Name: isolation of quiescent stem cell populations from individual skeletal muscles
Uploaded: 2022-12-09T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Quiescent Stem Cell Populations from Individual Skeletal Muscles at JoVE.com

Le tri cellulaire a été effectué au centre FACS de l’Université d’Aarhus (Danemark). Les figures ont été créées à l’aide de Biorender.com. Nous remercions le Dr J. Farup d’avoir partagé l’anticorps anti-PDGFRa du lapin. Ce travail a été soutenu par une subvention de démarrage AUFF à E.P. et des subventions Start Package de NovoNordiskFonden à E.P. (0071113) et à A.D.M. (0071116).

Le présent protocole a été exécuté conformément aux directives de soins aux animaux de l’Université d’Aarhus et aux réglementations locales en matière d’éthique.
NOTE: Assurez-vous de respecter les règlements du comité d’éthique local pour l’expérimentation animale et la manipulation d’échantillons post-mortem de rongeurs. Les souris sont une source potentielle d’allergènes; Si disponible, activez la ventilation par aspiration et placez-la sur l’espace de travai...

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	<li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers.">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).</li><li>Relaix, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+skeletal+muscle+stem+cells.">Perspectives on skeletal muscle stem cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).</li><li>Cheung, T. H., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+stem+cell+quiescence.">Molecular regulation of stem cell quiescence.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 14 (6), 329-340 (2013).</li><li>Kann, A. P., Hung, M., Krauss, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+contact+and+signaling+in+the+muscle+stem+cell+niche.">Cell-cell contact and signaling in the muscle stem cell niche.</a> Current Opinion in Cell Biology. 73, 78-83 (2021).</li><li>Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repairing+skeletal+muscle:+regenerative+potential+of+skeletal+muscle+stem+cells.">Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).</li><li>Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells,+connective+tissue+fibroblasts+and+their+interactions+are+crucial+for+muscle+regeneration.">Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).</li><li>Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+absolute+requirement+for+Pax7-positive+satellite+cells+in+acute+injury-induced+skeletal+muscle+regeneration.">An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).</li><li>Sambasivan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax7-expressing+satellite+cells+are+indispensable+for+adult+skeletal+muscle+regeneration.">Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).</li><li>Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+and+expansion+of+single+transplanted+muscle+stem+cells.">Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells.</a> Nature. 456 (7221), 502-506 (2008).</li><li>Joe, A. W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+injury+activates+resident+fibro/adipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis.">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).</li><li>Wosczyna, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+are+required+for+regeneration+and+homeostatic+maintenance+of+skeletal+muscle.">Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle.</a> Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).</li><li>Uezumi, A., Fukada, S. -. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+progenitors+distinct+from+satellite+cells+contribute+to+ectopic+fat+cell+formation+in+skeletal+muscle.">Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).</li><li>Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax7+Is+Required+for+the+Specification+of+Myogenic+Satellite+Cells.">Pax7 Is Required for the Specification of Myogenic Satellite Cells.</a> Cell. 102 (6), 777-786 (2000).</li><li>Shea, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sprouty1+regulates+reversible+quiescence+of+a+self-renewing+adult+muscle+stem+cell+pool+during+regeneration.">Sprouty1 regulates reversible quiescence of a self-renewing adult muscle stem cell pool during regeneration.</a> Cell Stem Cell. 6 (2), 117-129 (2010).</li><li>Fukada, S. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signature+of+quiescent+satellite+cells+in+adult+skeletal+muscle.">Molecular signature of quiescent satellite cells in adult skeletal muscle.</a> Stem Cells. 25 (10), 2448-2459 (2007).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mode+of+hydrolysis+of+collagen-like+peptides+by+class+I+and+class+II+Clostridium+histolyticum+collagenases:+evidence+for+both+endopeptidase+and+tripeptidylcarboxypeptidase+activities.">Mode of hydrolysis of collagen-like peptides by class I and class II Clostridium histolyticum collagenases: evidence for both endopeptidase and tripeptidylcarboxypeptidase activities.</a> Biochemistry. 24 (23), 6527-6533 (1985).</li><li>Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispase,+a+neutral+protease+from+Bacillus+polymyxa,+is+a+powerful+fibronectinase+and+type+IV+collagenase.">Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).</li><li>Baghdadi, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+signalling+by+Notch-Collagen+V-CALCR+retains+muscle+stem+cells+in+their+niche.">Reciprocal signalling by Notch-Collagen V-CALCR retains muscle stem cells in their niche.</a> Nature. 557 (7707), 714-718 (2018).</li><li>van Velthoven, C. T. J., de Morree, A., Egner, I. M., Brett, J. O., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+quiescent+muscle+stem+cells+in+vivo.">Transcriptional profiling of quiescent muscle stem cells in vivo.</a> Cell Reports. 21 (7), 1994-2004 (2017).</li><li>Machado, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+fixation+redefines+quiescence+and+early+activation+of+skeletal+muscle+stem+cells.">In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells.</a> Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).</li><li>Machado, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+damage+induces+a+conserved+stress+response+that+initiates+quiescent+muscle+stem+cell+activation.">Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation.</a> Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).</li><li>vanden Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations.">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li><li>Moore, D. K., Motaung, B., du Plessis, N., Shabangu, A. N., Loxton, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SU-IRG+consortium+isolation+of+B-cells+using+Miltenyi+MACS+bead+isolation+kits.">SU-IRG consortium isolation of B-cells using Miltenyi MACS bead isolation kits.</a> PloS One. 14 (3), 0213832 (2019).</li><li>Liou, Y. -. R., Wang, Y. -. H., Lee, C. -. Y., Li, P. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buoyancy-activated+cell+sorting+using+targeted+biotinylated+albumin+microbubbles.">Buoyancy-activated cell sorting using targeted biotinylated albumin microbubbles.</a> PloS One. 10 (5), 0125036 (2015).</li><li>Brett, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+rejuvenates+quiescent+skeletal+muscle+stem+cells+in+old+mice+through+restoration+of+Cyclin+D1.">Exercise rejuvenates quiescent skeletal muscle stem cells in old mice through restoration of Cyclin D1.</a> Nature Metabolism. 2 (4), 307-317 (2020).</li><li>Tabula Muris Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+transcriptomic+atlas+characterizes+ageing+tissues+in+the+mouse.">A single-cell transcriptomic atlas characterizes ageing tissues in the mouse.</a> Nature. 583 (7817), 590-595 (2020).</li><li>de Morr&#233;e, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staufen1+inhibits+MyoD+translation+to+actively+maintain+muscle+stem+cell+quiescence.">Staufen1 inhibits MyoD translation to actively maintain muscle stem cell quiescence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), 8996-9005 (2017).</li></ol>

Plusieurs étapes sont essentielles dans l’exécution de ce protocole pour obtenir de bons rendements. Les muscles individuels ont un petit volume par rapport à la quantité de muscle utilisée dans les protocoles d’isolement en vrac. Il en résulte un risque de dessèchement musculaire pendant la dissection, ce qui réduit le rendement. Pour éviter cela, il est important d’ajouter du milieu aux muscles immédiatement après la dissection. De plus, si la dissection prend plus de temps, la peau peut être retirée...

Le muscle squelettique a une grande capacité de régénération en raison de la présence de cellules souches musculaires (MuSC). Les MuSC sont situés sur les myofibres, sous la lame basale, et résident dans un état de repos de sortieprolongée et réversible du cycle cellulaire 1,2,3,4. En cas de blessure, les MuSCs s’activent et entrent dans le cycle cellulaire pour donner naissance à des progéniteurs amplificateurs qui peuvent se différencier et fusionner pour former de nouvelles myofibres 2,5. Des travaux antérieurs ont montré que les MuSCs sont absolument essentiels à la régénération musculaire 6,7,8. De plus, un seul MuSC peut se greffer et générer à la fois de nouvelles cellules souches et de nouvelles myofibres9. Le muscle squelettique abrite également une population de cellules stromales mésenchymateuses appelées progéniteurs fibro-adipogènes (FAP), qui jouent un rôle crucial dans le soutien de la fonction MuSC pendant la régénération musculaire 6,10,11,12.
En raison de leur potentiel à coordonner la régénération musculaire, il y a eu un énorme intérêt pour comprendre comment fonctionnent les MuSC et les FAP. Les MuSC quiescents sont marqués par l’expression des facteurs de transcription Pax7 et Sprouty1, et du récepteur de la calcitonine, une protéine de surface cellulaire, tandis que les FAP quiescents sont marqués par le récepteur alpha du facteur de croissance dérivé des plaquettes de surface cellulaire (PDGFRa)10,12,13,14,15 . Des études antérieures ont montré que les MuSC et les FAP pouvaient être purifiés des muscles squelettiques à l’aide de marqueurs de surface cellulaire et de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)9,15,16,17,18,19,20,21. Bien que ces protocoles aient considérablement amélioré la capacité d’étudier les MuSC et les FAP, un inconvénient est que la plupart de ces protocoles nécessitent l’isolement des MuSC à partir d’un pool de tissus musculaires différents. Des travaux récents de notre part et d’autres ont révélé des différences dans le phénotype cellulaire et les niveaux d’expression génique entre les MuSC isolés de différents tissus22,23. Les MuSC du diaphragme, des triceps et des graciles montrent une activation plus rapide que les MuSC des muscles inférieurs des membres postérieurs22, tandis que les MuSC du muscle extraoculaire montrent une différenciation plus rapide que les MuSC du diaphragme et des muscles inférieurs des membres postérieurs23.
Ce protocole décrit l’isolement des MuSC et des FAP des muscles squelettiques individuels (Figure 1). Cela comprend la dissection du diaphragme, triceps, gracilis, tibial antérieur (TA), soléaire, extenseur digitorum longus (EDL), gastrocnémien (GA) et masséters. Les muscles disséqués sont ensuite dissociés par digestion enzymatique à l’aide de collagénase II (une protéase qui cible spécifiquement la séquence aminée Pro-X-Gly-Pro dans le collagène, permettant la dégradation du tissu conjonctif et de la dissociation tissulaire24) et de la dispase (une protéase qui clive la fibronectine et le collagène IV, permettant une dissociation cellulaire supplémentaire25). Les MuSC et les FAP sont isolés des suspensions unicellulaires par FACS. À titre d’exemples de tests en aval pour l’analyse cellulaire, l’activation des cellules souches est déterminée par dosage de l’incorporation de la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU), tandis que la pureté cellulaire est déterminée par coloration par immunofluorescence pour les marqueurs spécifiques du type cellulaire Pax7 et PDGFRa.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube( PCR performance tested, PP, 30,000 xg, DNA/DNase-/RNase-free, Low DNA binding, Sterile )</td>
			
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>72.706.700</td>			
<td>1.5 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tube (PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, IATA, DNA/DNase-/RNase-free, Non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile)</td>
			
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>62.554.502</td>			
<td>15 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polystyrene round-bottom tube</td>
			
			<td>Falcon, Fisher Scientific&#160;</td>
<td>352054</td>			
<td>FACS tube without strainer cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polystyrene Round-bottom tube with cell-strainer cap</td>
			
			<td>Falcon, Fisher Scientific&#160;&#160;</td>
<td>352235</td>			
<td>FACS tube with strainer cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL tube (PP, non sterile autoclavable)</td>
			
			<td>VWR collection</td>
<td>525.0946</td>			
<td>5 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube( PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, ADR, DNA/DNase-/RNase-free, non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile)</td>
			
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>62.547.254</td>			
<td>50 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
<td>Lot: 2387458 (Cat # A31572)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 donkey-anti mouse IgG (H+L)</td>
			
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
<td>Lot: 2420713 (Cat#A31571)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARIA 3</td>
			
			<td>BD</td>
<td></td>			
<td>FACS, Core facility Aarhus University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810</td>
			
			<td>eppendorf</td>
<td>EP022628188</td>			
<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye</td>
			
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
<td>Lot: 2387287 (Cat# C10337)</td>			
<td>Cell Proliferation Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from calf-skin&#160;</td>
			
			<td>Bioreagent, Sigma Aldrich&#160;</td>
<td>Source: SLCK6209 (Cat# C8919)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			
			<td>Worthington, Fisher Scientific&#160;</td>
<td>Lot: 40H20248 (cat# L5004177 )</td>			
<td>Collagenase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			
			<td>Gibco, Fisher Scientific&#160;</td>
<td>Lot: 2309415 (cat# 17105-041 )</td>			
<td>Dispase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum (non-sterile)</td>
			
			<td>Sigma Aldrich, Merck</td>
<td>Lot: 2826455 (Cat# S30-100mL)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont nr. 5, 110 mm</td>
			
			<td>Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>1606.327</td>			
<td>Straight forceps with fine tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont nr. 7, 115 mm</td>
			
			<td>Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>1606.335</td>			
<td>Curved forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-10 Nutrient mixture (Ham) (1x), +L-glutamine</td>
			
			<td>Gibco, Fisher Scientific&#160;</td>
<td>Lot. 2453614 (cat# 31550-023)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD31</td>
			
			<td>BioLegend, NordicBioSite</td>
<td>MEC13.3 (Cat # 102506)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Anti-mouse CD45</td>
			
			<td>BioLegend, NordicBioSite</td>
<td>30-F11 (Cat# 103108)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid (100%)</td>
			
			<td>EMSURE, Merck&#160;&#160;</td>
<td>K44104563 9Cat # 1000631000)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head over head mini-tube rotator&#160;</td>
			
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
<td>15534080 (Model no. 88861052)</td>			
<td>Head over head mini-tube rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			
			<td>Gibco, Fisher Scientific&#160;</td>
<td>Lot. 2482639 (cat# 10368902 )</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp SWB 15</td>
			
			<td>FisherBrand, Fisher Scientific</td>
<td>15325887</td>			
<td>Shaking water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS2 mini-shaker&#160;</td>
			
			<td>IKA&#160;</td>
<td></td>			
<td>Vortex unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 20 G (0.9 mm x 25 mm)</td>
			
			<td>BD microlance, Fisher Scientific&#160;</td>
<td>304827</td>			
<td>20G needle&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral formalin buffer 10%</td>
			
			<td>CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>Lot: 03822014 (Cat # HOU/1000.1002)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-pyrogenic cell strainer (40 &#181;M)</td>
			
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>83.3945.040</td>			
<td>Cell strainer&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1)</td>
			
			<td>BioLegend, NordicBioSite</td>
<td>D7 (Cat# 108120)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax7 primary antibody</td>
			
			<td>DSHB</td>
<td>Lot: 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x powder concentrate</td>
			
			<td>Fisher BioReagents, Fisher Scientific</td>
<td>BP665-1</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-mouse CD106 (VCAM1)</td>
			
			<td>BioLegend, NordicBioSite</td>
<td>429 (MVCAM.A) (Cat # 105720)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep</td>
			
			<td>Gibco, Fisher Scientific&#160;</td>
<td>Lot. 163589 (cat# 11548876 )</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips p10</td>
			
			<td>Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific</td>
<td>2140-05</td>			
<td>Low retention, pre-sterilized, filter tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips p1000</td>
			
			<td>Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific</td>
<td>2279-05</td>			
<td>Low retention, pre-sterilized, filter tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips p20</td>
			
			<td>Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific</td>
<td>2149P-05</td>			
<td>Low retention, pre-sterilized, filter tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips p200</td>
			
			<td>Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific</td>
<td>2069-05</td>			
<td>Low retention, pre-sterilized, filter tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protective underpad</td>
			
			<td>Abena&#160;</td>
<td>ACTC-7712</td>			
<td>&#160;60 x 40cm, 8 layers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin, pipet-lite XLS</td>
			
			<td>Mettler Toledo, Thermo Scientific&#160;</td>
<td>2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05</td>			
<td>Pipettes (P10, P20, P200, P1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant anti-PDGFR-alpha</td>
			
			<td>RabMAb, abcam</td>
<td>AB134123</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel (shaft no. 3)</td>
			
			<td>Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>1902.502</td>			
<td>Scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade no. 11</td>
			
			<td>Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>1902.0911</td>			
<td>Scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanlaf mars</td>
			
			<td>Labogene</td>
<td>class 2 cabinet: Mars</td>			
<td>Flow bench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanR</td>
			
			<td>Olympus</td>
<td></td>			
<td>Microscope, Core facility Aarhus University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			
			<td>FST</td>
<td>14568-09</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series 8000 DH</td>
			
			<td>Thermo Scientific</td>
<td>3540-MAR</td>			
<td>Incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 10 mL</td>
			
			<td>VWR</td>
<td>612-3700</td>			
<td>Sterile, non-pyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 5 mL</td>
			
			<td>VWR, Avantor delivered by VWR</td>
<td>612-3702</td>			
<td>Sterile, non-pyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 5 mL, Luer tip (6%), sterile&#160;</td>
			
			<td>BD Emerald, Fisher Scientific</td>
<td>307731</td>			
<td>Syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 100, standard</td>
			
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>83.3902</td>			
<td>Petri dish&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture (TC)-treated surface, black polystyrene, flat bottom, sterile, lid, pack of 20</td>
			
			<td>Corning, Sigma Aldrich</td>
<td>3764</td>			
<td>96-well Half bottom plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			
			<td>Sigma Aldrich, Merck</td>
<td>Source: SLCJ6163 (Cat # T8787)</td>			
<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of quiescent stem cell populations from individual skeletal muscles

Le muscle squelettique abrite des populations distinctes de cellules souches adultes qui contribuent à l’homéostasie et à la réparation des tissus. Les cellules souches du muscle squelettique (MuSC) ont la capacité de fabriquer de nouveaux muscles, tandis que les progéniteurs fibro-adipogènes (FAP) contribuent aux tissus de soutien stromaux et ont la capacité de fabriquer des fibroblastes et des adipocytes. Les MuSC et les FAP résident dans un état de sortie prolongée du cycle cellulaire réversible, appelé quiescence. L’état de repos est la clé de leur fonction. Les cellules souches quiescentes sont généralement purifiées à partir de plusieurs tissus musculaires regroupés dans un seul échantillon. Cependant, des études récentes ont révélé des différences distinctes dans les profils moléculaires et la profondeur de quiescence des MuSC isolés de différents muscles. Le présent protocole décrit l’isolement et l’étude des MuSC et des FAP à partir de muscles squelettiques individuels et présente des stratégies pour effectuer une analyse moléculaire de l’activation des cellules souches. Il détaille comment isoler et digérer les muscles de différentes origines développementales, épaisseurs et fonctions, tels que le diaphragme, triceps, gracilis, tibial antérieur (TA), gastrocnémien (GA), soléaire, extenseur digitorum longus (EDL) et les muscles masséters. Les MuSC et les FAP sont purifiés par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) et analysés par coloration par immunofluorescence et test d’incorporation de 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU).

Conformément au protocole d’isolement individuel des muscles squelettiques (Figure 2), les muscles gracilis, TA, EDL, GA, soléus, triceps, masséter et diaphragme ont été isolés chez trois souris mâles suisses consanguines qui avaient été interrompues d’un programme de sélection local (Figure 2). Après dissociation tissulaire et coloration des anticorps, les MuSCs et les FAP des muscles individuels ont été purifiés par FACS (<strong class="xfig"...

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Isolation of Quiescent Stem Cell Populations from Individual Skeletal Muscles

Ce protocole décrit l’isolement des cellules souches musculaires et des progéniteurs fibro-adipogènes des muscles squelettiques individuels chez la souris. Le protocole implique la dissection musculaire unique, l’isolement des cellules souches par tri cellulaire activé par fluorescence, l’évaluation de la pureté par coloration par immunofluorescence et la mesure quantitative de l’entrée en phase S par test d’incorporation de la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine.

Isolement de populations de cellules souches quiescentes à partir de muscles squelettiques individuels

Skeletal muscle harbors distinct populations of adult stem cells that contribute to the homeostasis and repair of the tissue. Skeletal muscle stem cells ...

Ce protocole est important car il permet d’étudier la fonction des cellules souches dans différents muscles squelettiques, approfondissant notre compréhension de la façon dont elles contribuent à l’homéostasie, à la régénération et à la progression de la maladie. En utilisant ce protocole, nous pouvons isoler deux populations de cellules souches vivantes de muscles spécifiques et étudier leur fonctionnement. Pour commencer l’isolement musculaire, vaporisez de l’éthanol sur la souris euthanasiée et placez-la avec l’abdomen tourné vers le haut.À l’aide de ciseaux, faites une incision horizontale de 0,5 centimètre de long dans la peau abdominale. À l’aide des deux mains, tirez la peau pour exposer le torse ainsi que les membres inférieurs jusqu’aux membres postérieurs. Localisez le gracilis ou le muscle interne de la cuisse et, à l’aide d’une paire de forceps incurvés, saisissez-le et soulevez légèrement le muscle.À l’aide de ciseaux, faites une incision de 0,5 centimètre pour découper le muscle gracilis. Répétez la procédure sur l’autre jambe. À l’aide d’un scalpel, coupez le fascia en faisant une incision de 0,5 centimètre le long du côté latéral du tibia.Ensuite, saisissez le fascia à l’aide d’une pince incurvée et retirez-le en tirant, exposant les tendons à l’extrémité distale du membre postérieur. Ensuite, insérez une paire de forceps droits avec des pointes super fines entre le tendon distal du TA et le muscle EDL. Séparez les muscles en faisant glisser la pince vers l’extrémité proximale des muscles.Ramenez la pince à l’extrémité distale et coupez le tendon distal. Saisissez doucement le tendon distal de l’AT avec une pince incurvée et soulevez le muscle vers le haut et au-dessus de son attachement proximal. Pour couper soigneusement le tendon proximal, coupez l’autre extrémité au plus près possible de sa fixation et transférez le TA dans une boîte de Pétri.Ensuite, utilisez les pinces droites avec des pointes super fines pour aller sous le tendon distal de l’EDL et faites glisser les forceps vers l’extrémité proximale du muscle pour séparer les muscles les uns des autres. Ramenez la pince à l’extrémité distale et coupez le tendon distal sans endommager le muscle. En saisissant doucement le tendon distal de l’EDL avec une pince incurvée, soulevez le muscle vers le haut et par-dessus son attachement proximal pour couper soigneusement le tendon proximal le plus près possible de son attache.Coupez l’autre extrémité et transférez le muscle EDL dans une boîte de Pétri. Répétez la procédure pour l’autre membre postérieur. Utilisez une pince droite avec des pointes super fines pour atteindre entre le tendon d’Achille et les os du membre postérieur inférieur.Faites glisser la pince vers l’extrémité proximale du muscle pour séparer le muscle des os. Ramenez la pince à l’extrémité distale et coupez le tendon distal. Tirez le muscle gastrocnémien ou GA vers le haut et au-dessus du péroné.Pour localiser le tendon soléaire proximal. Insérez la pince droite entre les muscles du soléaire et de l’AG et déplacez la pince vers l’extrémité distale des muscles pour séparer le soléaire de l’AG. Maintenant, coupez le tendon soléaire proximal. Saisissez-le avec une pince incurvée et soulevez délicatement le sous pour accéder à son tendon distal.Couper le tendon distal pour isoler le soléaire de l’AG et placer le soléaire dans la boîte de Petri contenant le produit de lavage. Ensuite, coupez le GA et placez-le dans la boîte de Pétri. Pour isoler le muscle triceps, utilisez une pince droite ayant des pointes super fines pour atteindre entre le triceps et l’os de l’humérus et faites glisser la pince vers l’extrémité proximale du muscle pour séparer le muscle de l’os.Ensuite, coupez l’extrémité distale du muscle triceps et, à l’aide d’une pince incurvée, tirez-la vers le haut et sur le coude pour accéder au tendon proximal. Coupez le tendon proximal du triceps et transférez le muscle dans une boîte de Pétri. Répétez la procédure pour les quatre autres membres.Pour enlever la fourrure et la peau de la mâchoire, utilisez des ciseaux pour faire une incision de 0,5 centimètre sous l’œil, en coupant dans le sens caudal. Ensuite, à l’aide des pouces et de l’index des deux mains, pincez de chaque côté de l’incision et retirez la peau en la tirant vers le haut et vers le bas. Localisez le tendon principal du masséter dans la face caudale sous l’œil et insérez la lame plate du scalpel entre l’os et le muscle pour couper le tendon.Saisissez le tendon masséter majeur avec une pince incurvée et coupez-le avec une lame de scalpel ou des ciseaux dans le sens rostral pour séparer le muscle masséter de l’os de la mâchoire. Placez le muscle masséter isolé dans la boîte de Petri et répétez la procédure pour le deuxième muscle masséter. Utilisez des ciseaux pour faire une thoracotomie au milieu du sternum et couper à travers le sternum.Exposez le diaphragme en coupant à 360 degrés à travers la cage thoracique. Ensuite, pour séparer le haut du corps de l’abdomen, utilisez des ciseaux pour couper à travers la trachée, l’œsophage, la veine cave et l’aorte abdominale. Ensuite, à l’aide de ciseaux, préformez une laparotomie un centimètre sous le sternum et faites une coupe d’environ 360 degrés.Placez les ciseaux fermés entre la cage thoracique et les organes abdominaux et appuyez vers le bas. Tirez doucement sur la cage thoracique pour la séparer des organes abdominaux. Pour séparer le diaphragme de la cage thoracique, tenez le diaphragme entre deux doigts et coupez à travers la cage thoracique avec des ciseaux.Couper le diaphragme le plus près possible des côtes autour de 360 degrés et placer le diaphragme isolé dans une boîte de Pétri. Hachez les muscles isolés un par un en les coupant en morceaux d’environ un millimètre. Transférer les muscles hachés dans un tube conique de 15 litres contenant cinq litres de tampon de dissociation et incuber le tube à 37 degrés Celsius pendant 35 minutes dans un bain-marie secouant à une vitesse de 60 rotations par minute.Après digestion enzymatique des muscles émincés, transférer la suspension du tube de 15 millilitres dans un tube de 50 millilitres. À l’aide d’une seringue de 10 millilitres munie d’une aiguille de calibre 20, remettre l’échantillon en suspension en le tirant cinq fois de haut en bas à travers l’aiguille. Aspirez la suspension cellulaire dans la seringue et filtrez l’échantillon dans un nouveau tube conique de 50 millilitres muni d’une passoire à cellules sur le dessus.Pour récupérer toutes les cellules mononucléées, lavez le tube conique vide avec 20 millilitres de produit de lavage et versez-le à travers la passoire pour le combiner avec l’échantillon filtré. Récupérez le volume restant sous la crépine à cellules à l’aide d’une pipette P1000. Après la dissociation tissulaire et la coloration des anticorps, les cellules souches du muscle squelettique ou MuSC et les progéniteurs fibro-adipogéniques ou FAP des muscles individuels ont été purifiés par tri cellulaire activé par fluorescence.Après l’établissement initial de points de contrôle pour identifier les cellules et séparer les singlets des doublets, les portes subséquentes ont été établies à l’aide de contrôles FMO pour identifier les seuils de coloration. L’échantillon de coloration a été contrôlé et la population CD31 positive au SCA1 et la population CD45 négative correspondant aux PAF ont été triées dans un tube de prélèvement séparé. La population doublement négative a ensuite été fermée pour trier la population positive VCA correspondant aux MuSC.Les suspensions unicellulaires du muscle diaphragme et triceps, contrairement aux autres, présentaient une abondance relative plus élevée de MuSC que les FAP. La coloration EDU, bien que robuste, indiquait une différence dans les fractions de cellules EDU positives pour les deux types de cellules souches et entre les différents muscles. Pour tous les tissus, cependant, la fraction moyenne des MuSC positifs à l’EDU était supérieure à celle des PAF positifs pour l’EDU.Les MuSC isolés de l’EDL et de l’AG ont montré une incorporation d’EDU significativement plus faible par rapport à ceux de TA, diaphragme, gracilis ou triceps. De même, une variation significative de l’incorporation d’EDU a également été observée dans les FAP isolés de différents muscles. Enfin, la pureté cellulaire a été confirmée par coloration immunofluorescente, indiquant la spécificité du protocole d’isolement des cellules souches.L’étape la plus critique est la digestion mécanique du tissu. Lorsque le tissu est trop coupé, la viabilité diminue. Lorsque le tissu est coupé trop peu, l’anguille diminue.Le protocole peut être combiné avec des tests qui mesurent le comportement cellulaire, tels que la greffe après la transplantation pour mieux comprendre les fonctions des cellules souches in vivo. Cette technique peut répondre à la question de savoir si les différences dans le comportement des cellules souches dans les muscles individuels peuvent contribuer aux phénotypes de maladies et aux maladies caractérisées par des modèles uniques de muscles affectés.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

L&#39;isolement et la transplantation de cellules souches hématopoïétiques (CSH)

Recherche

Biologie

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

Transfection d&#39;ADN des mammifères muscles squelettiques à l&#39;aide In Vivo L&#39;électroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Adultes et embryonnaires Culture squelettique Microexplant musculaire et isolement de cellules souches du muscle squelettique

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Isolement mitochondriale du muscle squelettique

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Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

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L&#39;étude de la protéolyse de la cycline B au niveau de la cellule unique dans les populations de cellules entières

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Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies

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