Name: an electroporation method to transform rickettsia spp. with a fluorescent protein-expressing shuttle vector in tick cell lines
Uploaded: 2022-10-11T14:20:00
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통찰력 있는 토론과 제안에 대해 Timothy J. Kurtti와 Benjamin Cull에게 감사드립니다. 이 연구는 NIH (2R01AI049424)의 U.G.M.에 대한 보조금과 미네소타 농업 실험소 (MIN-17-078)의 U.G.M. 보조금으로 재정적으로 지원되었습니다.

1. 진드기 세포 배양에서 R. parkeri 의 번식 및 정제
참고: 모든 세포 배양 절차는 클래스 II 생물안전 캐비닛에서 수행해야 합니다.
<ol><li>준비 R. parkeri-감염된 진드기 세포<ol><li>5% 소 태아 혈청(FBS), 5% 트립토스 인산염 액체(TPB) 및 0.1% 지단백질 농축액(LPC)이 보충된 L15C300 배지17 5mL에서 34°C의25cm2 세포 배양 플라스크에서 ISE6 ?...

<ol>
	<li>Gillespie, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmids+and+rickettsial+evolution:+Insight+from+Rickettsia+felis.">Plasmids and rickettsial evolution: Insight from Rickettsia felis.</a> PLoS One. 2 (3), 266 (2007).</li><li>Murray, G. G., Weinert, L. A., Rhule, E. L., Welch, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phylogeny+of+Rickettsia+using+different+evolutionary+signatures:+How+tree-like+is+bacterial+evolution.">The phylogeny of Rickettsia using different evolutionary signatures: How tree-like is bacterial evolution.</a> Systematic Biology. 65 (2), 265-279 (2016).</li><li>Parola, P., Paddock, C. D., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tick-borne+rickettsioses+around+the+world:+Emerging+diseases+challenging+old+concepts.">Tick-borne rickettsioses around the world: Emerging diseases challenging old concepts.</a> Clinical Microbiology Reviews. 18 (4), 719-756 (2005).</li><li>Fang, R., Blanton, L. S., Walker, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rickettsiae+as+emerging+infectious+agents.">Rickettsiae as emerging infectious agents.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 37 (2), 383-400 (2017).</li><li>Von Wintersdorff, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissemination+of+antimicrobial+resistance+in+microbial+ecosystems+through+horizontal+gene+transfer.">Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 173 (2016).</li><li>Winkler, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rickettsia+species+(as+organisms).">Rickettsia species (as organisms).</a> Annual Review of Microbiology. 44 (1), 131-153 (1990).</li><li>Wood, D. O., Azad, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+rickettsiae:+A+preview.">Genetic manipulation of rickettsiae: A preview.</a> Infection and Immunity. 68 (11), 6091-6093 (2000).</li><li>Perlman, S. J., Hunter, M. S., Zchori-Fein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+diversity+of+Rickettsia.">The emerging diversity of Rickettsia.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1598), 2097-2106 (2006).</li><li>McClure, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+obligate+intracellular+bacteria:+Progress,+challenges+and+paradigms.">Engineering of obligate intracellular bacteria: Progress, challenges and paradigms.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 544-558 (2017).</li><li>Rachek, L. I., Tucker, A. M., Winkler, H. H., Wood, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Rickettsia+prowazekii+to+rifampin+resistance.">Transformation of Rickettsia prowazekii to rifampin resistance.</a> Journal of Bacteriology. 180 (8), 2118-2124 (1998).</li><li>Troyer, J. M., Radulovic, S., Azad, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+in+Rickettsia+typhi+transformation.">Green fluorescent protein as a marker in Rickettsia typhi transformation.</a> Infection and Immunity. 67 (7), 3308-3311 (1996).</li><li>Kim, H. K., Premaratna, R., Missiakas, D. M., Schneewind, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rickettsia+conorii+O+antigen+is+the+target+of+bactericidal+Weil-Felix+antibodies.">Rickettsia conorii O antigen is the target of bactericidal Weil-Felix antibodies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (39), 19659-19664 (2019).</li><li>Burkhardt, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+shuttle+vectors+for+transformation+of+diverse+Rickettsia+species.">Development of shuttle vectors for transformation of diverse Rickettsia species.</a> PLoS One. 6 (12), 29511 (2011).</li><li>Welch, M. D., Reed, S. C., Lamason, R. L., Serio, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+an+epitope-tagged+virulence+protein+in+Rickettsia+parkeri+using+transposon+insertion.">Expression of an epitope-tagged virulence protein in Rickettsia parkeri using transposon insertion.</a> PloS One. 7 (5), 37310 (2012).</li><li>Oliver, J. D., Burkhardt, N. Y., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. 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F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Ixodes+scapularis+cell+line+with+a+predominantly+neuron-like+phenotype.">An Ixodes scapularis cell line with a predominantly neuron-like phenotype.</a> Experimental and Applied Acarology. 66 (3), 427-442 (2015).</li><li>Grabowski, J. M., Gulia-Nuss, M., Kuhn, R. J., Hill, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+reveals+proteins+for+metabolism+and+protein+processing+associated+with+Langat+virus+infection+in+Ixodes+scapularis+(black-legged+tick)+ISE6+cells.">RNAi reveals proteins for metabolism and protein processing associated with Langat virus infection in Ixodes scapularis (black-legged tick) ISE6 cells.</a> Parasites &amp; Vectors. 10 (1), 1-4 (2017).</li><li>Al-Rofaai, A., Bell-Sakyi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tick+cell+Lines+in+research+on+tick+control.">Tick cell Lines in research on tick control.</a> Frontiers in Physiology. 11, 152 (2020).</li><li>Wang, X. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrion-dependent+apoptosis+is+essential+for+Rickettsia+parkeri+infection+and+replication+in+vector+cells.">Mitochondrion-dependent apoptosis is essential for Rickettsia parkeri infection and replication in vector cells.</a> mSystems. 6 (2), 01209-01220 (2021).</li><li>Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+and+interpretation+of+bacterial+viability+by+using+the+LIVE/DEAD+BacLight+Kit+in+combination+with+flow+cytometry.">Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry.</a> Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).</li><li>Riley, S. P., Macaluso, K. R., Martinez, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotransformation+and+clonal+isolation+of+Rickettsia+species.">Electrotransformation and clonal isolation of Rickettsia species.</a> Current Protocols in Microbiology. 39, 1-20 (2015).</li><li>Burkhardt, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+rickettsial+host+range+for+shuttle+vectors+based+on+dnaA+and+parA+genes+from+the+pRM+plasmid+of+Rickettsia+monacensis.">Examination of rickettsial host range for shuttle vectors based on dnaA and parA genes from the pRM plasmid of Rickettsia monacensis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 88 (7), 00210-00222 (2022).</li><li>Kurtti, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rickettsia+buchneri+sp.+nov.,+a+rickettsial+endosymbiont+of+the+blacklegged+tick+Ixodes+scapularis.">Rickettsia buchneri sp. nov., a rickettsial endosymbiont of the blacklegged tick Ixodes scapularis.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, 965 (2015).</li><li>Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formulation+of+medium+for+tick+cell+culture.">Formulation of medium for tick cell culture.</a> Experimental &amp; Applied Acarology. 7 (3), 219-229 (1989).</li><li>Bell-Sakyi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cell+lines+from+the+tick+Hyalomma+anatolicum+anatolicum.">Continuous cell lines from the tick Hyalomma anatolicum anatolicum.</a> The Journal of Parasitology. 77 (6), 1006-1008 (1991).</li><li>Mattila, J. T., Burkhardt, N. Y., Hutcheson, H. J., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cell+lines+and+a+rickettsial+endosymbiont+from+the+soft+tick+Carios+capensis+(Acari:+Argasidae:+Ornithodorinae).">Isolation of cell lines and a rickettsial endosymbiont from the soft tick Carios capensis (Acari: Argasidae: Ornithodorinae).</a> Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1091-1101 (2007).</li><li>Bell-Sakyi, L., R&#367;&#382;ek, D., Gould, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+from+the+soft+tick+Ornithodoros+moubata.">Cell lines from the soft tick Ornithodoros moubata.</a> Experimental and Applied Acarology. 49 (3), 209-219 (2009).</li></ol>

여기에서는 전기 천공을 사용하여 셔틀 플라스미드 pRAM18dSFA에 암호화된 외인성 DNA를 리케차에 도입하는 방법을 시연합니다. 이 절차에서, 무세포 리케차는 숙주 세포로부터 정제되고, 리케차 셔틀 벡터로 형질전환되고, 감염을 위해 진드기 세포 상으로 방출되었다. 또한 진드기 세포에서 적색 형광 단백질 발현 R. parkeri 를 검출하기 위한 공초점 면역형광 절차가 설명되어 있습니다. 유사한...

리케차증은 리케차 (Rickettsiaceae 가족, 리케차 시알 레스 주문)에 속하는 광범위한 절대 세포 내 박테리아에 의해 발생합니다. Rickettsia 속은 계통 발생 특성1,2에 따라 4 개의 주요 그룹으로 분류됩니다 : 가장 심각하고 치명적인 진드기 매개 리케차증을 유발하는 리케차(예: Rickettsia rickettsii, 로키 산 홍반열의 원인균), 발진티푸스 그룹(TG, 예: Rickettsia prowazekii, 유행성 발진티푸스의 대리인), 과도기 그룹 (TRG, 예 : 리케차 펠리스, 벼룩 매개 홍 반열의 원인균) 및 조상 그룹 (AG, 예 : 리케차 벨리).
가장 오래된 알려진 벡터 매개 질병 중 리케차증은 주로 진드기, 벼룩, 이 및 진드기를 포함한 감염된 절지동물 벡터의 물기를 통해 병원체가 전염된 후 획득됩니다3,4. 효과적인 항생제의 발견으로 치료 결과가 개선되었지만 새롭게 등장하고 다시 등장하는 전염병 리케차증은 전통적인 예방 및 통제 전략에 계속 도전하고 있습니다. 따라서 리케차/숙주/벡터 상호 작용에 대한 포괄적인 이해는 궁극적으로 이러한 고대 질병을 예방하고 치료하기 위한 새로운 접근 방식을 개발하기 위한 강력한 기반을 구축할 것입니다.
자연에서 박테리아의 수평 유전자 전달 (HGT)은 접합, 형질 도입 및 형질 전환5을 통해 발생합니다. 시험관 내 박테리아 형질전환은 이러한 HGT 개념을 활용하지만 리케차의 세포 내 특성에는 몇 가지 문제가 있습니다. 리케차의 다른 종에서 제한된 성장 조건과 잘 이해되지 않은 접합 및 형질 도입 시스템은 리케차 6,7,8에서 접합 및 형질 도입 방법의 적용을 방해했습니다. 다른 절대 세포 내 박테리아 속 (예 : 클라미디아, 콕시 엘라, 아나 플라스마 및 에를리키아)과 비교하여 Rickettsia 속은 세포질 내의 성장 및 복제 전략과 관련하여 다르며, 이는 독특한 생활 방식으로 인해 리케차의 유전자 변형에 특정 문제를 부과합니다9.
리케차의 유전자 변형을 시도 할 때 극복해야 할 초기 장애물은 성공적인 형질 전환을 달성하는 것입니다. 따라서 높은 형질 전환 효율로 실현 가능한 접근법을 설계하는 것은 리케차에 대한 유전 도구를 개발하는 데 매우 중요합니다. 여기에서는 리케차 프로와제키, 리케차 티피, 리케차 코노리, 리케차 파케리, 리케차 몬타넨시스, 리케차 벨리, 리케차 공작, 리케차 부흐네리를 포함한 여러 종의 리케차에 외인성 DNA를 성공적으로 도입하는 데 사용된 널리 알려진 형질전환 방법인 전기천공에 중점을 둡니다. 10,11,12 ,13,14,15,16.
이 논문은 원적색 형광 단백질인 mKATE와 스펙티노마이신 및 스트렙토마이신 내성13,15,20을 부여하도록 설계된 리케차 약시 균주 AaR/SC 플라스미드 pRAM18에서 파생된 셔틀 벡터 pRAM18dSFA를 사용하여 R. parkeri 균주 Tate's Hell(기탁: GCA_000965145.1)의 전기천공 절차를 설명합니다. 형질전환된 R. 파케리는 진드기 세포주에서 항생제 선택 하에 생존 가능하고 안정적으로 유지된다. 또한 컨포칼 현미경을 통해 살아있는 진드기 세포에서 형질전환된 R. parkeri의 국소화를 사용하여 벡터 세포주의 형질전환 속도를 평가할 수 있음을 보여줍니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 &#956;m pore size filter&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences Whatman</td>
			<td>6783-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Luer-lock syringe&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60-90 silicon carbide grit&#160;</td>
			<td>LORTONE, inc</td>
			<td>&#160;591-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>absolute methanol&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A457-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto tryptose phosphate broth&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>260300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin centrifuge Cytospin4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A78300003</td>
			<td>The rotor is detatchable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12362</td>
			<td>used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>extended fine tip transfer pipet&#160;</td>
			<td>Perfector Scientific</td>
			<td>TP03-5301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>900-108</td>
			<td>The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2105 &#38; 165-2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Fiji</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td>raw image editing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KaryoMAX Giemsa stain&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>&#160;2021-10-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41300039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipoprotein concentrate&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>191476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Diaphot</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>epifluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Live ReadyProbes Reagent&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroff-Hausser Counting Chamber</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>&#160;Chamber 3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Vortex Genie 2</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an electroporation method to transform rickettsia spp. with a fluorescent protein-expressing shuttle vector in tick cell lines

리케차증은 감염된 절지 동물 벡터의 물기를 통해 척추 동물 숙주로 전염 될 수있는 Rickettsia 속에 속하는 광범위한 절대 세포 내 박테리아에 의해 발생합니다. 현재까지 신흥 또는 재출현 유행성 리케차증은 진단 방법이 제한적이고 표준화되거나 보편적으로 접근 할 수 없기 때문에 진단의 어려움으로 인해 공중 보건 위험으로 남아 있습니다. 징후와 증상에 대한 인식 부족으로 인한 오진은 항생제 치료가 지연되고 건강 결과가 좋지 않을 수 있습니다. 리케차 특성에 대한 포괄적 인 이해는 궁극적으로 질병의 통제 및 예방을 개선하여 임상 진단, 평가 및 치료를 향상시킬 것입니다. 
리케차 유전자의 기능 연구는 병인에서의 역할을 이해하는 데 중요합니다. 이 논문은 셔틀 벡터 pRAM18dSFA를 사용하여 리케차 파케리 균주 테이트 헬의 전기천공법과 항생제(스펙티노마이신 및 스트렙토마이신)를 사용한 진드기 세포 배양에서 형질전환된 R. 파케리 의 선택을 위한 절차를 설명합니다 . 벡터 세포주에서 형질전환을 확인하는 데 유용한 기술인 공초점 면역형광 현미경을 사용하여 진드기 세포에서 형질전환된 R. parkeri 의 국소화에 대한 방법도 설명합니다. 유사한 접근법이 다른 리케차의 변형에도 적합합니다.

Giemsa 염색 후 광학 현미경으로 ISE6 세포에서 R. parkeri의 형태를 도 1에 나타내었다. 도 2에서, ISE6 세포에서 적색 형광 단백질을 발현하는 형질전환된 R. parkeri를 공초점 현미경을 사용하여 나타내었다. (A) 배양 7일째부터 (B) 10일째까지 ISE6 세포(청색, 핵에 해당)에서 형질전환된 R. 파케리(적색)의 감염률이 실?...

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An Electroporation Method to Transform Rickettsia spp. with a Fluorescent Protein-Expressing Shuttle Vector in Tick Cell Lines

전기 천공은 Rickettsia 속에 외인성 DNA를 도입하기 위해 빠르고 광범위하게 채택 된 방법입니다. 이 프로토콜은 Rickettsia 속의 절대 세포 내 박테리아의 형질 전환에 유용한 전기 천공 방법을 제공합니다.

Rickettsia spp.를 Tick 세포주에서 형광 단백질 발현 셔틀 벡터로 형질전환하기 위한 전기천공 방법

Rickettsioses are caused by a broad range of obligate intracellular bacteria belonging to the genus Rickettsia that can be transmitted to vertebrate hosts ...

리케차 유전자의 기능적 연구는 병인에서의 역할을 이해하는 데 중요하므로 통제 된 방식으로 유전자를 변경하는 신뢰할 수있는 방법이 필요합니다. 우리의 프로토콜은 전기 천공을 사용하여 Rickettsia 속의 절대 세포 내 박테리아에 외인성 DNA를 도입하여 도입 된 DNA의 효과를 연구 할 수 있습니다. 오늘 저와 함께 절차를 시연하는 것은 Munderloh 박사와 Kurtti 박사의 실험실의 연구원 인 Lisa Price입니다.시작하려면, 본문에 기재된 바와 같이 90 내지 100%리케차 파케리-감염된 ISE6 세포 배양물을 준비한다. 이어서, Giemsa 염색에 의한 감염 속도를 결정하기 위해, 세포 현탁액을 완전 배지와 1:5의 비율로 희석하고, 100 마이크로리터의 세포 현탁액을 113 G에서 5분 동안 원심분리하여 유리 현미경 슬라이드 상에 침착시킨다. 슬라이드를 자연 건조시킨 후, 이를 무수 메탄올로 실온에서 5분 동안 고정시킨다.이어서, 슬라이드를 배양하고 섭씨 37도에서 30분 동안 김사 염색한다. 그런 다음 슬라이드를 물로 헹구고 건조되면 오일 대물 렌즈가있는 광학 현미경으로 봅니다. 감염된 세포와 감염되지 않은 세포를 세어 감염된 세포의 백분율을 결정합니다.무세포 리케차 파케리를 제조하기 위해, 약 0.2 밀리리터의 멸균 60 내지 90 실리콘 카바이드 그릿을 2개의 2밀리리터 멸균 마이크로원심분리 튜브에 붓고 튜브를 따로 보관한다. 5 밀리리터의 배지가 들어있는 이전에 접종 된 Rickettsia parkeri 감염 플라스크에서 세포층을 방해하지 않도록주의하면서 2 밀리리터의 배지를 제거합니다. 그런 다음 나머지 3 밀리리터의 배지로 세포를 재현탁하십시오.이 현탁액을 준비된 두 개의 실리콘 카바이드 그릿 튜브 사이에 균등하게 나누고 튜브를 30초 동안 고속으로 와동시킵니다. 그런 다음 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 플런저를 연장하여 멸균 된 5 밀리리터 루어 잠금 주사기를 준비하고 플런저 끝을 15 밀리리터 원추형 튜브를 고정하는 데 사용되는 폴리스티렌베이스에 삽입합니다.고무 전구로 작동하는 장벽 2 밀리리터 파스퇴르 피펫을 사용하여 모래를 흡인하지 않고 와류 세포의 상층액을 조심스럽게 제거하십시오. 그런 다음 피펫 팁을 주사기 허브 입구에 삽입하고 내용물을 부드러운 압력으로 주사기에 배출합니다. 다음으로, 리케차 파케리 배양물을 주사기 허브에 장착된 멸균 2마이크로미터 공극 크기 필터를 통해 멸균 1.5밀리리터 튜브에 여과하고 섭씨 4도에서 5분 동안 튜브를 13, 600G으로 원심분리합니다.상청액을 제거한 후, 세포 펠릿을 1.2 밀리리터의 300 밀리몰 얼음-차가운 자당 용액으로 2 회 세척한다. 샘플을 원심분리하고 세척 사이에 상청액을 제거합니다. 원심분리가 끝나면 풀링된 세포 펠릿을 각각 2 내지 3개의 형질전환 샘플에 대해 100 내지 150 마이크로리터의 빙냉 자당 용액으로 재현탁시킨다.그런 다음 샘플을 사전 냉각된 멸균 1.5마이크로리터 마이크로원심분리 튜브에서 50마이크로리터 분취량으로 나눕니다. 3마이크로그램의 내독소가 없는 pRAM18sSFA 플라스미드 DNA를 얼음 위의 리케차 파케리 50마이크로리터가 들어 있는 각 튜브에 형질전환하고 피펫 팁으로 부드럽게 저어줍니다. 혼합물을 0.1cm 간격 크기의 사전 냉각 멸균 전기 천공 큐벳으로 옮깁니다.큐벳을 부드럽게 두드려 혼합물을 고르게 분배하고 얼음 위에서 10-30분 동안 배양합니다. 한편, 완전히 합류한 이전에 배양된 ISE6 세포 배양 플라스크에서 배지를 제거하고 중탄산나트륨 및 HEPES 완충액을 포함하는 1.5밀리리터의 신선한 배지로 세포를 부드럽게 헹구어 세포층을 재현탁시킵니다. 균질한 세포 현탁액을 생성한 후, 전체 부피를 단일 멸균 2밀리리터 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다.다음으로, 리케차 파케리 및 플라스미드 DNA 혼합물을 전기천공기를 사용하여 전기천공한다. 전기천공 후 멸균 확장 파인팁 피펫을 사용하여 소량의 ISE6 세포 현탁액을 큐벳으로 옮기고 위아래로 부드럽게 피펫하여 전기천공된 리케차 파케리를 회수합니다. 그런 다음 큐벳의 내용물을 ISE6 세포 현탁액의 나머지 부분을 포함하는 2밀리리터 튜브로 옮깁니다.다음으로, 샘플을 실온에서 원심분리하고, 먼저 700G에서 2분 동안 ISE6 세포를 풀다운한 다음, 13, 600G에서 1분 동안 리케차를, 리케차를, 풀다운한다. 튜브를 섭씨 34도에서 15 분에서 1 시간 동안 배양하십시오. 배양 후, 하나의 형질전환의 재현탁된 내용물을 중탄산나트륨 및 HEPES 완충액이 있는 3.5ml의 신선한 배지를 포함하는 하나의 25제곱센티미터 세포 배양 플라스크로 옮깁니다.플라스크를 흔들어 혼합물을 고르게 펴고 섭씨 34도에서 배양합니다. 16 내지 24시간 후, 스펙티노마이신 및 스트렙토마이신을 각각 10 마이크로리터씩 인큐베이션된 플라스크에 첨가한다. 플라스크를 흔들어 항생제를 배지에 고르게 혼합한 후 플라스크를 인큐베이터로 되돌립니다.야생형 리케차 파케리 및 ISE6 세포의 성공적인 증식은 Giemsa 염색에 의해 명백하였다. 세포 내 및 세포 외 리케치에서 Giemsa와 함께 짙은 보라색으로 염색 된 ISE6 세포의 핵이 보입니다. ISE6 세포에서 적색 형광 단백질을 발현하는 리케차 파케리의 형질전환은 배양 7일 후 공초점 현미경으로 확인하였다.감염률의 실질적인 증가는 10 일 후에 관찰되었다. 전체 절차 중에 모든 것을 멸균 상태로 유지하십시오. 리케차의 일부 종은 변형하는 데 오랜 시간이 걸리며, 특히 느리게 성장하는 내 공생체는 세부 사항에주의를 기울이고 인내심을 가지십시오.이 프로토콜은 리케차 생물학의 여러 측면과 절지 동물 벡터 및 포유류 숙주와의 상호 작용에 대한 연구를 가능하게했습니다. 예를 들어, 형광 단백질 발현 리케시는 운동성 및 공생 진드기 세포 상호작용을 추적하기 위해 사용되어 왔다.

Research

JoVE Journal

Biology

An Electroporation Method to Transform Rickettsia spp. with a Fluorescent Protein-Expressing Shuttle Vector in Tick Cell Lines

Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.

트립신과 Passaging 색채 인간의 배아 줄기 세포 - 라인

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin.  Human embryonic stem cells are artifacts ...

연구

생물학

Tracheotomy: A Method for Transplantation of Stem Cells to the Lung

기관 절개술 : 폐에 줄기 세포의 이식을위한 방법

Lung disease is a leading cause of death and likely to become an epidemic given increases in pollution and smoking worldwide. Advances in stem cell ...

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

마우스 망막 신경절 세포의 유전자 발현에 대한 utero 및 전직 생체내의 Electroporation에

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

고효율 기본 셀을 Transfect하는 진 Pulser Electroporation MXcell의 시스템을 사용하여

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

GFP와 Retroviral 벡터를 사용하여 유도 Pluripotent 줄기 세포 (iPSCs)로 인간 체세포를 프로그래밍

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

문제 해결 전략 현대 양적 형광 웨스턴 블로 팅에 가이드

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

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일렉트로을 통해 생활 미생물의 국제화 및 형광 생체 분자의 관측

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing ...

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

세포주 및 조직 샘플에서 Deubiquitinating 효소의 활성을 측정 방법

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

유방암 세포주에서 세포 증식을 결정하기위한 세 가지 방법 비교

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

효율적인 체 외에서 이항 메서드인 Transcriptionally 규제 자 아름다움 시스템 통합 결함이 Lentiviral 벡터에 포장 하 여

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB ...