Name: population and single-cell analysis of antibiotic persistence in escherichia coli
Uploaded: 2023-03-24T13:50:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli at JoVE.com

Van Melderen laboratuvarındaki çalışmalar, ARC eylemleri 2018-2023, Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS CDR J.0182.21F) tarafından desteklenmektedir. T.O. bir ULB bursu ile desteklenmektedir. T.S. bir FRIA bursu (FNRS) tarafından desteklenmektedir. J.C., doktora sonrası bir burs olan "chargé de recherches" (FNRS) tarafından desteklenmektedir.

<ol>
	<li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitions+and+guidelines+for+research+on+antibiotic+persistence.">Definitions and guidelines for research on antibiotic persistence.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (7), 441-448 (2019).</li><li>Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+between+resistance,+tolerance+and+persistence+to+antibiotic+treatment.">Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 320-330 (2016).</li><li>Pribis, J. P., Zhai, Y., Hastings, P. J., Rosenberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-induced+mutagenesis,+gambler+cells,+and+stealth+targeting+antibiotic-induced+evolution.">Stress-induced mutagenesis, gambler cells, and stealth targeting antibiotic-induced evolution.</a> mBio. 13 (3), 01074 (2022).</li><li>Molina-Quiroz, R. C., Lazinski, D. W., Camilli, A., Levy, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-sequencing+analysis+unveils+novel+genes+involved+in+the+generation+of+persister+cells+in+uropathogenic+Escherichia+coli.">Transposon-sequencing analysis unveils novel genes involved in the generation of persister cells in uropathogenic Escherichia coli.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (11), 6907-6910 (2016).</li><li>Cameron, D. R., Shan, Y., Zalis, E. A., Isabella, V., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+determinant+of+persister+cell+formation+in+bacterial+pathogens.">A genetic determinant of persister cell formation in bacterial pathogens.</a> Journal of Bacteriology. 200 (17), 00303-00318 (2018).</li><li>Cui, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+involved+in+bacteriostatic+antibiotic-induced+persister+formation.">Identification of genes involved in bacteriostatic antibiotic-induced persister formation.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 413 (2018).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+genes+involved+in+Escherichia+coli+persistence+to+tosufloxacin.">Identification of novel genes involved in Escherichia coli persistence to tosufloxacin.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 581986 (2020).</li><li>Verstraeten, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obg+and+membrane+depolarization+are+part+of+a+microbial+bet-hedging+strategy+that+leads+to+antibiotic+tolerance.">Obg and membrane depolarization are part of a microbial bet-hedging strategy that leads to antibiotic tolerance.</a> Molecular Cell. 59 (1), 9-21 (2015).</li><li>Hofsteenge, N., van Nimwegen, E., Silander, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+persister+fractions+suggests+different+mechanisms+of+formation+among+environmental+isolates+of+E.+coli.">Quantitative analysis of persister fractions suggests different mechanisms of formation among environmental isolates of E. coli.</a> BMC Microbiology. 13 (1), 25 (2013).</li><li>Huemer, M., Mairpady Shambat, S., Brugger, S. D., Zinkernagel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+and+persistence-Implications+for+human+health+and+treatment+perspectives.">Antibiotic resistance and persistence-Implications for human health and treatment perspectives.</a> EMBO Reports. 21 (12), 51034 (2020).</li><li>Wilmaerts, D., Windels, E. M., Verstraeten, N., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+mechanisms+leading+to+persister+formation+and+awakening.">General mechanisms leading to persister formation and awakening.</a> Trends in Genetics. 35 (6), 401-411 (2019).</li><li>Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ploidy+is+an+important+determinant+of+fluoroquinolone+persister+survival.">Ploidy is an important determinant of fluoroquinolone persister survival.</a> Current Biology. 31 (10), 2039-2050 (2021).</li><li>Lemma, A. S., Soto-Echevarria, N., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoroquinolone+persistence+in+Escherichia+coli+requires+DNA+repair+despite+differing+between+starving+populations.">Fluoroquinolone persistence in Escherichia coli requires DNA repair despite differing between starving populations.</a> Microorganisms. 10 (2), 286 (2022).</li><li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch.">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).</li><li>Morawska, L. P., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+tolerance+in+environmentally+stressed+Bacillus+subtilis:+Physical+barriers+and+induction+of+a+viable+but+nonculturable+state.">Antibiotic tolerance in environmentally stressed Bacillus subtilis: Physical barriers and induction of a viable but nonculturable state.</a> microLife. 3, (2022).</li><li>Windels, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+persisters+enabled+by+a+&#223;-lactam-induced+filamentation+method+reveals+their+stochastic+single-cell+awakening.">Enrichment of persisters enabled by a &#223;-lactam-induced filamentation method reveals their stochastic single-cell awakening.</a> Communications Biology. 2 (1), 426 (2019).</li><li>Leygeber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+microbial+population+heterogeneity-Expanding+the+toolbox+of+microfluidic+single-cell+cultivations.">Analyzing microbial population heterogeneity-Expanding the toolbox of microfluidic single-cell cultivations.