Populasjons- og enkeltcelleanalyse av antibiotikapersistens i Escherichia coli

Protokollen beskrevet her gir en integrerende metode som kombinerer klassiske mikrobiologiske analyser med encellet levende avbildning for å karakterisere Escherichia coli persisterceller etter høy ofloksacinbehandling. Den største fordelen med denne teknikken er å analysere utholdenhetsfenomen på befolknings- og enkeltcellenivå. Kombinere populasjons- og enkeltcelleanalyse muliggjør molekylær og cellulær karakterisering av persistensfenotypen.

For å begynne, strek bakteriestammen av interesse fra en frossen glyserolbestand på en LB-agarplate, og inkuber ved 37 grader Celsius over natten i en periode på 15 til 19 timer for å oppnå enkeltkolonier. Inokuler en isolert koloni i et glassrør som inneholder fem milliliter MOPS vekstmedium tilsatt 0,4% glukose, og tilsett om nødvendig et selektivt antibiotika i mediet. Plasser røret i en ristende inkubator ved 37 grader Celsius og 180 o / min over natten.

Neste dag, sentrifuge en milliliter kultur ved 2.300 g i tre minutter for å pelletere cellene, og forsiktig resuspendere pelleten med samme volum PBS. Mål OD ved 600 nanometer, og beregne volumet som trengs for en innledende OD600 på 0,01 i et endelig volum på to milliliter. Deretter tilsettes to milliliter MOPS-glyserol 0,4% medium i en brønn med en gjennomsiktig bunn, 24-brønnsplate, og inokulerer med det beregnede kulturvolumet over natten.

Plasser 24-brønnsplaten i en automatisert mikroplateleser for å overvåke OD600 i 24 timer. Still inn mikroplateleseren til å måle OD600 hvert 15. minutt ved en temperatur på 37 grader Celsius og med en høy banerotasjon på 140 o / min. Smelt 100 ml LB-agar, og fyll kolben ved 55 grader Celsius for å unngå størkning.

Forbered seks små glassflasker, og pipett fem milliliter flytende LB-agarmedium inn i hver kolbe ved hjelp av en steril pipette. Ta 10 mikroliter av de fem milligram per milliliter ofloxacin lagerløsning, og fortynn i 90 mikroliter ultrarent vann. Tilsett økende volumer av det fortynnede ofloksacin til hver av de seks glassflaskene som inneholder LB-agarmedium for å få en endelig konsentrasjon på null til 0,1 mikrogram per milliliter ofloksacin.

Bland løsningen ved å rotere kolbene flere ganger, og hell det antibiotikatilsatte LB-agarmediet i en seks-brønns kulturplate. La agaren avkjøles til den stivner, og tørk platen før bruk. Fortynn en bakteriekultur over natten til en endelig celletetthet på en gang 10 til den syvende CFU per milliliter med PBS.

Spot to mikroliter fortynnet kultur på hver brønn i den tørkede seksbrønnsplaten. La flekkene tørke før du legger platen i en inkubator ved 37 grader Celsius over natten. Neste dag, kontroller ved hvilken ofloxacinkonsentrasjon veksten av bakteriekolonier er hemmet.

Hell ca. 25 ml av den tilberedte LB-agaren i en petriskål. Tilsett deretter fem til åtte sterile glassperler til hver størknet og tørket plate. Inverter og merk platene.

Deretter fremstilles ti ganger serielle fortynningsglassrør inneholdende 900 mikroliter 0,01-molar magnesiumsulfatløsning. I et glassrør, fortynn en nattkultur i friskt og temperaturjustert medium til en endelig OD600 på ca. 0,001, og la kulturen vokse over natten i en inkubator. Neste dag, når OD600 når 0,3, overfør 100 mikroliter av kulturen for fortynning i henhold til spotanalysedataene.

Utfør en ti ganger seriell fortynning av bakteriekulturen. Plate deretter 100 mikroliter av den fortynnede kulturen på de tilberedte LB-agarplatene. Legg til ønsket konsentrasjon av ofloksacin i bakteriekulturen, og fortsett å inkubere ved 37 grader Celsius mens du rister.

På relevante tidspunkter, trekk ut 100 mikroliter av kulturen, og fortynn kulturen i samsvar med spotanalysedataene. Plate 100 mikroliter av den fortynnede kulturen på LB-agarplatene. Neste dag teller du koloniene av de inkuberte platene over natten ved de to høyeste fortynningene som kolonier kan oppdages for.

Beregn overlevelsesforholdet ved å normalisere CFU per milliliter ved hvert tidspunkt ved CFU per milliliter ved T0, og plott loggbasen 10 normalisert verdi som en funksjon av tid. Fjern konserveringsløsningen fra hver brønn på den mikrofluidiske platen, og erstatt den med friskt kulturmedium. Forsegl mikrofluidplaten med manifoldsystemet ved å klikke på Seal-knappen eller gjennom mikrofluidisk programvare.

Deretter, på det mikrofluidiske programvaregrensesnittet, utfør en første primingsekvens ved å klikke på Kjør flytende primingssekvens. Inkuber platen i et termostatstyrt kabinett i mikroskopet ved 37 grader Celsius i minst to timer før du starter mikroskopiavbildningen. Start deretter en ny Run Liquid Priming Sequence før du begynner eksperimentet.

Forsegle den mikrofluidiske platen ved å klikke på Unseal Plate på det mikrofluidiske programvaregrensesnittet. Bytt ut mediet i brønnene med 200 mikroliter ferskt medium, antibiotikaholdig ferskt medium og 0,01 OD fortynnet dyrkningsprøve i ferskt medium. Etter å ha forseglet den mikrofluidiske platen som vist før, plasser platen på mikroskopmålet inne i mikroskopskapet.

I mikrofluidisk programvare klikker du på Run Cell Loading Sequence for å tillate lasting av cellene i mikrofluidplaten. Angi et optimalt fokus ved hjelp av overført lysmodus, og velg flere interesseområder der et passende cellenummer på opptil 300 celler per felt kan observeres. På den mikrofluidiske programvaren redigerer du Kjør en egendefinert sekvens for å programmere injeksjonen av ferskt medium ved 6,9 kilopascal i seks timer til brønn en og to, etterfulgt av mediet som inneholder antibiotika ved 6,9 kilopascal eller seks timer til brønn tre, og til slutt det ferske mediet ved 6,9 kilopascal i 24 timer til brønn fire og fem.

Utfør mikroskopiavbildning i time-lapse-modus med en ramme hvert 15. minutt ved hjelp av overført lys og eksitasjonslyskilden for den fluorescerende reporteren, og start det mikrofluidiske programmet. Åpne ImageJ- eller Fiji-programvaren på datamaskinen, og dra intervallmikroskopibildene med hyperstack til Fiji-lastestangen. Bruk Bilde, etterfulgt av Farge, og deretter Lag sammensatt for å smelte sammen de forskjellige kanalene i hyperstakken.

Bruk Bilde, Farge og deretter Ordne kanaler hvis kanalene ikke samsvarer med ønsket farge. Åpne MicrobeJ-pluginet, og oppdag bakteriecellene ved hjelp av det manuelle redigeringsgrensesnittet. Slett de automatisk oppdagede cellene, og skisser manuelt de vedvarende cellene av interesse ramme for ramme.

Etter gjenkjenning bruker du resultatikonet i det manuelle redigeringsgrensesnittet for MicrobeJ til å generere en ResultJ-tabell. Bruk ResultJ-tabellen til å få innsikt i ulike parametere av interesse for enkeltcelleanalysen, og lagre ResultJ-filen. MIC av ofloxacin for begge stammer ble bestemt til å være 0,06 mikrogram per milliliter, noe som indikerer at hupA-mCherry-fusjonen ikke påvirket følsomheten til ofloksacin i sammenligning med den isogene villtypestammen.

Spotanalysen viste isolerte kloner ved passende fortynninger over tid, for eksempel 10 til den negative femte fortynningen ved tid null. I time-kill-analysen ble det observert en typisk bifasisk kurve der den første skråningen gjenspeiler den raske drapet av den ikke-persisterende populasjonen. Den andre fasen viste en langsommere drapsrate, noe som avslørte tilstedeværelsen av stofftolerante persisterceller.

Spesielt viser time-kill-kurven at hupA-mCherry-fusjonsproteinet ikke påvirket tidsdrepende kinetikk. I det mikrofluidiske eksperimentet indikerer den første vekstfasen at cellene var levedyktige og delte seg før ofloksacinbehandlingen. Etter denne første vekstfasen ble celledelingen blokkert så snart antibiotika nådde cellene.

Etter ofloksacinbehandling, ved perfusjon med ferskt medium, var de aller fleste cellene ikke i stand til å gjenoppta veksten. I motsetning til dette kan en liten subpopulasjon forlenge og generere filamentøse celler, som er definert som persisterceller. Det delende persisterfilamentet genererte flere datterceller, hvorav de fleste begynte å vokse og dele seg på samme måte som ubehandlede celler.

Økningen i cellelengde korrelerte med en økning i den totale mCherry-fluorescensintensiteten, noe som gjenspeiler replikasjonsstart og en økning i nukleoidoverflod. Når du bruker en stamme som inneholder en intracellulær reporter for å studere utholdenhet, er det viktig at reporterens tilstedeværelse ikke forstyrrer vekst, MIC og drap sammenlignet med en villtypestamme. Prosedyren beskrevet her kan brukes på andre forhold og bakteriearter for å overvåke cellulære responser på skiftende miljøer eller påkjenninger.

Ved å bruke andre fluorescerende reportere i et identisk oppsett, kan ny innsikt i fysiologien til persisterceller undersøkes.