Name: an electroporation method to transform rickettsia spp. with a fluorescent protein-expressing shuttle vector in tick cell lines
Uploaded: 2022-10-11T14:20:00
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Wir danken Timothy J. Kurtti und Benjamin Cull für ihre aufschlussreichen Diskussionen und Anregungen. Diese Studie wurde finanziell durch einen Zuschuss an U.G.M. vom NIH (2R01AI049424) und einen Zuschuss an U.G.M. von der Minnesota Agricultural Experiment Station (MIN-17-078) unterstützt.

1. Vermehrung und Reinigung von R. parkeri aus Zeckenzellkulturen
HINWEIS: Alle Zellkulturverfahren sind in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II durchzuführen.
<ol><li>Vorbereitend R. parkeri-infizierte Zeckenzellen<ol><li>ISE6-Zellen in 25 cm 2-Zellkulturkolben bei 34 °C in 5 ml L15C300 medium17 züchten, ergänzt mit 5% fetalem Rinderserum (FBS), 5% Tryptosephosphatbrühe (TPB) und 0,1% Lipoproteinkonzentrat (LPC).</su...

<ol>
	<li>Gillespie, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmids+and+rickettsial+evolution:+Insight+from+Rickettsia+felis.">Plasmids and rickettsial evolution: Insight from Rickettsia felis.</a> PLoS One. 2 (3), 266 (2007).</li><li>Murray, G. G., Weinert, L. A., Rhule, E. L., Welch, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phylogeny+of+Rickettsia+using+different+evolutionary+signatures:+How+tree-like+is+bacterial+evolution.">The phylogeny of Rickettsia using different evolutionary signatures: How tree-like is bacterial evolution.</a> Systematic Biology. 65 (2), 265-279 (2016).</li><li>Parola, P., Paddock, C. 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F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Ixodes+scapularis+cell+line+with+a+predominantly+neuron-like+phenotype.">An Ixodes scapularis cell line with a predominantly neuron-like phenotype.</a> Experimental and Applied Acarology. 66 (3), 427-442 (2015).</li><li>Grabowski, J. M., Gulia-Nuss, M., Kuhn, R. J., Hill, C. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rickettsia+buchneri+sp.+nov.,+a+rickettsial+endosymbiont+of+the+blacklegged+tick+Ixodes+scapularis.">Rickettsia buchneri sp. nov., a rickettsial endosymbiont of the blacklegged tick Ixodes scapularis.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, 965 (2015).</li><li>Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formulation+of+medium+for+tick+cell+culture.">Formulation of medium for tick cell culture.</a> Experimental &amp; Applied Acarology. 7 (3), 219-229 (1989).</li><li>Bell-Sakyi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cell+lines+from+the+tick+Hyalomma+anatolicum+anatolicum.">Continuous cell lines from the tick Hyalomma anatolicum anatolicum.</a> The Journal of Parasitology. 77 (6), 1006-1008 (1991).</li><li>Mattila, J. T., Burkhardt, N. Y., Hutcheson, H. J., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cell+lines+and+a+rickettsial+endosymbiont+from+the+soft+tick+Carios+capensis+(Acari:+Argasidae:+Ornithodorinae).">Isolation of cell lines and a rickettsial endosymbiont from the soft tick Carios capensis (Acari: Argasidae: Ornithodorinae).</a> Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1091-1101 (2007).</li><li>Bell-Sakyi, L., R&#367;&#382;ek, D., Gould, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+from+the+soft+tick+Ornithodoros+moubata.">Cell lines from the soft tick Ornithodoros moubata.</a> Experimental and Applied Acarology. 49 (3), 209-219 (2009).</li></ol>

Hier demonstrieren wir eine Methode zur Einführung exogener DNA, die auf dem Shuttle-Plasmid pRAM18dSFA kodiert, in Rickettsien mittels Elektroporation. Bei diesem Verfahren wurden zellfreie Rickettsien von Wirtszellen gereinigt, mit einem Rickettsial-Shuttle-Vektor transformiert und zur Infektion auf Zeckenzellen freigesetzt. Ebenfalls beschrieben ist ein konfokales Immunfluoreszenzverfahren zum Nachweis von rotem Fluoreszenzprotein-exprimierendem R. parkeri in Zeckenzellen. Ähnliche Methoden sind auf andere ...

Rickettsiosen werden durch eine breite Palette von obligaten intrazellulären Bakterien verursacht, die zur Gattung Rickettsia (Familie Rickettsiaceae, Ordnung Rickettsiales) gehören. Die Gattung Rickettsia wird anhand phylogenetischer Merkmale in vier Hauptgruppen eingeteilt1,2: die Fleckfiebergruppe (SFG), die diejenigen Rickettsien enthält, die die schwersten und tödlichsten durch Zecken übertragenen Rickettsiosen verursachen (z. B. Rickettsia rickettsii, der Erreger des Rocky-Mountain-Fleckfiebers), die Typhusgruppe (TG, z. B. Rickettsia prowazekii, der Erreger des epidemischen Typhus), die Übergangsgruppe (TRG, z. B. Rickettsia felis, der Erreger des durch Flöhe übertragenen Fleckfiebers) und die Ahnengruppe (AG, z. B. Rickettsia bellii).
Unter den ältesten bekannten vektorübertragenen Krankheiten werden Rickettsiosen hauptsächlich nach Übertragung der Erreger durch die Bisse infizierter Arthropodenvektoren, einschließlich Zecken, Flöhe, Läuse und Milben erworben 3,4. Obwohl die Entdeckung wirksamer Antibiotika die Behandlungsergebnisse verbesserte, stellen neu auftretende und wieder auftretende epidemische Rickettsiosen weiterhin traditionelle Präventions- und Kontrollstrategien in Frage. Daher würde ein umfassendes Verständnis der Rickettsien/Wirt/Vektor-Interaktionen letztendlich eine solide Grundlage für die Entwicklung neuer Ansätze zur Vorbeugung und Heilung dieser alten Krankheiten schaffen.
In der Natur erfolgt der horizontale Gentransfer (HGT) in Bakterien durch Konjugation, Transduktion und Transformation5. Die bakterielle In-vitro-Transformation nutzt diese HGT-Konzepte, obwohl die intrazelluläre Natur von Rickettsien einige Herausforderungen darstellt. Die eingeschränkten Wachstumsbedingungen und schlecht verstandenen Konjugations- und Transduktionssysteme bei verschiedenen Arten von Rickettsien haben die Anwendung von Konjugations- und Transduktionsmethoden bei Rickettsien 6,7,8 verhindert. Im Vergleich zu anderen obligaten intrazellulären Bakteriengattungen (z.B. Chlamydien, Coxiella, Anaplasma und Ehrlichia) unterscheidet sich die Gattung Rickettsia hinsichtlich der Wachstums- und Replikationsstrategien innerhalb des Zellzytoplasmas, was die genetische Veränderung von Rickettsien aufgrund ihrer einzigartigen Lebensweise vor besondere Herausforderungen stellt9.
Die erste Hürde, die es beim Versuch der genetischen Veränderung von Rickettsien zu überwinden gilt, ist eine erfolgreiche Transformation. Daher wäre die Entwicklung eines praktikablen Ansatzes mit hoher Transformationseffizienz äußerst wertvoll für die Entwicklung genetischer Werkzeuge für Rickettsien. Hier konzentrieren wir uns auf die Elektroporation, eine weithin anerkannte Transformationsmethode, die verwendet wurde, um exogene DNA erfolgreich in mehrere Arten von Rickettsien einzuführen, darunter Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii und Rickettsia buchneri10,11,12 ,13,14,15,16.
Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zur Elektroporation des R. parkeri-Stammes Tate's Hell (Akzession: GCA_000965145.1) mit dem Shuttle-Vektor pRAM18dSFA, der vom Rickettsia-Amblyommatis-Stamm AaR/SC-Plasmid pRAM18 abgeleitet ist und entwickelt wurde, um mKATE, ein weit rot fluoreszierendes Protein, und aadA zu kodieren, wodurch Spectinomycin- und Streptomycin-Resistenz13,15,20 verliehen wird. Transformierte R. parkeri sind lebensfähig und werden unter Antibiotikaselektion in Zeckenzelllinien stabil gehalten. Darüber hinaus zeigen wir, dass die Lokalisation von transformiertem R. parkeri in lebenden Zeckenzellen mittels konfokaler Mikroskopie genutzt werden kann, um die Qualität von Transformationsraten in Vektorzelllinien zu beurteilen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 &#956;m pore size filter&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences Whatman</td>
			<td>6783-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Luer-lock syringe&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60-90 silicon carbide grit&#160;</td>
			<td>LORTONE, inc</td>
			<td>&#160;591-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>absolute methanol&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A457-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto tryptose phosphate broth&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>260300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin centrifuge Cytospin4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A78300003</td>
			<td>The rotor is detatchable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12362</td>
			<td>used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>extended fine tip transfer pipet&#160;</td>
			<td>Perfector Scientific</td>
			<td>TP03-5301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>900-108</td>
			<td>The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2105 &#38; 165-2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Fiji</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td>raw image editing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KaryoMAX Giemsa stain&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>&#160;2021-10-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41300039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipoprotein concentrate&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>191476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Diaphot</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>epifluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Live ReadyProbes Reagent&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroff-Hausser Counting Chamber</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>&#160;Chamber 3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Vortex Genie 2</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an electroporation method to transform rickettsia spp. with a fluorescent protein-expressing shuttle vector in tick cell lines

Rickettsiosen werden durch eine breite Palette von obligaten intrazellulären Bakterien der Gattung Rickettsia verursacht, die durch den Biss infizierter Arthropodenvektoren auf Wirbeltierwirte übertragen werden können. Bis heute bleiben neu auftretende oder wieder auftretende epidemische Rickettsiosen aufgrund der Schwierigkeit bei der Diagnose ein Risiko für die öffentliche Gesundheit, da diagnostische Methoden begrenzt und nicht standardisiert oder allgemein zugänglich sind. Fehldiagnosen, die aus einer mangelnden Erkennung der Anzeichen und Symptome resultieren, können zu einer verzögerten Antibiotikabehandlung und schlechten Gesundheitsergebnissen führen. Ein umfassendes Verständnis der Rickettsienmerkmale würde letztendlich die klinische Diagnose, Bewertung und Behandlung mit verbesserter Kontrolle und Prävention der Krankheit verbessern. 
Funktionelle Studien von Rickettsialgenen sind entscheidend für das Verständnis ihrer Rolle in der Pathogenese. Diese Arbeit beschreibt ein Verfahren zur Elektroporation des Rickettsia parkeri Stammes Tate's Hell mit dem Shuttle-Vektor pRAM18dSFA und die Selektion von transformiertem R. parkeri in Zeckenzellkultur mit Antibiotika (Spectinomycin und Streptomycin). Es wird auch eine Methode zur Lokalisation von transformiertem R. parkeri in Zeckenzellen unter Verwendung der konfokalen Immunfluoreszenzmikroskopie beschrieben, einer nützlichen Technik zur Überprüfung der Transformation in Vektorzelllinien. Ähnliche Ansätze eignen sich auch für die Transformation anderer Rickettsien.

Die Morphologie von R. parkeri in ISE6-Zellen unter einem Lichtmikroskop nach Giemsa-Färbung ist in Abbildung 1 dargestellt. In Abbildung 2 sind transformierte R. parkeri , die rotes Fluoreszenzprotein in ISE6-Zellen exprimieren, mittels konfokaler Mikroskopie dargestellt. Es gibt einen erheblichen Anstieg der Infektionsrate von transformiertem R. parkeri (rot) in ISE6-Zellen (blau, entspricht den Kernen) von (A) Tag ...

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An Electroporation Method to Transform Rickettsia spp. with a Fluorescent Protein-Expressing Shuttle Vector in Tick Cell Lines

Die Elektroporation ist eine schnelle, weit verbreitete Methode zur Einführung exogener DNA in die Gattung Rickettsia. Dieses Protokoll bietet eine nützliche Elektroporationsmethode für die Umwandlung von obligaten intrazellulären Bakterien in der Gattung Rickettsia.

Eine Elektroporationsmethode zur Transformation von Rickettsien spp. mit einem fluoreszierenden Protein-exprimierenden Shuttle-Vektor in Zeckenzelllinien

Rickettsioses are caused by a broad range of obligate intracellular bacteria belonging to the genus Rickettsia that can be transmitted to vertebrate hosts ...

Funktionelle Studien von Rickettsia-Genen sind entscheidend für das Verständnis ihrer Rolle in der Pathogenese, daher benötigen wir zuverlässige Methoden, um die Gene kontrolliert zu verändern. Unser Protokoll verwendet Elektroporation, um exogene DNA in obligate intrazelluläre Bakterien der Gattung Rickettsia einzuführen, wodurch wir die Auswirkungen der eingeführten DNA untersuchen können. Gemeinsam mit mir wird heute Lisa Price, Forscherin aus dem Labor von Dr. Munderloh und Dr. Kurtti, das Verfahren demonstrieren.Um zu beginnen, bereiten Sie eine 90 bis 100% Rickettsia parkeri-infizierte ISE6-Zellkultur vor, wie im Text beschrieben. Um dann die Infektionsrate durch Giemsa-Färbung zu bestimmen, verdünnen Sie die Zellsuspension auf ein Verhältnis von 1:5 mit vollständigem Medium und geben Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension durch Zentrifugation bei 113 G für fünf Minuten auf einen Glasmikroskopobjektträger. Nachdem Sie den Schieber an der Luft trocknen lassen, fixieren Sie ihn fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit absolutem Methanol.Dann inkubieren Sie den Objektträger und die Giemsa-Färbung für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Als nächstes spülen Sie den Objektträger in Wasser ab und betrachten Sie ihn nach dem Trocknen unter einem Lichtmikroskop mit Ölobjektiven. Bestimmen Sie den Prozentsatz der infizierten Zellen, indem Sie die infizierten und nicht infizierten Zellen zählen.Zur Herstellung der zellfreien Rickettsia parkeri gießen Sie etwa 0,2 Milliliter sterile 60 bis 90 Siliziumkarbidkörnung in zwei zwei Milliliter sterile Mikrozentrifugenröhrchen und stellen die Röhrchen beiseite. Aus einem zuvor inokulierten Rickettsia parkeri-infizierten Kolben mit fünf Milliliter Medium zwei Milliliter des Mediums entfernen und darauf achten, die Zellschicht nicht zu stören. Dann resuspendieren Sie die Zellen mit den verbleibenden drei Milliliter des Mediums.Teilen Sie diese Aufhängung gleichmäßig auf die beiden vorbereiteten Silikonkarbid-Sandschläuche auf und wirbeln Sie das Rohr 30 Sekunden lang mit hoher Geschwindigkeit durch. Dann legen Sie sie auf Eis. Als nächstes bereiten Sie eine sterile Fünf-Milliliter-Luer-Lock-Spritze vor, indem Sie den Kolben verlängern und das Kolbenende in eine Polystyrolbasis einführen, die zur Aufnahme konischer 15-Milliliter-Röhrchen verwendet wird.Entfernen Sie mit einer Barriere-Zwei-Milliliter-Pasteur-Pipette, die mit einem Gummikolben betrieben wird, vorsichtig den Überstand der Wirbelzellen, ohne Körnung anzusaugen. Führen Sie dann die Pipettenspitze in die Öffnung der Spritzennabe ein und werfen Sie den Inhalt mit leichtem Druck in die Spritze. Als nächstes filtrieren Sie die Rickettsia parkeri-Kultur in sterile 1,5-Milliliter-Röhrchen durch einen sterilen Zwei-Mikrometer-Porenfilter auf der Spritzennabe und zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 13.600 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.Nach dem Entfernen des Überstands waschen Sie das Zellpellet zweimal mit 1,2 Milliliter 300-Millimolar-eiskalter Saccharoselösung. Zentrifugieren Sie die Probe und entfernen Sie den Überstand zwischen den Waschgängen. Am Ende der Zentrifugation wird das gepoolte Zellpellet mit 100 bis 150 Mikrolitern eiskalter Saccharoselösung für zwei bis drei Transformationsproben resuspendiert.Dann teilen Sie die Probe in 50-Mikroliter-Aliquots in vorgekühlten, sterilen 1,5-Mikrozentrifugenröhrchen. Zur Umwandlung bei drei Mikrogramm endotoxinfreier pRAM18sSFA-Plasmid-DNA in jedes Röhrchen mit 50 Mikrolitern Rickettsia parkeri auf Eis und vorsichtig mit einer Pipettenspitze umrühren. Die Mischung wird in eine vorgekühlte sterile Elektroporationsküvette mit einer Spaltgröße von 0,1 Zentimetern überführt.Klopfen Sie vorsichtig auf die Küvette, um die Mischung gleichmäßig zu verteilen, und brüten Sie 10 bis 30 Minuten auf Eis. In der Zwischenzeit entfernen Sie das Medium aus einem vollständig konfluenten zuvor kultivierten ISE6-Zellkulturkolben und resuspendieren die Zellschicht, indem Sie die Zellen vorsichtig mit 1,5 Milliliter frischem Medium spülen, das Natriumbicarbonat und HEPES-Puffer enthält. Nach der Erzeugung einer homogenen Zellsuspension wird das gesamte Volumen in ein einziges steriles Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt.Als nächstes elektropolieren Sie die Rickettsia parkeri und die Plasmid-DNA-Mischung unter Verwendung eines Elektroporators. Verwenden Sie nach der Elektroporation eine sterile verlängerte Feinspitzenpipette, um eine kleine Menge der ISE6-Zellsuspension in die Küvette zu überführen, und pipetten Sie vorsichtig auf und ab, um die elektropolierte Rickettsia parkeri zurückzugewinnen. Dann wird der Inhalt der Küvette in das Zwei-Milliliter-Röhrchen überführt, das den Rest der ISE6-Zellsuspension enthält.Als nächstes zentrifugieren Sie die Probe bei Raumtemperatur, zuerst bei 700 G für zwei Minuten, um die ISE6-Zellen herunterzuziehen, und dann bei 13, 600 G für eine Minute, um die Rickettsia herunterzuziehen. Inkubieren Sie das Röhrchen bei 34 Grad Celsius für 15 Minuten bis eine Stunde. Nach der Inkubation wird der resuspendierte Inhalt einer Transformation in einen 25 Quadratzentimeter großen Zellkulturkolben mit 3,5 Milliliter frischem Medium mit Natriumbicarbonat und HEPES-Puffer überführt.Schaukeln Sie den Kolben, um die Mischung gleichmäßig zu verteilen und bei 34 Grad Celsius zu inkubieren. Nach 16 bis 24 Stunden jeweils 10 Mikroliter Spectinomycin und Streptomycin in den inkubierten Kolben geben. Schütteln Sie den Kolben, um die Antibiotika gleichmäßig in das Medium zu mischen, bevor der Kolben in den Inkubator zurückgebracht wird.Die erfolgreiche Vermehrung von Wildtyp-Rickettsia parkeri- und ISE6-Zellen wurde durch Giemsa-Färbung nachgewiesen. Die mit Giemsa dunkelviolett gefärbten Kerne der ISE6-Zellen sind sowohl im intrazellulären als auch im extrazellulären Rickettsi sichtbar. Die Transformation von Rickettsia parkeri, die das rote Fluoreszenzprotein in ISE6-Zellen exprimiert, wurde nach sieben Tagen Inkubation durch konfokale Mikroskopie bestätigt.Ein erheblicher Anstieg der Infektionsrate wurde nach 10 Tagen beobachtet. Halten Sie alles während des gesamten Verfahrens steril. Achten Sie auf Details und seien Sie geduldig, da einige Arten von Rickettsien lange brauchen, um sich zu transformieren, insbesondere langsam wachsende Endosymbionten.Dieses Protokoll hat die Untersuchung mehrerer Aspekte der Rickettsienbiologie und ihrer Interaktionen mit ihren Arthropodenvektoren und Säugetierwirten ermöglicht. Zum Beispiel wurden fluoreszierende Protein-exprimierende Rickettsi verwendet, um Motilität und Symbionten-Zeckenzell-Interaktionen zu verfolgen.

Research

JoVE Journal

Biology

An Electroporation Method to Transform Rickettsia spp. with a Fluorescent Protein-Expressing Shuttle Vector in Tick Cell Lines

Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.

Passagierung FARBEN humanen embryonalen Stammzellen-Linien mit Trypsin

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin.  Human embryonic stem cells are artifacts ...

Forschung

Biologie

Tracheotomy: A Method for Transplantation of Stem Cells to the Lung

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