</a> Journal of Molecular Biology. 431 (23), 4569-4588 (2019).</li><li>Rojas, E., Theriot, J. A., Huang, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+Escherichia+coli+growth+rate+to+osmotic+shock.">Response of Escherichia coli growth rate to osmotic shock.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7807-7812 (2014).</li><li>Shi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Starvation+induces+shrinkage+of+the+bacterial+cytoplasm.">Starvation induces shrinkage of the bacterial cytoplasm.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (24), 2104686118 (2021).</li><li>Goode, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+Escherichia+coli+cells+have+a+lower+intracellular+pH+than+susceptible+cells+but+maintain+their+pH+in+response+to+antibiotic+treatment.">Persister Escherichia coli cells have a lower intracellular pH than susceptible cells but maintain their pH in response to antibiotic treatment.</a> mBio. 12 (4), 00909-00921 (2021).</li><li>Manuse, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persisters+are+a+stochastically+formed+subpopulation+of+low-energy+cells.">Bacterial persisters are a stochastically formed subpopulation of low-energy cells.</a> PLoS Biology. 19 (4), 3001194 (2021).</li><li>Fisher, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-dimensional+imaging+of+E.+coli+nucleoid+organization+and+dynamics+in+living+cells.">Four-dimensional imaging of E. coli nucleoid organization and dynamics in living cells.</a> Cell. 153 (4), 882-895 (2013).</li><li>Cabral, D., Wurster, J., Belenky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+persistence+as+a+metabolic+adaptation:+Stress,+metabolism,+the+host,+and+new+directions.">Antibiotic persistence as a metabolic adaptation: Stress, metabolism, the host, and new directions.</a> Pharmaceuticals. 11 (1), 14 (2018).</li><li>Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar+and+broth+dilution+methods+to+determine+the+minimal+inhibitory+concentration+(MIC)+of+antimicrobial+substances.">Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances.</a> Nature Protocols. 3 (2), 163-175 (2008).</li><li>Goormaghtigh, F., Van Melderen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+imaging+and+characterization+of+Escherichia+coli+persister+cells+to+ofloxacin+in+exponential+cultures.">Single-cell imaging and characterization of Escherichia coli persister cells to ofloxacin in exponential cultures.</a> Science Advances. 5 (6), (2019).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicrobeJ,+a+tool+for+high+throughput+bacterial+cell+detection+and+quantitative+analysis.">MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis.</a> Nature Microbiology. 1 (7), 16077 (2016).</li><li>Odsbu, I., Skarstad, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+compaction+in+the+early+part+of+the+SOS+response+is+dependent+on+RecN+and+RecA.">DNA compaction in the early part of the SOS response is dependent on RecN and RecA.</a> Microbiology. 160 (5), 872-882 (2014).</li><li>Pham, T. D. M., Ziora, Z. M., Blaskovich, M. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quinolone+antibiotics.">Quinolone antibiotics.</a> MedChemComm. 10 (10), 1719-1739 (2019).</li><li>Drlica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quinolones:+Action+and+resistance+updated.">Quinolones: Action and resistance updated.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 9 (11), 981-998 (2009).</li><li>Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+antibiotics+kill+bacteria:+From+targets+to+networks.">How antibiotics kill bacteria: From targets to networks.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (6), 423-435 (2010).</li><li>Reyes-Lamothe, R., Sherratt, D. J., Leake, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+and+architecture+of+active+DNA+replication+machinery+in+Escherichia+coli.">Stoichiometry and architecture of active DNA replication machinery in Escherichia coli.</a> Science. 328 (5977), 498-501 (2010).</li><li>Lesterlin, C., Ball, G., Schermelleh, L., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecA+bundles+mediate+homology+pairing+between+distant+sisters+during+DNA+break+repair.">RecA bundles mediate homology pairing between distant sisters during DNA break repair.</a> Nature. 506 (7487), 249-253 (2014).</li><li>Alexeeva, S., Gadella, T. W. J., Verheul, J., Verhoeven, G. S., Den Blaauwen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+interactions+of+early+and+late+assembling+division+proteins+in+Escherichia+coli+cells+resolved+by+FRET:+Bacterial+division+studied+by+spectral+FRET.">Direct interactions of early and late assembling division proteins in Escherichia coli cells resolved by FRET: Bacterial division studied by spectral FRET.</a> Molecular Microbiology. 77 (2), 384-398 (2010).</li><li>Miesenb&#246;ck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Yaginuma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+ATP+concentrations+in+a+single+bacterial+cell+population+revealed+by+quantitative+single-cell+imaging.">Diversity in ATP concentrations in a single bacterial cell population revealed by quantitative single-cell imaging.</a> Scientific Reports. 4, 6522 (2014).</li><li>Ermakova, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+genetically+encoded+indicator+for+intracellular+hydrogen+peroxide.">Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide.</a> Nature Communications. 5, 5222 (2014).</li><li>Kapuscinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAPI:+A+DNA-specific+fluorescent+probe.">DAPI: A DNA-specific fluorescent probe.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry. 70 (5), 220-233 (1995).</li></ol>

Yazarlar birbiriyle çelişen çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Bu yazıda sunulan protokol, popülasyonda ve tek hücreli seviyelerde antibiyotik tedavisine yanıt olarak gözlenen kalıcılık fenotipinin analizine olanak sağlamaktadır. Deneyler, kimyasal olarak tanımlanmış bir ortamda (MOPS gliserol% 0.4) yetiştirilen E. coli MG1655 suşu ile gerçekleştirildi. Üstel faz kültürleri üzerinde zaman öldürme testleri ve mikroskopi deneyleri yapıldı. Kalıcı hücreleri ortaya çıkarmak için 5 μg · mL−1 konsantrasyonunda bir florokinolon olan OFX'i kullandık. Burada açıklanan yaklaşımlar, β-laktamlar, aminoglikozitler veya antimikrobiyal bileşikler gibi diğer bakterisidal antibiyotiklere uygulanabilir31. Buna göre, diğer bakteri suşları, ortamlar veya büyüme koşulları kullanılabilir. Farklı floresan füzyonlarının burada tarif edilene benzer bir kurulumda izlenmesi, antibiyotik tedavisinden önce, sırasında ve sonrasında DNA replikasyonu32, DNA onarımı25,33 ve hücre bölünmesi 34 gibi hücresel süreçleri takip etmek için yararlı olabilir. Benzer şekilde, floresan muhabirler, hücre içi pH35, ATP 36 veya ROS37 seviyeleri gibi hücre fizyolojisinin farklı yönlerini araştırmak için kullanılabilir. Floresan füzyonlara alternatif olarak, kimyasal boyalar da uygulanabilir. Örneğin, hupA-mCherry füzyonu, DNA38'i boyayan floresan bir boya olan 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile değiştirilebilir. Bununla birlikte, bu tür floresan boyalarla birleştirilmiş hızlandırılmış mikroskopi yapmaktan kaçınılmalıdır, çünkü bu boyama teknikleri, hızlandırılmış deneyler sırasında hücre döngüsünün dinamiklerini bozabilir. Alternatif olarak, bu tür deneyler, ilgili zaman noktalarında anlık görüntülemenin zaman rotası analizleri ile değiştirilebilir.
Bu tür floresan muhabirler yardımcı olsa da, faz-kontrast görüntülerinin analizi yoluyla çıkarılabilecek bilgi miktarı ihmal edilmemelidir. Burada, büyüme, OFX tedavisi ve iyileşme aşamaları boyunca hücre uzunluğu evrimini izledik. Hücre genişliği, faz-kontrast yoğunluğu ve bakteri hücrelerinin eğrilikleri gibi faz-kontrast görüntülerine dayanan diğer parametreler de MicrobeJ27 gibi yeterli yazılım kullanılarak kolaylıkla çıkarılabilir.
Özetle, burada açıklanan prosedür, değişen ortamlara veya stresörlere hücresel tepkileri izlemek için diğer koşullara ve bakteri türlerine uygulanabilir18,19. Diğer floresan muhabirleri (transkripsiyonel ve translasyonel muhabirler, kimyasal boya) akış sitometrisi / FACS gibi bir popülasyon analizi ile birlikte kullanarak, ilginç sorular çok ölçekli bir çerçevede ele alınabilir.

Bu protokol, tek hücreli ve popülasyon seviyelerinde spesifik antibiyotik tedavisine yanıt olarak bakteriyel kalıcılık fenotipini analiz etmeyi amaçlamaktadır. Kalıcılık, izojenik bir popülasyondaki küçük alt popülasyonların yüksek dozda bakterisidal antibiyotiklere (florokinolonlar, aminoglikozitler, β-laktamlar, vb.) dayanma kapasitesini tanımlar; sözde persister hücrelerin minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC), popülasyonun büyük bir kısmınınkiyle aynıdır. Bifazik öldürme dinamikleri, bir antibiyotik varlığında zaman içinde bakteriyel sağkalımı ölçerken, geçici olarak ilaca toleranslı hücrelerin varlığını, kalıcı olmayan hücrelerin başlangıçta hızlı bir şekilde yok edilmesini, ardından kalıcı hücrelerin çok daha yavaş bir öldürme oranını ortaya koymaktadır. Antibiyotiklerin uzaklaştırılması üzerine, bu hücreler aynı antibiyotik ile tedavi edildiğinde benzer öldürme dinamikleri gösteren genetik olarak özdeş bir popülasyona yol açar 1,2. Kalıcılığın aksine, antibiyotik direnci popülasyon düzeyinde tanımlanır ve genellikle de novo mutasyonların veya direnç kazandıran plazmid3'ün yatay gen transferinin bir sonucudur. Dirençten sorumlu mutasyonlar çoğunlukla ilacın hedefinde veya ilaç efflux pompalarının promotor bölgelerinde bulunurken, genom çapında ve hedeflenen mutant analiz yaklaşımları ile tanımlanan kalıcılık frekansını değiştiren genlerin çok sayıda ve çeşitli olduğu kanıtlanmıştır 2,3,4,5,6,7,8 . Bu nedenle, bakteri hücrelerinin 9,10,11 numaralı çoklu yollardan persister duruma girmesi muhtemeldir ve bu persister hücrelerin fizyolojisini karakterize etmek için kalıcılık fenomenini tek hücre düzeyinde araştırmak için yaklaşımlara ihtiyaç vardır.
Floresan mikroskobu ile kombinasyon halinde kullanılan mikroakışkan aletlerin son zamanlardaki gelişimi, kalıcılık fenotipinin karakterizasyonunun yolunu açmış ve kromozom replikasyonu12, DNA onarımı13 ve hücre bölünmesi14 gibi anahtar hücresel süreçlerin kalıcı hücre oluşumundaki rolünü vurgulamıştır. Bu yazıda, yüksek dozda ofloksasin ile tedavi edilen katlanarak büyüyen Escherichia coli kültürlerinde üretilen kalıcı hücreleri karakterize etmek için klasik mikrobiyoloji tahlillerini tek hücreli canlı görüntüleme ile birleştiren entegre bir yaklaşım açıklanmaktadır. Burada açıklanan protokol, Bacillus subtilis15 gibi diğer bakteri türlerinde veya koşullarda (örneğin, β-laktam tedavisini takiben antibiyotik kalıcılığı 16) antibiyotik kalıcılığı fenomenini incelemek için uygulanabilir ve fenotipik heterojenliği içeren birçok fenomeni araştırmak için kolayca değiştirilebilir17,18,19 . Ayrıca, bu makalede açıklanan kurulum, tek hücreli düzeyde pH20 veya ATP21'in hücre içi seviyeleri gibi ilgilenilen farklı hücresel parametreleri araştırmak için diğer floresan muhabirlerle birleştirilebilir ve bu da antibiyotik kalıcılığı fenomeni hakkında potansiyel olarak yeni bilgiler üretebilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Axio Observer</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2.2H2O&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02382.0250</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX Microfluidic System&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CAX2-S0000&#160;</td>
			<td>Microfluidic system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX2 FG</td>
			<td>Merck</td>
			<td>ONIX2 1.0.1&#160;</td>
			<td>Microfluidic software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX2 Manifold Basic&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CAX2-MBC20</td>
			<td>Manifold system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2.6H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02539.0100</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4.5H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02790.0250</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td>Carbon source for MOPS glucose 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+)</td>
			<td></td>
			<td>BE10</td>
			<td>wt reference strain, lab strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+) hupA-mCherry::FRT-kan-FRT</td>
			<td></td>
			<td>BE16</td>
			<td>HU-mCherry fusion integrated via P1 transduction at the native locus, lab strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4.7H2O&#160;</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>24244.232</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://fiji.sc/&#160;</td>
			<td>Image software; Schindelin et al. if used in publication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>56815</td>
			<td>Carbon source for MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR&#174; multiwell culture plate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M8812-100EA</td>
			<td>24-well clear flat bottom 2ml volume culture plate for automated plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768-1KG</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu ORCA Flash 4.0 digital camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C13440-20CU</td>
			<td>Digital Image Acqusition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05099.1000</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05029.1000</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2SO4&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05153.0500</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Broth agar medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>22700041</td>
			<td>Growth medium for plating assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Broth medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12780029</td>
			<td>Growth medium for MIC determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2.6H2O&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05832.1000</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7487-88-9</td>
			<td>Dilution solution for bacterial survival assay used at 10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicrobeJ&#160;</td>
			<td>Imagej/Fiji plugin</td>
			<td>https://www.microbej.com/</td>
			<td>Microscopy image analysis plugin. Ducret et al.for in publication; Detection settings: For bacteria : Area (&#956;m2): 0,1-max; Length (&#956;m): 0,5-max; Width (&#956;m): 0,6-max; Range (&#956;m): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Plates CellASIC ONIX</td>
			<td>Merck</td>
			<td>B04A-03-5PK&#160;</td>
			<td>Plate for microfluidic system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2.4H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05927.0100</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, Free Acid ULTROL&#174; Grade</td>
			<td>Merck</td>
			<td>475898-500GM</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>SIgma-Aldrich</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)6Mo7O24.4H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01180.0250</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01145.0500</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ofloxacin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>82419-36-1</td>
			<td>Fluoroquinolone antibiotic used to treat the bacterial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4, 1x</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Dilution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENESYS 10S UV-Visible Spectrophotometer</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>&#160;840-208200</td>
			<td>UV-Visible Spectrophotometer, Single/Six Cell Holder with PrinterMeasurement of optical density OD600nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SoftMax Pro</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Microplate reader software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-[Tris(hydroxym&#233;thyl)-m&#233;thyl]-glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08602.0250</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss&#174; immersion Oil 518F</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Immersion oil to increase resolution of microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen3.2 Pro</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscopic image acquisition and processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4.7H2O&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08883.0500</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

population and single-cell analysis of antibiotic persistence in escherichia coli

Antibiyotik kalıcılığı, küçük bakteri alt popülasyonlarının yüksek dozda bakterisidal antibiyotikleri geçici olarak tolere etme kapasitesini ifade eder. Bakterisidal antibiyotik tedavisi üzerine, bakteri popülasyonunun büyük kısmı hızla öldürülür. Öldürmenin bu ilk hızlı aşamasını, kalıcı hücreler canlı kaldığı için öldürme oranında önemli bir azalma izler. Klasik olarak, kalıcılık popülasyon düzeyinde yüksek dozda antibiyotiklerle yapılan zaman / öldürme testleri ve tanımlanmış maruz kalma süreleri ile belirlenir. Bu yöntem, persister hücrelerin seviyesi ve öldürücü kinetik hakkında bilgi sağlarken, kalıcılık fenomeninin altında yatan içsel hücreden hücreye heterojenliği yansıtmakta başarısız olur. Burada açıklanan protokol, klasik zaman / öldürme tahlillerini gerçek zamanlı floresan mikroskobu kullanarak tek hücreli analizle birleştirir. Uygun floresan muhabirleri kullanarak, canlı hücrelerin mikroskopi görüntülemesi, antibiyotiğin kromozom replikasyonu ve ayrışması, hücre uzaması ve hücre bölünmesi gibi hücresel süreçler üzerindeki etkileri hakkında bilgi sağlayabilir. Popülasyon ve tek hücreli analizin birleştirilmesi, kalıcılık fenotipinin moleküler ve hücresel karakterizasyonuna izin verir.

Watch this Scientific Journal Video about Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli at JoVE.com

Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli

Antibiyotik kalıcılığı, hassas bir izojenik popülasyondaki küçük alt popülasyonların yüksek dozda bakterisidal antibiyotikleri geçici olarak tolere etme yeteneğini tanımlar. Bu protokol, Escherichia coli'yi ölümcül ofloksasin dozlarına maruz bıraktıktan sonra moleküler ve hücresel seviyelerde antibiyotik kalıcılık fenotipini karakterize etmek için yaklaşımları birleştirmektedir.

Escherichia coli'de Antibiyotik Kalıcılığının Popülasyon ve Tek Hücre Analizi

Antibiotic persistence refers to the capacity of small bacterial subpopulations to transiently tolerate high doses of bactericidal antibiotics. Upon ...

Burada açıklanan protokol, yüksek ofloksasin tedavisinden sonra Escherichia coli persister hücrelerini karakterize etmek için klasik mikrobiyoloji tahlillerini tek hücreli canlı görüntüleme ile birleştiren bütünleştirici bir yöntem sunmaktadır. Bu tekniğin temel avantajı, kalıcılık fenomenini popülasyonda ve tek hücre düzeyinde analiz etmektir. Popülasyon ve tek hücreli analizin birleştirilmesi, kalıcılık fenotipinin moleküler ve hücresel karakterizasyonuna izin verir.Başlamak için, ilgilenilen bakteri suşunu bir LB agar plakası üzerindeki donmuş bir gliserol stoğundan çizin ve tek koloniler elde etmek için 15 ila 19 saatlik bir süre boyunca gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İzole edilmiş bir koloniyi,% 0.4 glikoz ile desteklenmiş beş mililitre MOPS büyüme ortamı içeren bir cam tüpte aşılayın ve gerekirse ortama seçici bir antibiyotik ekleyin. Tüpü gece boyunca 37 santigrat derece ve 180 rpm'de çalkalayan bir inkübatöre yerleştirin.Ertesi gün, hücreleri pelet etmek için bir mililitre kültürü 2.300 g'da üç dakika boyunca santrifüj edin ve peleti aynı miktarda PBS ile hafifçe askıya alın. OD'yi 600 nanometrede ölçün ve iki mililitrelik son hacimde 0.01'lik bir başlangıç OD600 için gereken hacmi hesaplayın. Daha sonra, iki mililitre MOPS gliserol% 0.4 orta kısmı şeffaf tabanlı, 24 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna ekleyin ve hesaplanan gece kültür hacmi ile aşılayın.OD600'ü 24 saat boyunca izlemek için 24 delikli plakayı otomatik bir mikro plaka okuyucuya yerleştirin. Mikroplaka okuyucuyu, OD600'ü her 15 dakikada bir 37 santigrat derece sıcaklıkta ve 140 rpm'lik yüksek yörüngesel dönüşle ölçecek şekilde ayarlayın. 100 mililitre LB agar'ı eritin ve katılaşmayı önlemek için şişeyi 55 santigrat derecede stoklayın.Altı küçük cam şişe hazırlayın ve steril bir pipet kullanarak her şişeye beş mililitre sıvı LB agar ortamını pipetin. Mililitre ofloksasin stok çözeltisi başına beş miligramdan 10 mikrolitre alın ve 90 mikrolitre ultra saf suda seyreltin. Mililitre ofloksasin başına sıfır ila 0.1 mikrogram nihai konsantrasyon elde etmek için LB agar ortamı içeren altı cam şişenin her birine seyreltilmiş ofloksasinin artan hacimlerini ekleyin.Şişeleri birkaç kez döndürerek çözeltiyi karıştırın ve antibiyotik eklenmiş LB agar ortamını altı delikli bir kültür plakasına dökün. Agarın katılaşana kadar soğumasını bekleyin ve kullanmadan önce plakayı kurutun. PBS ile bir gecelik bakteri kültürünü, mililitre başına yedinci CFU'nun bir katı 10 ila yedinci CFU'luk bir nihai hücre yoğunluğuna seyreltin.Kurutulmuş altı kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna iki mikrolitre seyreltilmiş kültür yerleştirin. Plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirmeden önce lekelerin kurumasını bekleyin. Ertesi gün, hangi ofloksasin konsantrasyonunda bakteri kolonilerinin büyümesinin engellendiğini kontrol edin.Hazırlanan LB agarının yaklaşık 25 mililitresini bir Petri kabına dökün. Ardından, her katılaşmış ve kurutulmuş plakaya beş ila sekiz steril cam boncuk ekleyin. Plakaları ters çevirin ve etiketleyin.Daha sonra, 900 mikrolitre 0.01-molar magnezyum sülfat çözeltisi içeren on kat seri seyreltme cam tüpleri hazırlayın. Bir cam tüpte, bir gecelik kültürü taze ve sıcaklık ayarlı ortamda yaklaşık 0.001'lik nihai bir OD600'e seyreltin ve kültürün bir inkübatörde gece boyunca büyümesine izin verin. Ertesi gün, OD600 0.3'e ulaştığında, spot tahlil verilerine göre seyreltme için 100 mikrolitre kültür aktarın.Bakteri kültürünün on kat seri seyreltmesini gerçekleştirin. Daha sonra hazırlanan LB agar plakaları üzerine seyreltilmiş kültürün 100 mikrolitresini plakalayın. İstenilen ofloksasin konsantrasyonunu bakteri kültürüne ekleyin ve sallarken 37 santigrat derecede inkübe etmeye devam edin.İlgili zaman noktalarında, kültürün 100 mikrolitresini geri çekin ve kültürü spot tahlil verilerine göre seyreltin. LB agar plakaları üzerinde seyreltilmiş kültürün 100 mikrolitresini plakalayın. Ertesi gün, gece boyunca inkübe edilen plakaların kolonilerini, kolonilerin tespit edilebileceği en yüksek iki seyreltmede sayın.T0'da mililitre başına CFU'daki her zaman noktasında mililitre başına CFU'yu normalleştirerek hayatta kalma oranını hesaplayın ve günlük tabanı 10 normalleştirilmiş değerini zamanın bir fonksiyonu olarak çizin. Koruma çözeltisini mikroakışkan plakanın her bir kuyucuğundan çıkarın ve taze kültür ortamı ile değiştirin. Mühürle düğmesine tıklayarak veya mikroakışkan yazılım aracılığıyla mikroakışkan plakayı manifold sistemi ile kapatın.Ardından, mikroakışkan yazılım arayüzünde, Run Liquid Astarlama Sequence'a tıklayarak ilk astarlama sırasını gerçekleştirin. Mikroskopi görüntülemeye başlamadan önce plakayı termostatik olarak kontrol edilen bir mikroskop kabininde 37 santigrat derecede en az iki saat boyunca inkübe edin. Ardından, denemeye başlamadan önce ikinci bir Sıvı Hazırlama Sırası Çalıştır başlatın.Mikroakışkan yazılım arayüzündeki Unseal Plate (Mühürü Kaldır Plakası) seçeneğine tıklayarak mikroakışkan plakayı kapatın. Kuyucuklardaki ortamı 200 mikrolitre taze ortam, taze ortam içeren antibiyotik ve taze ortamda 0.01 OD seyreltilmiş kültür örneği ile değiştirin. Mikroakışkan plakayı daha önce gösterildiği gibi kapattıktan sonra, plakayı mikroskop dolabının içindeki mikroskop hedefine yerleştirin.Mikroakışkan yazılımda, hücrelerin mikroakışkan plakaya yüklenmesine izin vermek için Hücre Yükleme Sırasını Çalıştır'a tıklayın. İletilen ışık modunu kullanarak en uygun odağı ayarlayın ve alan başına 300 hücreye kadar uygun bir hücre sayısının gözlemlenebileceği birkaç ilgi alanı seçin. Mikroakışkan yazılımda, taze ortamın enjeksiyonunu altı saat boyunca 6.9 kilopaskalda bir ve iki kuyuya programlamak için Özel Bir Dizi Çalıştır'ı, ardından 6.9 kilopaskalda antibiyotik içeren ortamı veya altı saatte üç kuyuya ve son olarak 6.9 kilopaskaldaki taze ortamı 24 saat boyunca dört ve beş kuyuya kadar düzenleyin.İletilen ışığı ve floresan muhabir için uyarma ışık kaynağını kullanarak her 15 dakikada bir kare ile hızlandırılmış modda mikroskopi görüntüleme gerçekleştirin ve mikroakışkan programı başlatın. Bilgisayarda ImageJ veya Fiji yazılımını açın ve hiperstack hızlandırılmış mikroskopi görüntülerini Fiji yükleme çubuğuna sürükleyin. Hiperstack'in farklı kanallarını birleştirmek için Image'ı, ardından Color'ı ve ardından Make Composite'i kullanın.Kanallar istenen renge karşılık gelmiyorsa Görüntü, Renk ve ardından Kanalları Düzenle'yi kullanın. MicrobeJ eklentisini açın ve manuel düzenleme arayüzünü kullanarak bakteri hücrelerini tespit edin. Otomatik olarak algılanan hücreleri silin ve ilgilenilen kalıcı hücreleri kare kare el ile ana hatlarıyla belirtin.Algılamadan sonra, bir ResultJ tablosu oluşturmak için MicrobeJ manuel düzenleme arayüzündeki Sonuç simgesini kullanın. Tek hücreli analizin ilgilenilen farklı parametrelerine ilişkin içgörüler elde etmek için ResultJ tablosunu kullanın ve ResultJ dosyasını kaydedin. Her iki suş için ofloksasinin MIC'sinin mililitre başına 0.06 mikrogram olduğu belirlenmiştir, bu da hupA-mCherry füzyonunun izojenik vahşi tip suşa kıyasla ofloksasinin duyarlılığını etkilemediğini göstermektedir.Nokta testi, zaman içinde uygun seyreltmelerde izole klonları gösterdi, örneğin, sıfır zamanında negatif beşinci seyreltme ile 10 arasında. Zaman öldürme analizinde, ilk eğimin kalıcı olmayan popülasyonun hızlı bir şekilde öldürülmesini yansıttığı tipik bir bifazik eğri gözlenmiştir. İkinci aşama, ilaca toleranslı kalıcı hücrelerin varlığını ortaya çıkaran daha yavaş bir öldürme oranı gösterdi.Özellikle, zaman öldürme eğrisi, hupA-mCherry füzyon proteininin zaman öldürücü kinetiği etkilemediğini göstermektedir. Mikroakışkan deneyde, ilk büyüme aşaması, ofloksasin tedavisinden önce hücrelerin canlı olduğunu ve bölündüğünü gösterir. Bu ilk büyüme aşamasından sonra, antibiyotik hücrelere ulaşır ulaşmaz hücre bölünmesi engellendi.Ofloksasin tedavisinden sonra, taze ortam ile perfüzyonda, hücrelerin büyük çoğunluğu büyümeye devam edememiştir. Buna karşılık, küçük bir alt popülasyon, kalıcı hücreler olarak tanımlanan filamentli hücreleri uzatabilir ve üretebilir. Bölünen kalıcı filament, çoğu tedavi edilmemiş hücrelere benzer şekilde büyümeye ve bölünmeye başlayan çoklu yavru hücreler üretti.Hücre uzunluğundaki artış, replikasyonun yeniden başlatılmasını ve nükleoid bolluğundaki artışı yansıtan toplam mCherry floresan yoğunluğundaki bir artışla korelasyon gösterdi. Kalıcılığı incelemek için hücre içi bir muhabir içeren bir suş kullanıldığında, muhabirin varlığının vahşi tip bir suşa kıyasla büyümeye, MIC'ye ve öldürmeye müdahale etmediği emperyaldir. Burada açıklanan prosedür, değişen ortamlara veya streslere hücresel tepkileri izlemek için diğer koşullara ve bakteri türlerine uygulanabilir.Aynı kurulumda diğer floresan muhabirleri kullanarak, kalıcı hücrelerin fizyolojisine yeni bakış açıları araştırılabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Etkinlik Ölçüm Bir Testi Escherichia coli Lizin Decarboxyase Đndüklenebilir

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Mantar Endoglucanase Faaliyet Yüksek Verimli Tarama Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Bakteriyel Fonksiyonel Ağlar ve tanımında Haritalama<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Sentetik Genetik Diziler kullanarak

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Elektrokompetan Hazırlanması için hızlı Protokolü<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Ve<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Live Algılama<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: PMA-qPCR H7 Hücreler

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Peptidler ve proteinler ile rekombinant Elastin gibi Polipeptitlerin ve Fusions olmayan kromatografik saflaştırma<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein birlikte-ifade edilme yönlü Faydalar<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

Transkript bireysel Escherichia coli hücrelerdeki tek molekül Floresans In Situ hibridizasyon deneyleri için etiketleme yöntemi

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...