Populations- och encellsanalys av antibiotikapersistens i Escherichia coli

Protokollet som beskrivs här tillhandahåller en integrativ metod som kombinerar klassiska mikrobiologiska analyser med encells levande avbildning för att karakterisera Escherichia coli-persisterceller efter hög ofloxacinbehandling. Den största fördelen med denna teknik är att analysera persistensfenomen på befolknings- och encellsnivå. Kombinationen av populations- och encellsanalys möjliggör molekylär och cellulär karakterisering av persistensfenotypen.

För att börja, stryka bakteriestammen av intresse från ett fryst glycerolbestånd på en LB-agarplatta och inkubera vid 37 grader Celsius över natten under en period av 15 till 19 timmar för att erhålla enstaka kolonier. Inokulera en isolerad koloni i ett glasrör innehållande fem milliliter MOPS-tillväxtmedium kompletterat med 0,4% glukos och, om nödvändigt, tillsätt ett selektivt antibiotikum i mediet. Placera röret i en skakande inkubator vid 37 grader Celsius och 180 rpm över natten.

Följande dag centrifugerar en milliliter kultur vid 2 300 g i tre minuter för att pellet cellerna och försiktigt resuspendera pelleten med samma volym PBS. Mät OD vid 600 nanometer och beräkna volymen som behövs för en initial OD600 på 0,01 i en slutlig volym på två milliliter. Tillsätt sedan två milliliter MOPS-glycerol 0,4% medium i en brunn med en transparent botten, 24-brunnsplatta och inokulera med den beräknade odlingsvolymen över natten.

Placera plattan med 24 brunnar i en automatiserad mikroplattläsare för att övervaka OD600 i 24 timmar. Ställ in mikroplattläsaren så att OD600 mäts var 15:e minut vid en temperatur på 37 grader Celsius och med en hög omloppsbana på 140 varv per minut. Smält 100 ml LB-agar och fyll kolven vid 55 grader Celsius för att undvika stelning.

Bered sex små glasflaskor och pipettera fem ml flytande LB-agarmedium i varje kolv med en steril pipett. Ta 10 mikroliter av de fem milligram per milliliter ofloxacin stamlösning och späd i 90 mikroliter ultrarent vatten. Tillsätt ökande volymer av det utspädda ofloxacinet till var och en av de sex glasflaskorna innehållande LB-agarmedium för att få en slutlig koncentration på noll till 0,1 mikrogram per milliliter ofloxacin.

Blanda lösningen genom att rotera kolvarna flera gånger och häll det antibiotikatillsatta LB-agarmediet i en odlingsplatta med sex brunnar. Låt agarn svalna tills den stelnat och torka plattan innan den används. Späd en bakteriekultur över natten till en slutlig celldensitet på en gånger 10 till den sjunde CFU per milliliter med PBS.

Spot två mikroliter utspädd kultur på varje brunn på den torkade sexbrunnsplattan. Låt fläckarna torka innan du lägger plattan i en inkubator vid 37 grader Celsius över natten. Nästa dag, kontrollera vid vilken ofloxacinkoncentration tillväxten av bakteriekolonier hämmas.

Häll cirka 25 ml av den beredda LB-agaren i en petriskål. Tillsätt sedan fem till åtta sterila glaspärlor till varje stelnad och torkad tallrik. Invertera och märk plattorna.

Förbered sedan tiofaldiga seriella utspädningsglasrör innehållande 900 mikroliter 0,01-molar magnesiumsulfatlösning. Späd en nattkultur i färskt och temperaturjusterat medium i ett glasrör till en slutlig OD600 på cirka 0,001 och låt kulturen växa över natten i en inkubator. Följande dag, när OD600 når 0,3, överför 100 mikroliter av kulturen för utspädning enligt spotanalysdata.

Utför en tiofaldig serieutspädning av bakteriekulturen. Platta sedan 100 mikroliter av den utspädda kulturen på de beredda LB-agarplattorna. Tillsätt önskad koncentration av ofloxacin i bakteriekulturen och fortsätt att inkubera vid 37 grader Celsius under skakning.

Vid relevanta tidpunkter, dra ut 100 mikroliter av kulturen och späd kulturen i enlighet med platsanalysdata. Platta 100 mikroliter av den utspädda kulturen på LB-agarplattorna. Nästa dag räknar kolonierna av de inkuberade plattorna över natten vid de två högsta utspädningarna för vilka kolonier kan detekteras.

Beräkna överlevnadsförhållandet genom att normalisera CFU per milliliter vid varje tidpunkt vid CFU per milliliter vid T0 och plotta logbasen 10 normaliserat värde som en funktion av tiden. Ta bort konserveringslösningen från varje brunn på mikrofluidplattan och ersätt den med färskt odlingsmedium. Försegla mikrofluidikplattan med grenrörssystemet genom att klicka på tätningsknappen eller genom mikrofluidikprogramvaran.

Därefter, på mikrofluidikprogramvarugränssnittet, utför en första primingsekvens genom att klicka på Kör flytande primingsekvens. Inkubera plattan i ett termostatstyrt skåp i mikroskopet vid 37 grader Celsius i minst två timmar innan mikroskopiavbildningen påbörjas. Starta sedan en andra Run Liquid Priming Sequence innan du påbörjar experimentet.

Försegla mikrofluidikplattan genom att klicka på Unseal Plate på mikrofluidikprogramvarugränssnittet. Byt ut mediet i brunnarna med 200 mikroliter färskt medium, antibiotikum innehållande färskt medium och 0,01 OD utspätt odlingsprov i det färska mediet. Efter tätning av mikrofluidikplattan som visats tidigare, placera plattan på mikroskopmålet inuti mikroskopskåpet.

I mikrofluidikprogramvaran klickar du på Run Cell Loading Sequence för att tillåta laddning av cellerna i mikrofluidikplattan. Ställ in ett optimalt fokus med det överförda ljusläget och välj flera intressanta regioner där ett lämpligt cellantal på upp till 300 celler per fält kan observeras. På mikrofluidikprogramvaran redigerar du Kör en anpassad sekvens för att programmera injektionen av färskt medium vid 6,9 kilopascal i sex timmar till brunnar ett och två, följt av mediet innehållande antibiotikum vid 6,9 kilopascal eller sex timmar till brunn tre, och slutligen det färska mediet vid 6,9 kilopascal i 24 timmar till brunnar fyra och fem.

Utför mikroskopiavbildning i time-lapse-läge med en ram var 15: e minut med överfört ljus och excitationsljuskällan för den fluorescerande reportern och starta mikrofluidikprogrammet. Öppna ImageJ- eller Fiji-programvaran på datorn och dra hyperstack-time-lapse-mikroskopibilderna till Fiji-laddningsfältet. Använd Bild, följt av Färg, och sedan Gör sammansatt för att smälta samman de olika kanalerna i hyperstacken.

Använd Bild, Färg och sedan Ordna kanaler om kanalerna inte motsvarar önskad färg. Öppna MicrobeJ-plugin och upptäck bakteriecellerna med hjälp av det manuella redigeringsgränssnittet. Ta bort de automatiskt identifierade cellerna och skapa en ikon för de bevarade cellerna av intresse manuellt ram för bildruta.

Efter identifieringen använder du ikonen Resultat i MicrobeJ manuella redigeringsgränssnitt för att generera en ResultJ-tabell. Använd tabellen ResultJ för att få insikter om olika parametrar av intresse för encellsanalysen och spara ResultJ-filen. MIC för ofloxacin för båda stammarna bestämdes till 0,06 mikrogram per milliliter, vilket indikerar att hupA-mCherry-fusionen inte påverkade känsligheten hos ofloxacin jämfört med den isogena vildtypstammen.

Spottestet visade isolerade kloner vid lämpliga utspädningar över tid, t.ex. 10 till den negativa femte utspädningen vid nollpunkten. I time-kill-analysen observerades en typisk bifasisk kurva där den första lutningen återspeglar den snabba avdödningen av den icke-persisterande populationen. Den andra fasen visade en långsammare dödshastighet, vilket avslöjade närvaron av läkemedelstoleranta persisterande celler.

Noterbart är att time-kill-kurvan visar att fusionsproteinet hupA-mCherry inte påverkade tidsdödskinetiken. I det mikrofluidiska experimentet indikerar den första tillväxtfasen att cellerna var livskraftiga och delade sig före ofloxacinbehandlingen. Efter denna första tillväxtfas blockerades celldelningen så snart antibiotikumet nådde cellerna.

Efter ofloxacinbehandling, vid perfusion med färskt medium, kunde de allra flesta cellerna inte återuppta tillväxten. Däremot kan en liten subpopulation förlängas och generera filamentösa celler, vilka definieras som persistercellerna. Det delande persisterfilamentet genererade flera dotterceller, varav de flesta började växa och dela sig på samma sätt som obehandlade celler.

Ökningen i celllängd korrelerade med en ökning av den totala mCherry-fluorescensintensiteten, vilket återspeglar replikationsstart och en ökning av nukleoidöverflöd. När man använder en stam som innehåller en intracellulär reporter för att studera uthållighet är det kejserligt att reporterns närvaro inte stör tillväxt, MIC och dödande jämfört med en vildtypsstam. Förfarandet som beskrivs här kan tillämpas på andra tillstånd och bakteriearter för att övervaka cellulära svar på förändrade miljöer eller påfrestningar.

Genom att använda andra fluorescerande reportrar i en identisk inställning kan nya insikter i persistercellernas fysiologi undersökas.