Name: an electroporation method to transform rickettsia spp. with a fluorescent protein-expressing shuttle vector in tick cell lines
Uploaded: 2022-10-11T14:20:00
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Agradecemos a Timothy J. Kurtti e Benjamin Cull por suas discussões e sugestões perspicazes. Este estudo foi apoiado financeiramente por uma doação para a U.G.M. do NIH (2R01AI049424) e uma subvenção para a U.G.M. da Minnesota Agricultural Experiment Station (MIN-17-078).

1. Propagação e purificação de R. parkeri a partir de cultura de células de carrapatos
NOTA: Todos os procedimentos de cultura de células devem ser realizados em um gabinete de biossegurança de classe II.
<ol><li>Preparando R. parkeri-células de carrapatos infectadas<ol><li>Cultivar células ISE6 em frascos de cultura celular de25 cm 2 a 34 °C em 5 mL de L15C300 em meio17, suplementado com 5% de soro fetal bovino ...

<ol>
	<li>Gillespie, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmids+and+rickettsial+evolution:+Insight+from+Rickettsia+felis.">Plasmids and rickettsial evolution: Insight from Rickettsia felis.</a> PLoS One. 2 (3), 266 (2007).</li><li>Murray, G. G., Weinert, L. A., Rhule, E. L., Welch, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phylogeny+of+Rickettsia+using+different+evolutionary+signatures:+How+tree-like+is+bacterial+evolution.">The phylogeny of Rickettsia using different evolutionary signatures: How tree-like is bacterial evolution.</a> Systematic Biology. 65 (2), 265-279 (2016).</li><li>Parola, P., Paddock, C. D., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tick-borne+rickettsioses+around+the+world:+Emerging+diseases+challenging+old+concepts.">Tick-borne rickettsioses around the world: Emerging diseases challenging old concepts.</a> Clinical Microbiology Reviews. 18 (4), 719-756 (2005).</li><li>Fang, R., Blanton, L. S., Walker, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rickettsiae+as+emerging+infectious+agents.">Rickettsiae as emerging infectious agents.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 37 (2), 383-400 (2017).</li><li>Von Wintersdorff, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissemination+of+antimicrobial+resistance+in+microbial+ecosystems+through+horizontal+gene+transfer.">Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 173 (2016).</li><li>Winkler, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rickettsia+species+(as+organisms).">Rickettsia species (as organisms).</a> Annual Review of Microbiology. 44 (1), 131-153 (1990).</li><li>Wood, D. O., Azad, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+rickettsiae:+A+preview.">Genetic manipulation of rickettsiae: A preview.</a> Infection and Immunity. 68 (11), 6091-6093 (2000).</li><li>Perlman, S. J., Hunter, M. S., Zchori-Fein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+diversity+of+Rickettsia.">The emerging diversity of Rickettsia.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1598), 2097-2106 (2006).</li><li>McClure, E. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+shuttle+vectors+for+transformation+of+diverse+Rickettsia+species.">Development of shuttle vectors for transformation of diverse Rickettsia species.</a> PLoS One. 6 (12), 29511 (2011).</li><li>Welch, M. D., Reed, S. C., Lamason, R. L., Serio, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+an+epitope-tagged+virulence+protein+in+Rickettsia+parkeri+using+transposon+insertion.">Expression of an epitope-tagged virulence protein in Rickettsia parkeri using transposon insertion.</a> PloS One. 7 (5), 37310 (2012).</li><li>Oliver, J. D., Burkhardt, N. Y., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motility+characteristics+are+altered+for+Rickettsia+bellii+transformed+to+overexpress+a+heterologous+rickA+gene.">Motility characteristics are altered for Rickettsia bellii transformed to overexpress a heterologous rickA gene.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (3), 1170-1176 (2014).</li><li>Kurtti, T. J., Burkhardt, N. Y., Heu, C. C., Munderloh, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+expressing+Rickettsia+buchneri+and+Rickettsia+peacockii+for+tracking+symbiont-tick+cell+interactions.">Fluorescent protein expressing Rickettsia buchneri and Rickettsia peacockii for tracking symbiont-tick cell interactions.</a> Veterinary Sciences. 3 (4), 34 (2016).</li><li>Oliver, J. D., Ch&#225;vez, A. S., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Ixodes+scapularis+cell+line+with+a+predominantly+neuron-like+phenotype.">An Ixodes scapularis cell line with a predominantly neuron-like phenotype.</a> Experimental and Applied Acarology. 66 (3), 427-442 (2015).</li><li>Grabowski, J. M., Gulia-Nuss, M., Kuhn, R. J., Hill, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+reveals+proteins+for+metabolism+and+protein+processing+associated+with+Langat+virus+infection+in+Ixodes+scapularis+(black-legged+tick)+ISE6+cells.">RNAi reveals proteins for metabolism and protein processing associated with Langat virus infection in Ixodes scapularis (black-legged tick) ISE6 cells.</a> Parasites &amp; Vectors. 10 (1), 1-4 (2017).</li><li>Al-Rofaai, A., Bell-Sakyi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tick+cell+Lines+in+research+on+tick+control.">Tick cell Lines in research on tick control.</a> Frontiers in Physiology. 11, 152 (2020).</li><li>Wang, X. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrion-dependent+apoptosis+is+essential+for+Rickettsia+parkeri+infection+and+replication+in+vector+cells.">Mitochondrion-dependent apoptosis is essential for Rickettsia parkeri infection and replication in vector cells.</a> mSystems. 6 (2), 01209-01220 (2021).</li><li>Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+and+interpretation+of+bacterial+viability+by+using+the+LIVE/DEAD+BacLight+Kit+in+combination+with+flow+cytometry.">Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry.</a> Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).</li><li>Riley, S. P., Macaluso, K. R., Martinez, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotransformation+and+clonal+isolation+of+Rickettsia+species.">Electrotransformation and clonal isolation of Rickettsia species.</a> Current Protocols in Microbiology. 39, 1-20 (2015).</li><li>Burkhardt, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+rickettsial+host+range+for+shuttle+vectors+based+on+dnaA+and+parA+genes+from+the+pRM+plasmid+of+Rickettsia+monacensis.">Examination of rickettsial host range for shuttle vectors based on dnaA and parA genes from the pRM plasmid of Rickettsia monacensis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 88 (7), 00210-00222 (2022).</li><li>Kurtti, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rickettsia+buchneri+sp.+nov.,+a+rickettsial+endosymbiont+of+the+blacklegged+tick+Ixodes+scapularis.">Rickettsia buchneri sp. nov., a rickettsial endosymbiont of the blacklegged tick Ixodes scapularis.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, 965 (2015).</li><li>Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formulation+of+medium+for+tick+cell+culture.">Formulation of medium for tick cell culture.</a> Experimental &amp; Applied Acarology. 7 (3), 219-229 (1989).</li><li>Bell-Sakyi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cell+lines+from+the+tick+Hyalomma+anatolicum+anatolicum.">Continuous cell lines from the tick Hyalomma anatolicum anatolicum.</a> The Journal of Parasitology. 77 (6), 1006-1008 (1991).</li><li>Mattila, J. T., Burkhardt, N. Y., Hutcheson, H. J., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cell+lines+and+a+rickettsial+endosymbiont+from+the+soft+tick+Carios+capensis+(Acari:+Argasidae:+Ornithodorinae).">Isolation of cell lines and a rickettsial endosymbiont from the soft tick Carios capensis (Acari: Argasidae: Ornithodorinae).</a> Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1091-1101 (2007).</li><li>Bell-Sakyi, L., R&#367;&#382;ek, D., Gould, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+from+the+soft+tick+Ornithodoros+moubata.">Cell lines from the soft tick Ornithodoros moubata.</a> Experimental and Applied Acarology. 49 (3), 209-219 (2009).</li></ol>

Aqui, demonstramos um método para introduzir DNA exógeno codificado no plasmídeo pRAM18dSFA em rickettsias usando eletroporação. Neste procedimento, as rickettsias livres de células foram purificadas a partir de células hospedeiras, transformadas com um vetor de transporte de rickettsias e liberadas em células de carrapatos para infecção. Também é descrito um procedimento de imunofluorescência confocal para detectar R. parkeri que expressa proteína de fluorescência vermelha em células de carrapat...

Rickettsioses são causadas por uma ampla gama de bactérias intracelulares obrigatórias que pertencem ao gênero Rickettsia (família Rickettsiaceae, ordem Rickettsiales). O gênero Rickettsia é classificado em quatro grupos principais com base em características filogenéticas1,2: o grupo da febre maculosa (SFG), que contém as rickettsias que causam as rickettsioses transmitidas por carrapatos mais graves e fatais (por exemplo, Rickettsia rickettsii, o agente causador da febre maculosa das Montanhas Rochosas), o grupo do tifo (TG, por exemplo, Rickettsia prowazekii, o agente do tifo epidêmico), o grupo de transição (TRG, por exemplo, Rickettsia felis, o agente causador da febre maculosa transmitida por pulgas) e o grupo ancestral (AG, por exemplo, Rickettsia bellii). 
Entre as mais antigas doenças transmitidas por vetores conhecidas, as rickettsioses são adquiridas principalmente após a transmissão dos patógenos através das picadas de vetores artrópodes infectados, incluindo carrapatos, pulgas, piolhos e ácaros 3,4. Embora a descoberta de antibióticos eficazes tenha melhorado os resultados do tratamento, as rickettsioses epidêmicas emergentes e reemergentes continuam a desafiar as estratégias tradicionais de prevenção e controle. Assim, uma compreensão abrangente das interações rickettsia / hospedeiro / vetor acabaria por estabelecer uma base sólida para o desenvolvimento de novas abordagens para prevenir e curar essas doenças antigas.
Na natureza, a transferência horizontal de genes (HGT) em bactérias ocorre por meio de conjugação, transdução e transformação5. A transformação bacteriana in vitro utiliza esses conceitos de HGT, embora a natureza intracelular das rickettsias apresente alguns desafios. As condições restritas de crescimento e os sistemas de conjugação e transdução pouco compreendidos em diferentes espécies de rickettsiae têm impedido a aplicação de métodos de conjugação e transdução em rickettsiae 6,7,8. Comparado com outros gêneros bacterianos intracelulares obrigatórios (por exemplo, Chlamydia, Coxiella, Anaplasma e Ehrlichia), o gênero Rickettsia difere no que diz respeito às estratégias de crescimento e replicação dentro do citoplasma celular, o que impõe desafios específicos à modificação genética das rickettsias devido às suas características únicas de estilo de vida9.
O obstáculo inicial a ser superado ao tentar a modificação genética das rickettsias é alcançar uma transformação bem-sucedida. Assim, projetar uma abordagem viável com alta eficiência de transformação seria extremamente valioso para o desenvolvimento de ferramentas genéticas para rickettsias. Aqui, nos concentramos na eletroporação, um método de transformação amplamente reconhecido que tem sido usado para introduzir DNA exógeno com sucesso em várias espécies de rickettsiae, incluindo Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii e Rickettsia buchneri10,11,12 ,13,14,15,16.
Este trabalho descreve um procedimento para a eletroporação da cepa de R. parkeri Tate's Hell (acesso: GCA_000965145.1) com o vetor shuttle pRAM18dSFA derivado do plasmídeo AaR/SC pRAM18 da cepa Rickettsia amblyommatis projetado para codificar mKATE, uma proteína fluorescente de vermelho distante, e aadA, conferindo resistência à espectromicina e estreptomicina13,15,20. R. parkeri transformados são viáveis e mantidos de forma estável sob seleção de antibióticos em linhagens celulares de carrapatos. Além disso, mostramos que a localização de R. parkeri transformado em células vivas de carrapatos via microscopia confocal pode ser usada para avaliar a qualidade das taxas de transformação em linhagens celulares vetoriais.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 &#956;m pore size filter&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences Whatman</td>
			<td>6783-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Luer-lock syringe&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60-90 silicon carbide grit&#160;</td>
			<td>LORTONE, inc</td>
			<td>&#160;591-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>absolute methanol&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A457-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto tryptose phosphate broth&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>260300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin centrifuge Cytospin4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A78300003</td>
			<td>The rotor is detatchable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12362</td>
			<td>used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>extended fine tip transfer pipet&#160;</td>
			<td>Perfector Scientific</td>
			<td>TP03-5301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>900-108</td>
			<td>The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2105 &#38; 165-2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Fiji</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td>raw image editing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KaryoMAX Giemsa stain&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>&#160;2021-10-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41300039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipoprotein concentrate&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>191476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Diaphot</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>epifluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Live ReadyProbes Reagent&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroff-Hausser Counting Chamber</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>&#160;Chamber 3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Vortex Genie 2</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an electroporation method to transform rickettsia spp. with a fluorescent protein-expressing shuttle vector in tick cell lines

As rickettsioses são causadas por uma ampla gama de bactérias intracelulares obrigatórias pertencentes ao gênero Rickettsia que podem ser transmitidas aos hospedeiros vertebrados através da picada de vetores artrópodes infectados. Até o momento, as rickettsioses epidêmicas emergentes ou reemergentes continuam sendo um risco para a saúde pública devido à dificuldade no diagnóstico, pois os métodos diagnósticos são limitados e não padronizados ou universalmente acessíveis. O diagnóstico errôneo resultante da falta de reconhecimento dos sinais e sintomas pode resultar em atraso no tratamento com antibióticos e maus resultados de saúde. Uma compreensão abrangente das características da Rickettsia acabaria por melhorar o diagnóstico clínico, a avaliação e o tratamento com melhor controle e prevenção da doença. 
Estudos funcionais de genes rickettsianos são cruciais para a compreensão de seu papel na patogênese. Este trabalho descreve um procedimento para a eletroporação da cepa Tate's Hell de Rickettsia parkeri com o vetor shuttle pRAM18dSFA e a seleção de R. parkeri transformado em cultura de células de carrapatos com antibióticos (espectromicina e estreptomicina). Um método também é descrito para a localização de R. parkeri transformado em células de carrapatos usando microscopia de imunofluorescência confocal, uma técnica útil para verificar a transformação em linhagens celulares vetoriais. Abordagens semelhantes também são adequadas para a transformação de outras rickettsiae.

A morfologia de R. parkeri em células ISE6 sob microscópio de luz após coloração de Giemsa é mostrada na Figura 1. Na Figura 2, R. parkeri transformada expressando proteína de fluorescência vermelha em células ISE6 é mostrada usando microscopia confocal. Há um aumento substancial na taxa de infecção de R. parkeri transformado (vermelho) em células ISE6 (azul, corresponde aos núcleos) do (A) dia 7 para (<...

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An Electroporation Method to Transform Rickettsia spp. with a Fluorescent Protein-Expressing Shuttle Vector in Tick Cell Lines

A eletroporação é um método rápido e amplamente adotado para a introdução de DNA exógeno no gênero Rickettsia. Este protocolo fornece um método de eletroporação útil para a transformação de bactérias intracelulares obrigatórias no gênero Rickettsia.

Um método de eletroporação para transformar Rickettsia spp. com um vetor shuttle fluorescente de expressão de proteínas em linhagens celulares de carrapatos

Rickettsioses are caused by a broad range of obligate intracellular bacteria belonging to the genus Rickettsia that can be transmitted to vertebrate hosts ...

Estudos funcionais dos genes Rickettsia são cruciais para a compreensão de seu papel na patogênese, por isso precisamos de métodos confiáveis de alteração dos genes de forma controlada. Nosso protocolo usa eletroporação para introduzir DNA exógeno em bactérias intracelulares obrigatórias do gênero Rickettsia, permitindo-nos estudar os efeitos do DNA introduzido. Demonstrando o procedimento junto comigo hoje estará Lisa Price, pesquisadora do Dr. Munderloh e do laboratório do Dr. Kurtti.Para começar, prepare uma cultura de células ISE6 infectada por 90 a 100% Rickettsia parkeri, conforme descrito no texto. Em seguida, para determinar a taxa de infecção pela coloração de Giemsa, diluir a suspensão celular para uma proporção de 1:5 com meio completo e depositar 100 microlitros da suspensão celular em uma lâmina de microscópio de vidro por centrifugação a 113 G por cinco minutos. Depois de deixar a lâmina secar ao ar, fixe-a em metanol absoluto por cinco minutos à temperatura ambiente.Em seguida, incube a lâmina e a mancha de Giemsa por 30 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, lave a lâmina em água e, uma vez seca, visualize-a sob um microscópio de luz com objetivas de óleo. Determine a porcentagem de células infectadas contando as células infectadas e não infectadas.Para preparar o Rickettsia parkeri livre de células, despeje cerca de 0,2 mililitros de grão de carboneto de silício estéril de 60 a 90 em dois tubos de microcentrífuga estéreis de dois mililitros e deixe os tubos de lado. De um frasco previamente inoculado de Rickettsia parkeri infectado contendo cinco mililitros de meio, remova dois mililitros do meio, tomando cuidado para não perturbar a camada celular. Em seguida, ressuspenda as células com os três mililitros restantes do meio.Divida esta suspensão igualmente entre os dois tubos de grão de carboneto de silicone preparados e vortex o tubo em alta velocidade por 30 segundos. Em seguida, coloque-os no gelo. Em seguida, prepare uma seringa estéril de cinco mililitros luer lock, estendendo o êmbolo e insira a extremidade do êmbolo em uma base de poliestireno usada para segurar tubos cônicos de 15 mililitros.Usando uma pipeta Pasteur de barreira de dois mililitros operada com um bulbo de borracha, remova cuidadosamente o sobrenadante das células do vórtice sem aspirar qualquer grão. Em seguida, insira a ponta da pipeta na abertura do cubo da seringa e ejete o conteúdo para a seringa com uma pressão suave. Em seguida, filtre a cultura de Rickettsia parkeri em tubos estéreis de 1,5 mililitro através de um filtro estéril de tamanho de poro de dois micrômetros instalado no cubo da seringa e centrifugar os tubos a 13.600 G por cinco minutos a quatro graus Celsius.Depois de remover o sobrenadante, lave o pellet de célula duas vezes com 1,2 mililitros de solução de sacarose gelada de 300 milimolares. Centrifugar a amostra e remover o sobrenadante entre as lavagens. No final da centrifugação, ressuspender o pellet de células agrupadas com 100 a 150 microlitros de solução de sacarose gelada para duas a três amostras de transformação, respectivamente.Em seguida, divida a amostra em alíquotas de 50 microlitros em tubos de microcentrífuga pré-refrigerados, estéreis e de 1,5 microlitro. Para transformação em três microgramas de DNA plasmidial pRAM18sSFA livre de endotoxinas para cada tubo contendo 50 microlitros de Rickettsia parkeri no gelo e mexa suavemente com uma ponta de pipeta. Transfira a mistura para uma cubeta de eletroporação estéril pré-resfriada com um tamanho de folga de 0,1 centímetro.Bata suavemente na cubeta para distribuir a mistura uniformemente e incube no gelo por 10 a 30 minutos. Entretanto, retire o meio de um balão de cultura celular ISE6 previamente cultivado e ressuspenda a camada celular enxaguando suavemente as células com 1,5 mililitros de meio fresco contendo bicarbonato de sódio e tampão HEPES. Depois de gerar uma suspensão celular homogênea, transfira todo o volume para um único tubo de microcentrífuga estéril de dois mililitros.Em seguida, eletroporate a mistura de Rickettsia parkeri e DNA plasmídico usando um eletroporador. Após a eletroporação, use uma pipeta de ponta fina estendida estéril para transferir uma pequena quantidade da suspensão de células ISE6 para a cubeta e pipetar suavemente para cima e para baixo para recuperar a Rickettsia parkeri eletroporada. Em seguida, transfira o conteúdo da cubeta para o tubo de dois mililitros contendo o restante da suspensão celular ISE6.Em seguida, centrifugar a amostra à temperatura ambiente, primeiro a 700 G por dois minutos para puxar as células ISE6 e, em seguida, a 13.600 G por um minuto para puxar a Rickettsia. Incubar o tubo a 34 graus Celsius por 15 minutos a uma hora. Após incubação, transferir o conteúdo ressuspenso de uma transformação para um balão de cultura celular de 25 centímetros quadrados contendo 3,5 mililitros de meio fresco com bicarbonato de sódio e tampão HEPES.Agite o balão para espalhar a mistura uniformemente e incubar a 34 graus Celsius. Após 16 a 24 horas, adicionar 10 microlitros cada de espectinomicina e estreptomicina ao balão incubado. Agite o balão para misturar os antibióticos uniformemente no meio antes de devolver o balão à incubadora.A propagação bem-sucedida de células selvagens de Rickettsia parkeri e ISE6 foi evidente pela coloração de Giemsa. Os núcleos das células ISE6 corados de roxo escuro com Giemsa no Rickettsi intracelular e extracelular são visíveis. A transformação de Rickettsia parkeri expressando a proteína de fluorescência vermelha em células ISE6 foi confirmada por microscopia confocal após sete dias de incubação.Um aumento substancial na taxa de infecção foi observado após 10 dias. Mantenha tudo estéril durante todo o procedimento. Preste atenção aos detalhes e seja paciente, pois algumas espécies de Rickettsia levam muito tempo para se transformar, especialmente os endossimbiontes de crescimento lento.Este protocolo permitiu o estudo de múltiplos aspectos da biologia de Rickettsia e suas interações com seus vetores artrópodes e hospedeiros mamíferos. Por exemplo, Rickettsi fluorescente que expressa proteínas tem sido usado para rastrear a motilidade e as interações simbiontes das células do carrapato.

Research

JoVE Journal

Biology

An Electroporation Method to Transform Rickettsia spp. with a Fluorescent Protein-Expressing Shuttle Vector in Tick Cell Lines

Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.

MATIZ Passaging-tronco embrionárias humanas Cell-linhas com Tripsina

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin.  Human embryonic stem cells are artifacts ...

Biologia

Tracheotomy: A Method for Transplantation of Stem Cells to the Lung

Traqueotomia: Um Método para Transplante de Células-Tronco para o pulmão

Lung disease is a leading cause of death and likely to become an epidemic given increases in pollution and smoking worldwide. Advances in stem cell ...

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

No útero e ex eletroporação in vivo para Expressão Gênica em células ganglionares da retina do rato

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Usando o Sistema de Eletroporação Gene Pulser MXcell para transfectar pilhas com Alta Eficiência

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

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Reprogramação de células somáticas humanas em células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando vetor retroviral com GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

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The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

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Internalização e Observação de Fluorescent Biomoléculas em microorganismos vivos via Eletroporação

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An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

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Um método eficiente em Vitro transposição por um sistema de beleza dormindo Transcriptionally regulado empacotado em um vetor de Lentivirus defeituoso de integração

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB ...