Name: isolation of quiescent stem cell populations from individual skeletal muscles
Uploaded: 2022-12-09T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Quiescent Stem Cell Populations from Individual Skeletal Muscles at JoVE.com

Сортировка клеток проводилась на базовом объекте FACS, Орхусский университет, Дания. Фигуры были созданы с помощью Biorender.com. Мы благодарим доктора J. Farup за то, что он поделился антителом кролика против PDGFRa. Эта работа была поддержана стартовым грантом AUFF для E.P. и грантами Start Package от NovoNordiskFonden для E.P. (0071113) и A.D.M. (0071116).

Настоящий протокол был выполнен в соответствии с руководящими принципами по уходу за животными в Орхусском университете и местными правилами этики.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно соблюдайте правила местного этического комитета по экспериментам на животных и обращению с посм...

<ol>
	<li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers.">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).</li><li>Relaix, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+skeletal+muscle+stem+cells.">Perspectives on skeletal muscle stem cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).</li><li>Cheung, T. H., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+stem+cell+quiescence.">Molecular regulation of stem cell quiescence.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 14 (6), 329-340 (2013).</li><li>Kann, A. P., Hung, M., Krauss, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+contact+and+signaling+in+the+muscle+stem+cell+niche.">Cell-cell contact and signaling in the muscle stem cell niche.</a> Current Opinion in Cell Biology. 73, 78-83 (2021).</li><li>Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repairing+skeletal+muscle:+regenerative+potential+of+skeletal+muscle+stem+cells.">Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).</li><li>Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells,+connective+tissue+fibroblasts+and+their+interactions+are+crucial+for+muscle+regeneration.">Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).</li><li>Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+absolute+requirement+for+Pax7-positive+satellite+cells+in+acute+injury-induced+skeletal+muscle+regeneration.">An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).</li><li>Sambasivan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax7-expressing+satellite+cells+are+indispensable+for+adult+skeletal+muscle+regeneration.">Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).</li><li>Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+and+expansion+of+single+transplanted+muscle+stem+cells.">Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells.</a> Nature. 456 (7221), 502-506 (2008).</li><li>Joe, A. W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+injury+activates+resident+fibro/adipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis.">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).</li><li>Wosczyna, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+are+required+for+regeneration+and+homeostatic+maintenance+of+skeletal+muscle.">Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle.</a> Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).</li><li>Uezumi, A., Fukada, S. -. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+progenitors+distinct+from+satellite+cells+contribute+to+ectopic+fat+cell+formation+in+skeletal+muscle.">Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).</li><li>Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax7+Is+Required+for+the+Specification+of+Myogenic+Satellite+Cells.">Pax7 Is Required for the Specification of Myogenic Satellite Cells.</a> Cell. 102 (6), 777-786 (2000).</li><li>Shea, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sprouty1+regulates+reversible+quiescence+of+a+self-renewing+adult+muscle+stem+cell+pool+during+regeneration.">Sprouty1 regulates reversible quiescence of a self-renewing adult muscle stem cell pool during regeneration.</a> Cell Stem Cell. 6 (2), 117-129 (2010).</li><li>Fukada, S. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signature+of+quiescent+satellite+cells+in+adult+skeletal+muscle.">Molecular signature of quiescent satellite cells in adult skeletal muscle.</a> Stem Cells. 25 (10), 2448-2459 (2007).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li><li>Joe, A., Wang, J., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+adipogenic+progenitors+from+skeletal+muscle.">Prospective isolation of adipogenic progenitors from skeletal muscle.</a> Journal of Investigative Medicine. 55 (1), 124 (2007).</li><li>Yi, L., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+progenitors+from+skeletal+muscle.">Purification of progenitors from skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2476 (2011).</li><li>Sherwood, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adult+mouse+myogenic+progenitors:+functional+heterogeneity+of+cells+within+and+engrafting+skeletal+muscle.">Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle.</a> Cell. 119 (4), 543-554 (2004).</li><li>Montarras, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+isolation+of+satellite+cells+for+skeletal+muscle+regeneration.">Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration.</a> Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).</li><li>Conboy, M. J., Cerletti, M., Wagers, A. J., Conboy, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-analysis+and+FACS+sorting+of+adult+muscle+fiber-associated+stem/precursor+cells.">Immuno-analysis and FACS sorting of adult muscle fiber-associated stem/precursor cells.</a> Methods In Molecular Biology. 621, 165-173 (2010).</li><li>de Morree, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+polyadenylation+of+Pax3+controls+muscle+stem+cell+fate+and+muscle+function.">Alternative polyadenylation of Pax3 controls muscle stem cell fate and muscle function.</a> Science. 366 (6466), 734-738 (2019).</li><li>Stuelsatz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraocular+muscle+satellite+cells+are+high+performance+myo-engines+retaining+efficient+regenerative+capacity+in+dystrophin+deficiency.">Extraocular muscle satellite cells are high performance myo-engines retaining efficient regenerative capacity in dystrophin deficiency.</a> Developmental Biology. 397 (1), 31-44 (2015).</li><li>Mookhtiar, K., Randall Steinbrink, D., Van Wart, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mode+of+hydrolysis+of+collagen-like+peptides+by+class+I+and+class+II+Clostridium+histolyticum+collagenases:+evidence+for+both+endopeptidase+and+tripeptidylcarboxypeptidase+activities.">Mode of hydrolysis of collagen-like peptides by class I and class II Clostridium histolyticum collagenases: evidence for both endopeptidase and tripeptidylcarboxypeptidase activities.</a> Biochemistry. 24 (23), 6527-6533 (1985).</li><li>Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispase,+a+neutral+protease+from+Bacillus+polymyxa,+is+a+powerful+fibronectinase+and+type+IV+collagenase.">Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).</li><li>Baghdadi, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+signalling+by+Notch-Collagen+V-CALCR+retains+muscle+stem+cells+in+their+niche.">Reciprocal signalling by Notch-Collagen V-CALCR retains muscle stem cells in their niche.</a> Nature. 557 (7707), 714-718 (2018).</li><li>van Velthoven, C. T. J., de Morree, A., Egner, I. M., Brett, J. O., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+quiescent+muscle+stem+cells+in+vivo.">Transcriptional profiling of quiescent muscle stem cells in vivo.</a> Cell Reports. 21 (7), 1994-2004 (2017).</li><li>Machado, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+fixation+redefines+quiescence+and+early+activation+of+skeletal+muscle+stem+cells.">In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells.</a> Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).</li><li>Machado, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+damage+induces+a+conserved+stress+response+that+initiates+quiescent+muscle+stem+cell+activation.">Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation.</a> Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).</li><li>vanden Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations.">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li><li>Moore, D. K., Motaung, B., du Plessis, N., Shabangu, A. N., Loxton, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SU-IRG+consortium+isolation+of+B-cells+using+Miltenyi+MACS+bead+isolation+kits.">SU-IRG consortium isolation of B-cells using Miltenyi MACS bead isolation kits.</a> PloS One. 14 (3), 0213832 (2019).</li><li>Liou, Y. -. R., Wang, Y. -. H., Lee, C. -. Y., Li, P. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buoyancy-activated+cell+sorting+using+targeted+biotinylated+albumin+microbubbles.">Buoyancy-activated cell sorting using targeted biotinylated albumin microbubbles.</a> PloS One. 10 (5), 0125036 (2015).</li><li>Brett, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+rejuvenates+quiescent+skeletal+muscle+stem+cells+in+old+mice+through+restoration+of+Cyclin+D1.">Exercise rejuvenates quiescent skeletal muscle stem cells in old mice through restoration of Cyclin D1.</a> Nature Metabolism. 2 (4), 307-317 (2020).</li><li>Tabula Muris Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+transcriptomic+atlas+characterizes+ageing+tissues+in+the+mouse.">A single-cell transcriptomic atlas characterizes ageing tissues in the mouse.</a> Nature. 583 (7817), 590-595 (2020).</li><li>de Morr&#233;e, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staufen1+inhibits+MyoD+translation+to+actively+maintain+muscle+stem+cell+quiescence.">Staufen1 inhibits MyoD translation to actively maintain muscle stem cell quiescence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), 8996-9005 (2017).</li></ol>

Несколько шагов являются ключевыми в выполнении этого протокола для достижения хороших урожаев. Отдельные мышцы имеют небольшой объем по сравнению с количеством мышц, используемых в протоколах объемной изоляции. Это приводит к риску высыхания мышц во время рассечения, что снижает уро...

Скелетные мышцы обладают высокой способностью к регенерации благодаря наличию мышечных стволовых клеток (MuSC). MuSC расположены на миофибрах, под базальной пластинкой, и находятся в состоянии покоя с длительным обратимым выходомиз клеточного цикла 1,2,3,4. При повреждении MuSC активируются и вступают в клеточный цикл, образуя амплифицирующие предшественники, которые могут дифференцироваться и сливаться с образованием новых миоволокон 2,5. Предыдущая работа показала, что MuSC абсолютно необходимы для регенерации мышц 6,7,8. Более того, один MuSC может приживаться и генерировать как новые стволовые клетки, так и новые миоволокна9. Скелетные мышцы также содержат популяцию мезенхимальных стромальных клеток, называемых фиброадипогенными предшественниками (FAP), которые играют решающую роль в поддержке функции MuSC во время регенерации мышц 6,10,11,12.
Из-за их способности координировать регенерацию мышц существует огромный интерес к пониманию того, как работают MuSC и FAP. Покоившиеся MuSC отмечены экспрессией транскрипционных факторов Pax7 и Sprouty1, а также рецептора кальцитонина белка клеточной поверхности, тогда как покоящиеся FAP отмечены рецептором альфа-фактора роста, полученным из тромбоцитов белка клеточной поверхности (PDGFRa)10,12,13,14,15. Предыдущие исследования показали, что MuSC и FAP могут быть очищены от скелетных мышц с использованием маркеров клеточной поверхности и флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS)9,15,16,17,18,19,20,21. Несмотря на то, что эти протоколы значительно расширили возможности изучения MuSC и FAP, одним из недостатков является то, что большинство этих протоколов требуют выделения MuSC из пула различных мышечных тканей. Недавняя работа, проведенная нами и другими, выявила различия в фенотипе клеток и уровнях экспрессии генов между MuSC, выделенными из разных тканей22,23. MuSC диафрагмы, трицепса и грацилиса демонстрируют более быструю активацию, чем MuSC из мышц нижних задних конечностей 22, в то время как MuSC из экстраокулярной мышцы демонстрируют более быструю дифференцировку, чем MuSC из мышц диафрагмы и нижних мышцзадних конечностей23.
Этот протокол описывает выделение MuSC и FAP из отдельных скелетных мышц (рис. 1). Это включает в себя рассечение диафрагмы, трицепса, грацилиса, передней большеберцовой кости (ТА), камбаловидной мышцы, длинного разгибателя пальцев (EDL), икроножной мышцы (GA) и жевательных мышц. Рассеченные мышцы впоследствии диссоциируют путем ферментативного расщепления с использованием коллагеназы II (протеаза, которая специфически нацелена на аминокислотную последовательность Pro-X-Gly-Pro в коллагене, обеспечивая деградацию соединительной ткани и диссоциациютканей 24) и диспазу (протеаза, которая расщепляет фибронектин и коллаген IV, обеспечивая дальнейшую диссоциациюклеток 25). MuSC и FAP выделяются из одноклеточных суспензий с помощью FACS. В качестве примеров последующих анализов для клеточного анализа активация стволовых клеток определяется путем анализа включения 5-этинил-2'-дезоксиуридина (EdU), в то время как чистота клеток определяется иммунофлуоресцентным окрашиванием для специфических маркеров клеточного типа Pax7 и PDGFRa.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube( PCR performance tested, PP, 30,000 xg, DNA/DNase-/RNase-free, Low DNA binding, Sterile )</td>
			
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>72.706.700</td>			
<td>1.5 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tube (PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, IATA, DNA/DNase-/RNase-free, Non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile)</td>
			
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>62.554.502</td>			
<td>15 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polystyrene round-bottom tube</td>
			
			<td>Falcon, Fisher Scientific&#160;</td>
<td>352054</td>			
<td>FACS tube without strainer cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polystyrene Round-bottom tube with cell-strainer cap</td>
			
			<td>Falcon, Fisher Scientific&#160;&#160;</td>
<td>352235</td>			
<td>FACS tube with strainer cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL tube (PP, non sterile autoclavable)</td>
			
			<td>VWR collection</td>
<td>525.0946</td>			
<td>5 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube( PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, ADR, DNA/DNase-/RNase-free, non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile)</td>
			
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>62.547.254</td>			
<td>50 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
<td>Lot: 2387458 (Cat # A31572)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 donkey-anti mouse IgG (H+L)</td>
			
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
<td>Lot: 2420713 (Cat#A31571)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARIA 3</td>
			
			<td>BD</td>
<td></td>			
<td>FACS, Core facility Aarhus University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810</td>
			
			<td>eppendorf</td>
<td>EP022628188</td>			
<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye</td>
			
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
<td>Lot: 2387287 (Cat# C10337)</td>			
<td>Cell Proliferation Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from calf-skin&#160;</td>
			
			<td>Bioreagent, Sigma Aldrich&#160;</td>
<td>Source: SLCK6209 (Cat# C8919)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			
			<td>Worthington, Fisher Scientific&#160;</td>
<td>Lot: 40H20248 (cat# L5004177 )</td>			
<td>Collagenase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			
			<td>Gibco, Fisher Scientific&#160;</td>
<td>Lot: 2309415 (cat# 17105-041 )</td>			
<td>Dispase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum (non-sterile)</td>
			
			<td>Sigma Aldrich, Merck</td>
<td>Lot: 2826455 (Cat# S30-100mL)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont nr. 5, 110 mm</td>
			
			<td>Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>1606.327</td>			
<td>Straight forceps with fine tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont nr. 7, 115 mm</td>
			
			<td>Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>1606.335</td>			
<td>Curved forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-10 Nutrient mixture (Ham) (1x), +L-glutamine</td>
			
			<td>Gibco, Fisher Scientific&#160;</td>
<td>Lot. 2453614 (cat# 31550-023)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD31</td>
			
			<td>BioLegend, NordicBioSite</td>
<td>MEC13.3 (Cat # 102506)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Anti-mouse CD45</td>
			
			<td>BioLegend, NordicBioSite</td>
<td>30-F11 (Cat# 103108)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid (100%)</td>
			
			<td>EMSURE, Merck&#160;&#160;</td>
<td>K44104563 9Cat # 1000631000)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head over head mini-tube rotator&#160;</td>
			
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
<td>15534080 (Model no. 88861052)</td>			
<td>Head over head mini-tube rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			
			<td>Gibco, Fisher Scientific&#160;</td>
<td>Lot. 2482639 (cat# 10368902 )</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp SWB 15</td>
			
			<td>FisherBrand, Fisher Scientific</td>
<td>15325887</td>			
<td>Shaking water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS2 mini-shaker&#160;</td>
			
			<td>IKA&#160;</td>
<td></td>			
<td>Vortex unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 20 G (0.9 mm x 25 mm)</td>
			
			<td>BD microlance, Fisher Scientific&#160;</td>
<td>304827</td>			
<td>20G needle&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral formalin buffer 10%</td>
			
			<td>CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>Lot: 03822014 (Cat # HOU/1000.1002)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-pyrogenic cell strainer (40 &#181;M)</td>
			
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>83.3945.040</td>			
<td>Cell strainer&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1)</td>
			
			<td>BioLegend, NordicBioSite</td>
<td>D7 (Cat# 108120)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax7 primary antibody</td>
			
			<td>DSHB</td>
<td>Lot: 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x powder concentrate</td>
			
			<td>Fisher BioReagents, Fisher Scientific</td>
<td>BP665-1</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-mouse CD106 (VCAM1)</td>
			
			<td>BioLegend, NordicBioSite</td>
<td>429 (MVCAM.A) (Cat # 105720)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep</td>
			
			<td>Gibco, Fisher Scientific&#160;</td>
<td>Lot. 163589 (cat# 11548876 )</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips p10</td>
			
			<td>Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific</td>
<td>2140-05</td>			
<td>Low retention, pre-sterilized, filter tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips p1000</td>
			
			<td>Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific</td>
<td>2279-05</td>			
<td>Low retention, pre-sterilized, filter tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips p20</td>
			
			<td>Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific</td>
<td>2149P-05</td>			
<td>Low retention, pre-sterilized, filter tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips p200</td>
			
			<td>Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific</td>
<td>2069-05</td>			
<td>Low retention, pre-sterilized, filter tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protective underpad</td>
			
			<td>Abena&#160;</td>
<td>ACTC-7712</td>			
<td>&#160;60 x 40cm, 8 layers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin, pipet-lite XLS</td>
			
			<td>Mettler Toledo, Thermo Scientific&#160;</td>
<td>2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05</td>			
<td>Pipettes (P10, P20, P200, P1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant anti-PDGFR-alpha</td>
			
			<td>RabMAb, abcam</td>
<td>AB134123</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel (shaft no. 3)</td>
			
			<td>Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>1902.502</td>			
<td>Scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade no. 11</td>
			
			<td>Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>1902.0911</td>			
<td>Scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanlaf mars</td>
			
			<td>Labogene</td>
<td>class 2 cabinet: Mars</td>			
<td>Flow bench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanR</td>
			
			<td>Olympus</td>
<td></td>			
<td>Microscope, Core facility Aarhus University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			
			<td>FST</td>
<td>14568-09</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series 8000 DH</td>
			
			<td>Thermo Scientific</td>
<td>3540-MAR</td>			
<td>Incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 10 mL</td>
			
			<td>VWR</td>
<td>612-3700</td>			
<td>Sterile, non-pyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 5 mL</td>
			
			<td>VWR, Avantor delivered by VWR</td>
<td>612-3702</td>			
<td>Sterile, non-pyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 5 mL, Luer tip (6%), sterile&#160;</td>
			
			<td>BD Emerald, Fisher Scientific</td>
<td>307731</td>			
<td>Syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 100, standard</td>
			
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>83.3902</td>			
<td>Petri dish&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture (TC)-treated surface, black polystyrene, flat bottom, sterile, lid, pack of 20</td>
			
			<td>Corning, Sigma Aldrich</td>
<td>3764</td>			
<td>96-well Half bottom plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			
			<td>Sigma Aldrich, Merck</td>
<td>Source: SLCJ6163 (Cat # T8787)</td>			
<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of quiescent stem cell populations from individual skeletal muscles

Скелетные мышцы содержат различные популяции взрослых стволовых клеток, которые способствуют гомеостазу и восстановлению ткани. Стволовые клетки скелетных мышц (MuSC) обладают способностью создавать новые мышцы, тогда как фиброзно-адипогенные предшественники (FAP) вносят свой вклад в стромальные поддерживающие ткани и обладают способностью создавать фибробласты и адипоциты. Как MuSC, так и FAP находятся в состоянии длительного обратимого выхода из клеточного цикла, называемого покоем. Состояние покоя является ключом к их функции. Спокойные стволовые клетки обычно очищаются от нескольких мышечных тканей, объединенных вместе в одном образце. Однако недавние исследования выявили явные различия в молекулярных профилях и глубине покоя MuSC, выделенных из разных мышц. В настоящем протоколе описывается выделение и изучение MuSC и FAP из отдельных скелетных мышц и представлены стратегии проведения молекулярного анализа активации стволовых клеток. В нем подробно описывается, как изолировать и переваривать мышцы различного происхождения развития, толщины и функций, такие как диафрагма, трицепс, грацилис, передняя большеберцовая кость (TA), икроножная мышца (GA), камбаловидная мышца, длинный разгибатель пальцев (EDL) и жевательные мышцы. MuSC и FAP очищают с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) и анализируют с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания и анализа включения 5-этинил-2'-дезоксиуридина (EdU).

В соответствии с протоколом индивидуальной изоляции скелетных мышц (рис. 2) грацилис, ТА, ЭДЛ, ГА, камбаловидная мышца, трицепс, массажер и мышцы диафрагмы были выделены из трех швейцарских самцов беспородных мышей, которые были прекращены из местной программы разведения (рис....

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Quiescent Stem Cell Populations from Individual Skeletal Muscles at JoVE.com

Isolation of Quiescent Stem Cell Populations from Individual Skeletal Muscles

Этот протокол описывает выделение мышечных стволовых клеток и фиброзно-адипогенных предшественников из отдельных скелетных мышц у мышей. Протокол включает в себя рассечение одной мышцы, выделение стволовых клеток путем сортировки клеток, активированных флуоресценцией, оценку чистоты путем иммунофлуоресцентного окрашивания и количественное измерение входа в S-фазу с помощью анализа включения 5-этинил-2'-дезоксиуридина.

Выделение популяций стволовых клеток в состоянии покоя из отдельных скелетных мышц

Skeletal muscle harbors distinct populations of adult stem cells that contribute to the homeostasis and repair of the tissue. Skeletal muscle stem cells ...

Этот протокол важен, потому что он позволяет изучать функцию стволовых клеток в различных скелетных мышцах, углубляя наше понимание того, как они способствуют гомеостазу, регенерации и прогрессированию заболевания. Используя этот протокол, мы можем выделить две популяции живых стволовых клеток из определенных мышц и изучить, как они работают. Чтобы начать мышечную изоляцию, опрыскайте усыпленную мышь этанолом и поместите ее животом вверх.С помощью ножниц сделайте горизонтальный разрез длиной 0,5 сантиметра в коже живота. Обеими руками потяните кожу, чтобы обнажить туловище, а также нижние конечности вплоть до задних конечностей. Найдите грацилис или внутреннюю мышцу бедра и, используя пару изогнутых щипцов, возьмитесь за нее и слегка приподнимите мышцу.С помощью ножниц сделайте разрез в 0,5 сантиметра, чтобы вырезать грацилисную мышцу. Повторите процедуру на другой ноге. С помощью скальпеля разрежьте фасцию, сделав 0,5-сантиметровый разрез вдоль боковой стороны большеберцовой кости.Затем захватите фасцию с помощью изогнутых щипцов и удалите ее, потянув, обнажив сухожилия на дистальном конце задней конечности. Затем вставьте пару прямых щипцов с очень тонкими наконечниками между дистальным сухожилием ТА и мышцей EDL. Разделите мышцы, сдвинув щипцы к проксимальному концу мышц.Верните щипцы к дистальному концу и перережьте дистальное сухожилие. Осторожно захватите дистальное сухожилие ТА изогнутыми щипцами и поднимите мышцу вверх и над ее проксимальным прикреплением. Чтобы аккуратно разрезать проксимальное сухожилие, отрежьте другой конец как можно ближе к его прикреплению и перенесите ТА в чашку Петри.Затем используйте прямые щипцы с очень тонкими наконечниками, чтобы пройти под дистальным сухожилием EDL, и сдвиньте щипцы к проксимальному концу мышцы, чтобы отделить мышцы друг от друга. Верните щипцы к дистальному концу и перережьте дистальное сухожилие, не повреждая мышцу. Осторожно захватив дистальное сухожилие EDL изогнутыми щипцами, поднимите мышцу вверх и над ее проксимальным прикреплением, чтобы аккуратно разрезать проксимальное сухожилие как можно ближе к его прикреплению.Отрежьте другой конец и перенесите мышцу EDL в чашку Петри. Повторите процедуру для другой задней конечности. Используйте прямые щипцы с очень тонкими наконечниками, чтобы проникнуть между ахилловым сухожилием и нижними костями задних конечностей.Сдвиньте щипцы к проксимальному концу мышцы, чтобы отделить мышцу от костей. Верните щипцы к дистальному концу и перережьте дистальное сухожилие. Потяните икроножную мышцу или GA вверх и над малоберцовой костью.Чтобы найти сухожилие проксимального отдела камбаловидной мышцы. Вставьте прямые щипцы между камбаловидной мышцей и мышцами GA и переместите щипцы к дистальному концу мышц, чтобы отделить камбаловидную мышцу от GA. Теперь перережьте проксимальное камбаловидное сухожилие. Захватите его изогнутыми щипцами и осторожно приподнимите су, чтобы получить доступ к его дистальному сухожилию.Разрежьте дистальное сухожилие, чтобы изолировать камбаловидную мышцу от ГА, и поместите камбаловидную мышцу в чашку Петри, содержащую промывочную среду. Затем нарежьте GA и поместите его в чашку Петри. Чтобы изолировать трехглавую мышцу, используйте прямые щипцы со сверхтонкими наконечниками, чтобы протянуть руку между трицепсом и плечевой костью, и сдвиньте щипцы к проксимальному концу мышцы, чтобы отделить мышцу от кости.Затем разрежьте дистальный конец трехглавой мышцы и с помощью изогнутых щипцов подтяните ее вверх и над локтем, чтобы получить доступ к проксимальному сухожилию. Перережьте проксимальное сухожилие трицепса и перенесите мышцу в чашку Петри. Повторите процедуру для остальных четырех конечностей.Чтобы удалить шерсть и кожу с челюсти, с помощью ножниц сделайте разрез на 0,5 сантиметра ниже глаза, разрезая в каудальном направлении. Затем, используя большие и указательные пальцы обеих рук, зажмите каждую сторону разреза и удалите кожу, потянув ее вверх и вниз. Найдите основное сухожилие жевательной мышцы на каудальной стороне под глазом и вставьте плоское лезвие скальпеля между костью и мышцей, чтобы перерезать сухожилие.Возьмитесь за крупное жевательное сухожилие изогнутыми щипцами и разрежьте его лезвием скальпеля или ножницами в ростральном направлении, чтобы отделить жевательную мышцу от челюстной кости. Поместите изолированную жевательную мышцу в чашку Петри и повторите процедуру для второй жевательной мышцы. С помощью ножниц сделайте торакотомию в середине грудины и прорежьте грудину.Обнажите диафрагму, разрезав грудную клетку на 360 градусов. Затем, чтобы отделить верхнюю часть тела от живота, используйте ножницы, чтобы разрезать трахею, пищевод, полую вену и брюшную аорту. Затем с помощью ножниц сделайте лапаротомию на сантиметр ниже грудины и сделайте разрез примерно на 360 градусов.Поместите закрытые ножницы между грудной клеткой и органами брюшной полости и надавите. Аккуратно потяните за грудную клетку, чтобы отделить ее от органов брюшной полости. Чтобы отделить диафрагму от грудной клетки, неплотно зажмите диафрагму между двумя пальцами и прорежьте грудную клетку ножницами.Обрежьте диафрагму как можно ближе к ребрам примерно на 360 градусов и поместите изолированную диафрагму в чашку Петри. Измельчите изолированные мышцы одну за другой, разрезав их на кусочки размером примерно один миллиметр. Перенесите измельченные мышцы в 15-литровую коническую трубку, содержащую пять литров диссоциативного буфера, и инкубируйте пробирку при температуре 37 градусов Цельсия в течение 35 минут на встряхивающей водяной бане со скоростью 60 оборотов в минуту.После ферментативного переваривания измельченных мышц перенесите суспензию из 15-миллилитровой пробирки в 50-миллилитровую. Используя шприц объемом 10 миллилитров, оснащенный иглой 20-го калибра, повторно подвешивайте образец, пять раз протягивая его вверх и вниз через иглу. Наберите клеточную суспензию в шприц и процедите образец в новую коническую трубку объемом 50 миллилитров, оснащенную клеточным ситечком сверху.Чтобы извлечь все моноядерные клетки, промойте пустую коническую пробирку 20 миллилитрами промывочного средства и вылейте ее через сетчатое фильтро, чтобы соединить с процеженным образцом. Извлеките оставшийся объем под клеточный фильтр с помощью пипетки P1000. После диссоциации тканей и окрашивания антител стволовые клетки скелетных мышц или MuSC и фиброзно-адипогенные предшественники или FAP из отдельных мышц были очищены путем сортировки клеток, активированной флуоресценцией.После первоначального стробирования для идентификации клеток и отделения синглетов от дублетов последующие ворота были установлены с использованием элементов управления FMO для определения порогов окрашивания. Образец пятна закрывали, а SCA1-положительную CD31-отрицательную и CD45-отрицательную популяцию, соответствующие FAP, сортировали в отдельную пробирку для сбора. Двойная отрицательная популяция была дополнительно закрыта для сортировки VCA-положительной популяции, соответствующей MuSC.Одноклеточные суспензии мышц диафрагмы и трицепса, в отличие от других, имели более высокое относительное содержание MuSC, чем FAP. Окрашивание EDU, хотя и надежное, показало разницу во фракциях EDU-положительных клеток для двух типов стволовых клеток и в разных мышцах. Однако для всех тканей средняя доля EDU-положительных MuSC была выше, чем у EDU-положительных FAP.MuSC, выделенные из EDL и GA, показали значительно более низкое включение EDU по сравнению с таковыми из TA, диафрагмы, грацилиса или трицепса. Аналогичным образом, значительные различия в включении EDU также наблюдались в FAP, изолированных из разных мышц. Наконец, чистота клеток была подтверждена иммунофлуоресцентным окрашиванием, что указывает на специфичность протокола выделения стволовых клеток.Наиболее важным этапом является механическое переваривание ткани. Когда ткань разрезается слишком сильно, жизнеспособность снижается. Когда ткань разрезается слишком мало, EEL снижается.Протокол можно комбинировать с анализами, которые измеряют поведение клеток, такими как приживление трансплантата после трансплантации, чтобы лучше понять функции стволовых клеток in vivo. Этот метод может ответить на вопрос, могут ли различия в поведении стволовых клеток в отдельных мышцах способствовать фенотипам заболеваний и заболеваниям, характеризующимся уникальными паттернами пораженных мышц.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Выделение и трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК)

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

Трансфекция ДНК млекопитающих скелетных мышц использованием В Vivo Электропорация

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Взрослые и эмбриональные скелетных мышц Microexplant культуры и выделение скелетных мышц стволовых клеток

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Митохондриальная Изоляция от скелетных мышц

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Прочная Генерация гепатоцитов-подобных клеток из человеческих эмбриональных стволовых клеток населения

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Изучение Протеолиз циклин B на одном уровне клеток в популяции клеток Всего

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies

Изометрические и эксцентричный оценке формирования сил скелетных мышц, изолированных от мышиной модели мышечной дистрофии

Critical to the evaluation of potential  therapeutics for muscular disease are sensitive and reproducible physiological  assessments of muscle function. ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Выделение и культура Индивидуальные мышечных волокон и их сателлитные клетки от взрослых скелетных мышц

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Выделение кровеносных сосудов, полученных мультипотентные прекурсоров от человека скелетных мышц

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Профилирования Индивидуальный человеческих эмбриональных стволовых клеток путем количественного RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...