Name: an electroporation method to transform rickettsia spp. with a fluorescent protein-expressing shuttle vector in tick cell lines
Uploaded: 2022-10-11T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Electroporation Method to Transform Rickettsia spp. with a Fluorescent Protein-Expressing Shuttle Vector in Tick Cell Lines at JoVE.com

Ringraziamo Timothy J. Kurtti e Benjamin Cull per le loro discussioni e suggerimenti perspicaci. Questo studio è stato sostenuto finanziariamente da una sovvenzione a U.G.M. dal NIH (2R01AI049424) e una sovvenzione a U.G.M. dalla Minnesota Agricultural Experiment Station (MIN-17-078).

1. Propagazione e purificazione di R. parkeri da coltura di cellule di zecca
NOTA: Tutte le procedure di coltura cellulare devono essere eseguite in un armadio di biosicurezza di classe II.
<ol><li>Preparazione R. parkeri-cellule di zecche infette<ol><li>Coltivare cellule ISE6 in flaconi di coltura cellulare da 25 cm2 a 34 °C in 5 ml di L15C300 medium17, integrati con siero bovino fetale (FBS) al 5%, brodo di fosfato di t...

<ol>
	<li>Gillespie, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmids+and+rickettsial+evolution:+Insight+from+Rickettsia+felis.">Plasmids and rickettsial evolution: Insight from Rickettsia felis.</a> PLoS One. 2 (3), 266 (2007).</li><li>Murray, G. G., Weinert, L. A., Rhule, E. L., Welch, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phylogeny+of+Rickettsia+using+different+evolutionary+signatures:+How+tree-like+is+bacterial+evolution.">The phylogeny of Rickettsia using different evolutionary signatures: How tree-like is bacterial evolution.</a> Systematic Biology. 65 (2), 265-279 (2016).</li><li>Parola, P., Paddock, C. D., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tick-borne+rickettsioses+around+the+world:+Emerging+diseases+challenging+old+concepts.">Tick-borne rickettsioses around the world: Emerging diseases challenging old concepts.</a> Clinical Microbiology Reviews. 18 (4), 719-756 (2005).</li><li>Fang, R., Blanton, L. S., Walker, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rickettsiae+as+emerging+infectious+agents.">Rickettsiae as emerging infectious agents.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 37 (2), 383-400 (2017).</li><li>Von Wintersdorff, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissemination+of+antimicrobial+resistance+in+microbial+ecosystems+through+horizontal+gene+transfer.">Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 173 (2016).</li><li>Winkler, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rickettsia+species+(as+organisms).">Rickettsia species (as organisms).</a> Annual Review of Microbiology. 44 (1), 131-153 (1990).</li><li>Wood, D. O., Azad, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+rickettsiae:+A+preview.">Genetic manipulation of rickettsiae: A preview.</a> Infection and Immunity. 68 (11), 6091-6093 (2000).</li><li>Perlman, S. J., Hunter, M. S., Zchori-Fein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+diversity+of+Rickettsia.">The emerging diversity of Rickettsia.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1598), 2097-2106 (2006).</li><li>McClure, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+obligate+intracellular+bacteria:+Progress,+challenges+and+paradigms.">Engineering of obligate intracellular bacteria: Progress, challenges and paradigms.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 544-558 (2017).</li><li>Rachek, L. I., Tucker, A. M., Winkler, H. H., Wood, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Rickettsia+prowazekii+to+rifampin+resistance.">Transformation of Rickettsia prowazekii to rifampin resistance.</a> Journal of Bacteriology. 180 (8), 2118-2124 (1998).</li><li>Troyer, J. M., Radulovic, S., Azad, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+in+Rickettsia+typhi+transformation.">Green fluorescent protein as a marker in Rickettsia typhi transformation.</a> Infection and Immunity. 67 (7), 3308-3311 (1996).</li><li>Kim, H. K., Premaratna, R., Missiakas, D. M., Schneewind, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rickettsia+conorii+O+antigen+is+the+target+of+bactericidal+Weil-Felix+antibodies.">Rickettsia conorii O antigen is the target of bactericidal Weil-Felix antibodies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (39), 19659-19664 (2019).</li><li>Burkhardt, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+shuttle+vectors+for+transformation+of+diverse+Rickettsia+species.">Development of shuttle vectors for transformation of diverse Rickettsia species.</a> PLoS One. 6 (12), 29511 (2011).</li><li>Welch, M. D., Reed, S. C., Lamason, R. L., Serio, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+an+epitope-tagged+virulence+protein+in+Rickettsia+parkeri+using+transposon+insertion.">Expression of an epitope-tagged virulence protein in Rickettsia parkeri using transposon insertion.</a> PloS One. 7 (5), 37310 (2012).</li><li>Oliver, J. D., Burkhardt, N. Y., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motility+characteristics+are+altered+for+Rickettsia+bellii+transformed+to+overexpress+a+heterologous+rickA+gene.">Motility characteristics are altered for Rickettsia bellii transformed to overexpress a heterologous rickA gene.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (3), 1170-1176 (2014).</li><li>Kurtti, T. J., Burkhardt, N. Y., Heu, C. C., Munderloh, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+expressing+Rickettsia+buchneri+and+Rickettsia+peacockii+for+tracking+symbiont-tick+cell+interactions.">Fluorescent protein expressing Rickettsia buchneri and Rickettsia peacockii for tracking symbiont-tick cell interactions.</a> Veterinary Sciences. 3 (4), 34 (2016).</li><li>Oliver, J. D., Ch&#225;vez, A. S., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Ixodes+scapularis+cell+line+with+a+predominantly+neuron-like+phenotype.">An Ixodes scapularis cell line with a predominantly neuron-like phenotype.</a> Experimental and Applied Acarology. 66 (3), 427-442 (2015).</li><li>Grabowski, J. M., Gulia-Nuss, M., Kuhn, R. J., Hill, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+reveals+proteins+for+metabolism+and+protein+processing+associated+with+Langat+virus+infection+in+Ixodes+scapularis+(black-legged+tick)+ISE6+cells.">RNAi reveals proteins for metabolism and protein processing associated with Langat virus infection in Ixodes scapularis (black-legged tick) ISE6 cells.</a> Parasites &amp; Vectors. 10 (1), 1-4 (2017).</li><li>Al-Rofaai, A., Bell-Sakyi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tick+cell+Lines+in+research+on+tick+control.">Tick cell Lines in research on tick control.</a> Frontiers in Physiology. 11, 152 (2020).</li><li>Wang, X. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrion-dependent+apoptosis+is+essential+for+Rickettsia+parkeri+infection+and+replication+in+vector+cells.">Mitochondrion-dependent apoptosis is essential for Rickettsia parkeri infection and replication in vector cells.</a> mSystems. 6 (2), 01209-01220 (2021).</li><li>Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+and+interpretation+of+bacterial+viability+by+using+the+LIVE/DEAD+BacLight+Kit+in+combination+with+flow+cytometry.">Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry.</a> Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).</li><li>Riley, S. P., Macaluso, K. R., Martinez, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotransformation+and+clonal+isolation+of+Rickettsia+species.">Electrotransformation and clonal isolation of Rickettsia species.</a> Current Protocols in Microbiology. 39, 1-20 (2015).</li><li>Burkhardt, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+rickettsial+host+range+for+shuttle+vectors+based+on+dnaA+and+parA+genes+from+the+pRM+plasmid+of+Rickettsia+monacensis.">Examination of rickettsial host range for shuttle vectors based on dnaA and parA genes from the pRM plasmid of Rickettsia monacensis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 88 (7), 00210-00222 (2022).</li><li>Kurtti, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rickettsia+buchneri+sp.+nov.,+a+rickettsial+endosymbiont+of+the+blacklegged+tick+Ixodes+scapularis.">Rickettsia buchneri sp. nov., a rickettsial endosymbiont of the blacklegged tick Ixodes scapularis.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, 965 (2015).</li><li>Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formulation+of+medium+for+tick+cell+culture.">Formulation of medium for tick cell culture.</a> Experimental &amp; Applied Acarology. 7 (3), 219-229 (1989).</li><li>Bell-Sakyi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cell+lines+from+the+tick+Hyalomma+anatolicum+anatolicum.">Continuous cell lines from the tick Hyalomma anatolicum anatolicum.</a> The Journal of Parasitology. 77 (6), 1006-1008 (1991).</li><li>Mattila, J. T., Burkhardt, N. Y., Hutcheson, H. J., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cell+lines+and+a+rickettsial+endosymbiont+from+the+soft+tick+Carios+capensis+(Acari:+Argasidae:+Ornithodorinae).">Isolation of cell lines and a rickettsial endosymbiont from the soft tick Carios capensis (Acari: Argasidae: Ornithodorinae).</a> Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1091-1101 (2007).</li><li>Bell-Sakyi, L., R&#367;&#382;ek, D., Gould, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+from+the+soft+tick+Ornithodoros+moubata.">Cell lines from the soft tick Ornithodoros moubata.</a> Experimental and Applied Acarology. 49 (3), 209-219 (2009).</li></ol>

Qui, dimostriamo un metodo per introdurre DNA esogeno codificato sul plasmide shuttle pRAM18dSFA nelle rickettsiae utilizzando l'elettroporazione. In questa procedura, le rickettsiae prive di cellule sono state purificate dalle cellule ospiti, trasformate con un vettore navetta rickettsial e rilasciate sulle cellule delle zecche per l'infezione. Viene inoltre descritta una procedura di immunofluorescenza confocale per rilevare R. parkeri che esprime proteine di fluorescenza rossa nelle cellule delle zecche. Meto...

Le rickettsiosi sono causate da una vasta gamma di batteri intracellulari obbligati che appartengono al genere Rickettsia (famiglia Rickettsiaceae, ordine Rickettsiales). Il genere Rickettsia è classificato in quattro gruppi principali basati sulle caratteristiche filogenetiche1,2: il gruppo della febbre maculata (SFG), che contiene quelle rickettsiae che causano le rickettsiosi trasmesse dalle zecche più gravi e fatali (ad esempio, Rickettsia rickettsii, l'agente eziologico della febbre maculata delle Montagne Rocciose), il gruppo tifo (TG, ad esempio, Rickettsia prowazekii, l'agente del tifo epidemico), il gruppo di transizione (TRG, ad esempio, Rickettsia felis, l'agente eziologico della febbre maculata trasmessa dalle pulci) e il gruppo ancestrale (AG, ad esempio, Rickettsia bellii).
Tra le più antiche malattie trasmesse da vettori conosciute, le rickettsiosi sono acquisite principalmente in seguito alla trasmissione dei patogeni attraverso i morsi di vettori di artropodi infetti, tra cui zecche, pulci, pidocchi e acari 3,4. Sebbene la scoperta di antibiotici efficaci abbia migliorato i risultati del trattamento, le rickettsiosi epidemiche emergenti e riemergenti continuano a sfidare le tradizionali strategie di prevenzione e controllo. Pertanto, una comprensione completa delle interazioni rickettsia / ospite / vettore stabilirebbe in definitiva una solida base per lo sviluppo di nuovi approcci per prevenire e curare queste antiche malattie.
In natura, il trasferimento genico orizzontale (HGT) nei batteri avviene attraverso la coniugazione, la trasduzione e la trasformazione5. La trasformazione batterica in vitro utilizza questi concetti di HGT, sebbene la natura intracellulare delle rickettsiae presenti alcune sfide. Le condizioni di crescita limitate e i sistemi di coniugazione e trasduzione poco conosciuti in diverse specie di rickettsiae hanno impedito l'applicazione di metodi di coniugazione e trasduzione nelle rickettsiae 6,7,8. Rispetto ad altri generi batterici intracellulari obbligati (ad esempio, Chlamydia, Coxiella, Anaplasma ed Ehrlichia), il genere Rickettsia differisce per quanto riguarda le strategie di crescita e replicazione all'interno del citoplasma cellulare, che impone sfide specifiche alla modificazione genetica delle rickettsiae a causa delle loro caratteristiche uniche dello stile di vita9.
L'ostacolo iniziale da superare quando si tenta la modificazione genetica delle rickettsiae è quello di ottenere una trasformazione di successo. Pertanto, progettare un approccio fattibile con un'elevata efficienza di trasformazione sarebbe estremamente prezioso per lo sviluppo di strumenti genetici per le rickettsiae. Qui, ci concentriamo sull'elettroporazione, un metodo di trasformazione ampiamente riconosciuto che è stato utilizzato per introdurre con successo il DNA esogeno in diverse specie di rickettsiae, tra cui Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii e Rickettsia buchneri10,11,12 ,13,14,15,16.
Questo articolo descrive una procedura per l'elettroporazione del ceppo di R. parkeri Tate's Hell (accession: GCA_000965145.1) con il vettore shuttle pRAM18dSFA derivato dal plasmide Rickettsia amblyommatis AaR/SC pRAM18 progettato per codificare mKATE, una proteina fluorescente di colore rosso lontano, e aadA, conferendo resistenza alla spectinomicina e alla streptomicina13,15,20. R. parkeri trasformato sono vitali e stabilmente mantenuti sotto selezione antibiotica in linee cellulari di zecche. Inoltre, dimostriamo che la localizzazione di R. parkeri trasformato in cellule di zecche vive tramite microscopia confocale può essere utilizzata per valutare la qualità dei tassi di trasformazione in linee cellulari vettoriali.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 &#956;m pore size filter&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences Whatman</td>
			<td>6783-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Luer-lock syringe&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60-90 silicon carbide grit&#160;</td>
			<td>LORTONE, inc</td>
			<td>&#160;591-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>absolute methanol&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A457-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto tryptose phosphate broth&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>260300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin centrifuge Cytospin4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A78300003</td>
			<td>The rotor is detatchable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12362</td>
			<td>used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>extended fine tip transfer pipet&#160;</td>
			<td>Perfector Scientific</td>
			<td>TP03-5301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>900-108</td>
			<td>The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2105 &#38; 165-2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Fiji</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td>raw image editing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KaryoMAX Giemsa stain&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>&#160;2021-10-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41300039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipoprotein concentrate&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>191476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Diaphot</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>epifluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Live ReadyProbes Reagent&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroff-Hausser Counting Chamber</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>&#160;Chamber 3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Vortex Genie 2</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an electroporation method to transform rickettsia spp. with a fluorescent protein-expressing shuttle vector in tick cell lines

Le rickettsiosi sono causate da una vasta gamma di batteri intracellulari obbligati appartenenti al genere Rickettsia che possono essere trasmessi agli ospiti vertebrati attraverso il morso di vettori artropodi infetti. Ad oggi, le rickettsiosi epidemiche emergenti o riemergenti rimangono un rischio per la salute pubblica a causa della difficoltà nella diagnosi, poiché i metodi diagnostici sono limitati e non standardizzati o universalmente accessibili. Una diagnosi errata derivante dalla mancanza di riconoscimento dei segni e dei sintomi può causare un trattamento antibiotico ritardato e scarsi risultati di salute. Una comprensione completa delle caratteristiche della rickettsia migliorerebbe in definitiva la diagnosi clinica, la valutazione e il trattamento con un migliore controllo e prevenzione della malattia. 
Gli studi funzionali dei geni rickettsiali sono cruciali per comprendere il loro ruolo nella patogenesi. Questo articolo descrive una procedura per l'elettroporazione del ceppo di Rickettsia parkeri Tate's Hell con il vettore shuttle pRAM18dSFA e la selezione di R. parkeri trasformato in coltura di cellule di zecca con antibiotici (spectinomicina e streptomicina). Viene anche descritto un metodo per la localizzazione di R. parkeri trasformato in cellule di zecche utilizzando la microscopia a immunofluorescenza confocale, una tecnica utile per controllare la trasformazione in linee cellulari vettoriali. Approcci simili sono adatti anche per la trasformazione di altre rickettsiae.

La morfologia di R. parkeri nelle cellule ISE6 al microscopio ottico dopo la colorazione di Giemsa è mostrata nella Figura 1. Nella Figura 2, R. parkeri trasformato che esprime la proteina di fluorescenza rossa nelle cellule ISE6 è mostrato usando la microscopia confocale. C'è un sostanziale aumento del tasso di infezione di R. parkeri trasformato (rosso) nelle cellule ISE6 (blu, corrisponde ai nuclei) da (A) giorno...

Watch this Scientific Journal Video about An Electroporation Method to Transform Rickettsia spp. with a Fluorescent Protein-Expressing Shuttle Vector in Tick Cell Lines at JoVE.com

An Electroporation Method to Transform Rickettsia spp. with a Fluorescent Protein-Expressing Shuttle Vector in Tick Cell Lines

L'elettroporazione è un metodo rapido e ampiamente adottato per introdurre DNA esogeno nel genere Rickettsia. Questo protocollo fornisce un utile metodo di elettroporazione per la trasformazione di batteri intracellulari obbligati nel genere Rickettsia.

Un metodo di elettroporazione per trasformare Rickettsia spp. con un vettore shuttle fluorescente che esprime proteine in linee cellulari di zecche

Rickettsioses are caused by a broad range of obligate intracellular bacteria belonging to the genus Rickettsia that can be transmitted to vertebrate hosts ...

Gli studi funzionali dei geni della Rickettsia sono cruciali per comprendere il loro ruolo nella patogenesi, quindi abbiamo bisogno di metodi affidabili per alterare i geni in modo controllato. Il nostro protocollo utilizza l'elettroporazione per introdurre DNA esogeno in batteri intracellulari obbligati del genere Rickettsia, permettendoci così di studiare gli effetti del DNA introdotto. A dimostrare la procedura insieme a me oggi sarà Lisa Price, una ricercatrice del Dr.Munderloh e del laboratorio del Dr.Kurtti.Per iniziare, preparare una coltura cellulare ISE6 infetta da Rickettsia parkeri dal 90 al 100% come descritto nel testo. Quindi, per determinare il tasso di infezione mediante colorazione di Giemsa, diluire la sospensione cellulare in un rapporto di 1:5 con mezzo completo e depositare 100 microlitri della sospensione cellulare su un vetrino da microscopio mediante centrifugazione a 113 G per cinque minuti. Dopo aver lasciato asciugare il vetrino all'aria, fissarlo con metanolo assoluto per cinque minuti a temperatura ambiente.Quindi, incubare il vetrino e la macchia di Giemsa per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi, sciacquare il vetrino in acqua e, una volta asciutto, visualizzarlo al microscopio ottico con obiettivi a olio. Determinare la percentuale di cellule infette contando le cellule infette e non infette.Per preparare la Rickettsia parkeri priva di cellule, versare circa 0,2 millilitri di graniglia sterile da 60 a 90 in carburo di silicio in due tubi sterili da microcentrifuga da due millilitri e mettere da parte i tubi. Da un pallone infetto da Rickettsia parkeri precedentemente inoculato contenente cinque millilitri di mezzo, rimuovere due millilitri del mezzo, facendo attenzione a non disturbare lo strato cellulare. Quindi, risospendere le celle con i restanti tre millilitri del mezzo.Dividere equamente questa sospensione tra i due tubi di graniglia di carburo di silicone preparati e vortice il tubo ad alta velocità per 30 secondi. Quindi, metterli sul ghiaccio. Quindi, preparare una siringa luer lock sterile da cinque millilitri estendendo lo stantuffo e inserire l'estremità dello stantuffo in una base di polistirene utilizzata per contenere tubi conici da 15 millilitri.Utilizzando una pipetta Pasteur barriera da due millilitri azionata con un bulbo di gomma, rimuovere con cura il surnatante delle celle del vortice senza aspirare alcuna graniglia. Quindi, inserire la punta della pipetta nell'apertura del mozzo della siringa ed espellere il contenuto nella siringa con una leggera pressione. Successivamente, filtrare la coltura di Rickettsia parkeri in tubi sterili da 1,5 millilitri attraverso un filtro sterile a due micrometri montato sul mozzo della siringa e centrifugare i tubi a 13.600 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Dopo aver rimosso il surnatante, lavare il pellet cellulare due volte con 1,2 millilitri di soluzione di saccarosio ghiacciata da 300 millimol. Centrifugare il campione e rimuovere il surnatante tra un lavaggio e l'altro. Al termine della centrifugazione, risospendere il pellet cellulare in pool con 100-150 microlitri di soluzione di saccarosio ghiacciata per due o tre campioni di trasformazione, rispettivamente.Quindi, dividere il campione in aliquote da 50 microlitri in provette da microcentrifuga sterili da 1,5 microlitri pre-refrigerate. Per la trasformazione a tre microgrammi di DNA plasmidico pRAM18sSFA privo di endotossine in ciascuna provetta contenente 50 microlitri di Rickettsia parkeri su ghiaccio e mescolare delicatamente con una punta di pipetta. Trasferire la miscela in una cuvetta di elettroporazione sterile pre-refrigerata con una dimensione dello spazio di 0,1 centimetri.Picchiettare delicatamente la cuvetta per distribuire uniformemente la miscela e incubare sul ghiaccio per 10-30 minuti. Nel frattempo, rimuovere il terreno da un pallone di coltura cellulare ISE6 completamente confluente precedentemente coltivato e risospendere lo strato cellulare risciacquando delicatamente le cellule con 1,5 millilitri di terreno fresco contenente bicarbonato di sodio e tampone HEPES. Dopo aver generato una sospensione cellulare omogenea, trasferire l'intero volume in una singola provetta da microcentrifuga sterile da due millilitri.Successivamente, elettroporare la miscela di DNA plasmidico di Rickettsia parkeri e plasmide usando un elettroporatore. Dopo l'elettroporazione, utilizzare una pipetta sterile estesa a punta fine per trasferire una piccola quantità della sospensione cellulare ISE6 nella cuvetta e pipettare delicatamente su e giù per recuperare la Rickettsia parkeri elettroporata. Quindi, trasferire il contenuto della cuvetta nel tubo da due millilitri contenente il resto della sospensione cellulare ISE6.Quindi, centrifugare il campione a temperatura ambiente, prima a 700 G per due minuti per abbattere le cellule ISE6 e poi a 13.600 G per un minuto per abbattere la Rickettsia. Incubare il tubo a 34 gradi Celsius per 15 minuti a un'ora. Dopo l'incubazione, trasferire il contenuto risospeso di una trasformazione in un matraccio di coltura cellulare di 25 centimetri quadrati contenente 3,5 millilitri di terreno fresco con bicarbonato di sodio e tampone HEPES.Agitare il matraccio per distribuire uniformemente il composto e incubare a 34 gradi Celsius. Dopo 16-24 ore, aggiungere 10 microlitri ciascuno di spectinomicina e streptomicina nel pallone incubato. Scuotere il pallone per mescolare uniformemente gli antibiotici nel mezzo prima di restituirlo all'incubatrice.La propagazione riuscita delle cellule selvatiche di Rickettsia parkeri e ISE6 è stata evidente dalla colorazione di Giemsa. Sono visibili i nuclei delle cellule ISE6 colorate di viola scuro con Giemsa nel Rickettsi intracellulare ed extracellulare. La trasformazione di Rickettsia parkeri che esprime la proteina di fluorescenza rossa nelle cellule ISE6 è stata confermata dalla microscopia confocale dopo sette giorni di incubazione.Un sostanziale aumento del tasso di infezione è stato osservato dopo 10 giorni. Mantenere tutto sterile durante l'intera procedura. Presta attenzione ai dettagli e sii paziente, poiché alcune specie di Rickettsia impiegano molto tempo per trasformarsi, in particolare gli endosimbionti a crescita lenta.Questo protocollo ha permesso lo studio di molteplici aspetti della biologia della Rickettsia e delle loro interazioni con i loro vettori artropodi e gli ospiti dei mammiferi. Ad esempio, Rickettsi fluorescente che esprime proteine sono state utilizzate per tracciare la motilità e le interazioni delle cellule di zecca simbionti.

Research

JoVE Journal

Biology

An Electroporation Method to Transform Rickettsia spp. with a Fluorescent Protein-Expressing Shuttle Vector in Tick Cell Lines

Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.

RIFLESSI Passaging sulle cellule staminali embrionali umane-linee con tripsina

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin.  Human embryonic stem cells are artifacts ...

Ricerca

Biologia

Tracheotomy: A Method for Transplantation of Stem Cells to the Lung

Tracheotomia: Un metodo per il trapianto di cellule staminali al polmone

Lung disease is a leading cause of death and likely to become an epidemic given increases in pollution and smoking worldwide. Advances in stem cell ...

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

In elettroporazione in vivo ed ex utero per l&#39;espressione genica in cellule gangliari della retina del mouse

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Utilizzando il sistema di elettroporazione Gene Pulser MXcell per trasfettare cellule primarie con alta efficienza

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Riprogrammare cellule somatiche umane in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) Utilizzo vettore retrovirale con GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

Una guida al moderno Quantitative Fluorescent Western Blotting con strategie di risoluzione dei problemi

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation

Internalizzazione e di osservazione di Fluorescent Biomolecole in Living microrganismi via elettroporazione

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing ...

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

Metodo per la misurazione dell&#39;attività di Deubiquitinating enzimi in linee di cellule e tessuti Campioni

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

Confronto di tre diversi metodi per la determinazione proliferazione cellulare in Breast Cancer linee cellulari

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

Un metodo efficiente In Vitro trasposizione da un sistema di bellezza dormire trascrizionalmente regolata confezionato in un vettore lentivirale difettoso di integrazione

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB ...