으로, 900 마이크로 리터의 0.01 몰 황산 마그네슘 용액을 함유하는 10 배 연속 희석 유리관을 준비한다. 유리관에서, 신선하고 온도 조절된 배지에서 하룻밤 배양물을 약 0.001의 최종 OD600으로 희석하고, 배양물이 인큐베이터에서 밤새 성장하도록 한다. 다음날, OD600이 0.3에 도달하면, 스팟 분석 데이터에 따라 희석을 위해 배양물 100 마이크로리터를 옮긴다.박테리아 배양의 10 배 연속 희석을 수행하십시오. 이어서, 희석된 배양액 100 마이크로리터를 준비된 LB 한천 플레이트 상에 플레이트한다. 박테리아 배양액에 원하는 농도의 오플록사신을 첨가하고 흔들면서 섭씨 37도에서 계속 배양합니다.관련 시점에서 배양액 100마이크로리터를 회수하고 스팟 분석 데이터에 따라 배양액을 희석합니다. 희석된 배양물을 LB 한천 플레이트 상에 100 마이크로리터의 플레이트를 한다. 다음날, 콜로니를 검출할 수 있는 가장 높은 두 개의 희석액에서 하룻밤 배양된 플레이트의 콜로니를 계산합니다.T0에서 밀리리터당 CFU에서 각 시점에서 밀리리터당 CFU를 정규화하여 생존율을 계산하고 로그 밑이 10인 정규화된 값을 시간 함수로 플로팅합니다. 미세유체 플레이트의 모든 웰에서 보존 용액을 제거하고 신선한 배양 배지로 교체합니다. Seal 버튼을 클릭하거나 미세유체 소프트웨어를 통해 매니폴드 시스템으로 미세유체 플레이트를 밀봉합니다.다음으로, 미세유체 소프트웨어 인터페이스에서 Run Liquid Priming Sequence(액체 프라이밍 시퀀스 실행)를 클릭하여 첫 번째 프라이밍 시퀀스를 수행합니다. 현미경 이미징을 시작하기 전에 섭씨 37도의 온도 조절 현미경 캐비닛에서 최소 2시간 동안 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 실험을 시작하기 전에 두 번째 Run Liquid Priming Sequence를 시작합니다.microfluidic 소프트웨어 인터페이스에서 Unseal Plate(플레이트 개봉 해제)를 클릭하여 미세유체 플레이트를 밀봉합니다. 웰 내의 배지를 200 마이크로리터의 신선한 배지, 항생제 함유 신선한 배지, 및 0.01 OD 희석된 배양 샘플을 신선한 배지로 교체한다. 앞에서 설명한 대로 미세유체 플레이트를 밀봉한 후 플레이트를 현미경 캐비닛 내부의 현미경 대물렌즈에 놓습니다.microfluidic 소프트웨어에서 Run Cell Loading Sequence(세포 로딩 시퀀스 실행)를 클릭하여 세포를 미세유체 플레이트에 로딩할 수 있습니다. 투과광 모드를 사용하여 최적의 초점을 설정하고 필드당 최대 300개의 셀을 관찰할 수 있는 여러 관심 영역을 선택합니다. 미세유체 소프트웨어에서 Run a Custom Sequence를 편집하여 6.9킬로파스칼의 신선한 배지를 웰 1과 2에 6시간 동안 주입한 다음, 항생제가 포함된 배지를 6.9킬로파스칼 또는 6시간 동안 웰 3에 주입하고, 마지막으로 6.9킬로파스칼의 신선한 배지를 웰 4와 5에 24시간 동안 주입합니다.투과광과 형광 리포터용 여기 광원을 사용하여 15분마다 한 프레임씩 타임랩스 모드에서 현미경 이미징을 수행하고 미세유체 프로그램을 시작합니다. 컴퓨터에서 ImageJ 또는 Fiji 소프트웨어를 열고 하이퍼스택 타임랩스 현미경 이미지를 Fiji 로딩 바에 드래그합니다. Image, Color, Make Composite를 차례로 사용하여 하이퍼스택의 여러 채널을 융합합니다.Image(이미지), Color(색상)를 사용한 다음 채널이 원하는 색상과 일치하지 않는 경우 Arrange Channels(채널 정렬)를 사용합니다. MicrobeJ 플러그인을 열고 수동 편집 인터페이스를 사용하여 박테리아 세포를 감지합니다. 자동으로 감지된 셀을 삭제하고 관심 있는 지속형 셀을 프레임별로 수동으로 간략하게 설명합니다.감지 후 MicrobeJ 수동 편집 인터페이스의 결과 아이콘을 사용하여 ResultJ 테이블을 생성합니다. ResultJ 테이블을 사용하여 단일 세포 분석에서 관심 있는 다양한 파라미터에 대한 통찰력을 얻고 ResultJ 파일을 저장합니다. 두 균주에 대한 오플록사신의 MIC는 밀리리터당 0.06마이크로그램으로 결정되었으며, 이는 hupA-mCherry 융합이 동종 야생형 균주와 비교하여 오플록사신의 민감도에 영향을 미치지 않았음을 나타냅니다.스팟 분석은 시간 경과에 따른 적절한 희석, 예를 들어 시간 0에서 10 내지 음성 5번째 희석에서 단리된 클론을 보여주었다. 시간-사멸 분석에서, 첫 번째 기울기가 비지속적 개체군의 빠른 사멸을 반영하는 전형적인 이상성 곡선이 관찰되었습니다. 두 번째 단계에서는 더 느린 사멸 속도를 보여 약물 내성 지속 세포의 존재가 드러났습니다.특히, 시간-사멸 곡선은 hupA-mCherry 융합 단백질이 시간-사멸 동역학에 영향을 미치지 않았음을 보여줍니다. 미세유체 실험에서, 제1 성장기는 세포가 오플록사신 처리 전에 생존 가능하고 분열되었음을 나타낸다. 이 첫 번째 성장 단계 후, 항생제가 세포에 도달하자마자 세포 분열이 차단되었습니다.오플록사신 치료 후, 신선한 배지로 관류했을 때, 대다수의 세포는 성장을 재개할 수 없었다. 대조적으로, 작은 하위 집단은 길어지고 필라멘트 세포를 생성할 수 있으며, 이는 지속 세포로 정의됩니다. 분열하는 지속기 필라멘트는 여러 개의 딸 세포를 생성했으며, 대부분은 처리되지 않은 세포와 유사하게 성장하고 분열하기 시작했습니다.세포 길이의 증가는 총 mCherry 형광 강도의 증가와 상관관계가 있으며, 이는 복제 재시작 및 핵체 풍부도의 증가를 반영합니다. 지속성을 연구하기 위해 세포 내 리포터를 포함하는 균주를 사용할 때, 리포터의 존재가 야생형 균주에 비해 성장, MIC 및 사멸을 방해하지 않는다는 것이 임페리얼입니다. 여기에 설명된 절차는 변화하는 환경 또는 스트레스에 대한 세포 반응을 모니터링하기 위해 다른 조건 및 박테리아 종에 적용될 수 있습니다.동일한 설정에서 다른 형광 리포터를 사용하여 지속 세포의 생리학에 대한 새로운 통찰력을 조사할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

의 활동을 측정하는 어세이 대장균은 라이신 Decarboxyase을 Inducible

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

연구

생물학

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

에서 곰팡이 Endoglucanase 활동의 높은 처리량 검사 대장균</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

에 박테리아 기능 네트워크 및 경로를 매핑<em&gt; 대장균</em&gt; 합성 유전자 배열을 사용하여

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

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의 단백질 단지의 식별<em&gt; 대장균</em&gt; 직렬 질량 분석법과 함께 순차적 펩타이드의 동질 정화를 사용하여

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

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Electrocompetent의 준비를위한 신속한 프로토콜<em&gt; 대장균</em&gt;와<em&gt; 콜레라 균</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

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라이브의 검출<em&gt; 대장균</em&gt; O157 : PMA-qPCR에 의한 H7 셀

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

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에서 펩타이드 및 단백질과 재조합 엘라스틴 같은 폴리 펩타이드 및 그 융해의 비 크로마토 그래피 정제<em&gt; 대장균</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

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막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에<em&gt; 대장균</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

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단백질 공동 식의 다각적 인 장점에<em&gt; 대장균</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 실험에 대 한 개별 대장균 세포에 성적표를 라벨에 대 한 방법

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...