Name: an electroporation method to transform rickettsia spp. with a fluorescent protein-expressing shuttle vector in tick cell lines
Uploaded: 2022-10-11T14:20:00
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Agradecemos a Timothy J. Kurtti y Benjamin Cull por sus perspicaces discusiones y sugerencias. Este estudio fue apoyado financieramente por una subvención a U.G.M. del NIH (2R01AI049424) y una subvención a U.G.M. de la Estación Experimental Agrícola de Minnesota (MIN-17-078).

1. Propagación y purificación de R. parkeri a partir de cultivo de células de garrapatas
NOTA: Todos los procedimientos de cultivo celular deben realizarse en un gabinete de bioseguridad de clase II.
<ol><li>Preparando R. parkeri-células de garrapatas infectadas<ol><li>Cultivar células ISE6 en matraces de cultivo celular de 25 cm 2 a 34 °C en 5 ml de L15C300 medio17, suplementado con 5%de suero fetal bovino (FBS), 5%...

<ol>
	<li>Gillespie, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmids+and+rickettsial+evolution:+Insight+from+Rickettsia+felis.">Plasmids and rickettsial evolution: Insight from Rickettsia felis.</a> PLoS One. 2 (3), 266 (2007).</li><li>Murray, G. G., Weinert, L. A., Rhule, E. L., Welch, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phylogeny+of+Rickettsia+using+different+evolutionary+signatures:+How+tree-like+is+bacterial+evolution.">The phylogeny of Rickettsia using different evolutionary signatures: How tree-like is bacterial evolution.</a> Systematic Biology. 65 (2), 265-279 (2016).</li><li>Parola, P., Paddock, C. D., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tick-borne+rickettsioses+around+the+world:+Emerging+diseases+challenging+old+concepts.">Tick-borne rickettsioses around the world: Emerging diseases challenging old concepts.</a> Clinical Microbiology Reviews. 18 (4), 719-756 (2005).</li><li>Fang, R., Blanton, L. S., Walker, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rickettsiae+as+emerging+infectious+agents.">Rickettsiae as emerging infectious agents.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 37 (2), 383-400 (2017).</li><li>Von Wintersdorff, C. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motility+characteristics+are+altered+for+Rickettsia+bellii+transformed+to+overexpress+a+heterologous+rickA+gene.">Motility characteristics are altered for Rickettsia bellii transformed to overexpress a heterologous rickA gene.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (3), 1170-1176 (2014).</li><li>Kurtti, T. J., Burkhardt, N. Y., Heu, C. C., Munderloh, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+expressing+Rickettsia+buchneri+and+Rickettsia+peacockii+for+tracking+symbiont-tick+cell+interactions.">Fluorescent protein expressing Rickettsia buchneri and Rickettsia peacockii for tracking symbiont-tick cell interactions.</a> Veterinary Sciences. 3 (4), 34 (2016).</li><li>Oliver, J. D., Ch&#225;vez, A. S., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Ixodes+scapularis+cell+line+with+a+predominantly+neuron-like+phenotype.">An Ixodes scapularis cell line with a predominantly neuron-like phenotype.</a> Experimental and Applied Acarology. 66 (3), 427-442 (2015).</li><li>Grabowski, J. M., Gulia-Nuss, M., Kuhn, R. J., Hill, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+reveals+proteins+for+metabolism+and+protein+processing+associated+with+Langat+virus+infection+in+Ixodes+scapularis+(black-legged+tick)+ISE6+cells.">RNAi reveals proteins for metabolism and protein processing associated with Langat virus infection in Ixodes scapularis (black-legged tick) ISE6 cells.</a> Parasites &amp; Vectors. 10 (1), 1-4 (2017).</li><li>Al-Rofaai, A., Bell-Sakyi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tick+cell+Lines+in+research+on+tick+control.">Tick cell Lines in research on tick control.</a> Frontiers in Physiology. 11, 152 (2020).</li><li>Wang, X. 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R., Martinez, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotransformation+and+clonal+isolation+of+Rickettsia+species.">Electrotransformation and clonal isolation of Rickettsia species.</a> Current Protocols in Microbiology. 39, 1-20 (2015).</li><li>Burkhardt, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+rickettsial+host+range+for+shuttle+vectors+based+on+dnaA+and+parA+genes+from+the+pRM+plasmid+of+Rickettsia+monacensis.">Examination of rickettsial host range for shuttle vectors based on dnaA and parA genes from the pRM plasmid of Rickettsia monacensis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 88 (7), 00210-00222 (2022).</li><li>Kurtti, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rickettsia+buchneri+sp.+nov.,+a+rickettsial+endosymbiont+of+the+blacklegged+tick+Ixodes+scapularis.">Rickettsia buchneri sp. nov., a rickettsial endosymbiont of the blacklegged tick Ixodes scapularis.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, 965 (2015).</li><li>Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formulation+of+medium+for+tick+cell+culture.">Formulation of medium for tick cell culture.</a> Experimental &amp; Applied Acarology. 7 (3), 219-229 (1989).</li><li>Bell-Sakyi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cell+lines+from+the+tick+Hyalomma+anatolicum+anatolicum.">Continuous cell lines from the tick Hyalomma anatolicum anatolicum.</a> The Journal of Parasitology. 77 (6), 1006-1008 (1991).</li><li>Mattila, J. T., Burkhardt, N. Y., Hutcheson, H. J., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cell+lines+and+a+rickettsial+endosymbiont+from+the+soft+tick+Carios+capensis+(Acari:+Argasidae:+Ornithodorinae).">Isolation of cell lines and a rickettsial endosymbiont from the soft tick Carios capensis (Acari: Argasidae: Ornithodorinae).</a> Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1091-1101 (2007).</li><li>Bell-Sakyi, L., R&#367;&#382;ek, D., Gould, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+from+the+soft+tick+Ornithodoros+moubata.">Cell lines from the soft tick Ornithodoros moubata.</a> Experimental and Applied Acarology. 49 (3), 209-219 (2009).</li></ol>

Aquí, demostramos un método para introducir ADN exógeno codificado en el plásmido lanzadera pRAM18dSFA en rickettsiae utilizando electroporación. En este procedimiento, las rickettsias libres de células se purificaron a partir de células huésped, se transformaron con un vector lanzadera rickettsial y se liberaron en las células de garrapatas para la infección. También se describe un procedimiento de inmunofluorescencia confocal para detectar R. parkeri que expresa la proteína de fluorescencia roja en...

Las rickettsiosis son causadas por una amplia gama de bacterias intracelulares obligadas que pertenecen al género Rickettsia (familia Rickettsiaceae, orden Rickettsiales). El género Rickettsia se clasifica en cuatro grupos principales basados en características filogenéticas1,2: el grupo de fiebre manchada (SFG), que contiene aquellas rickettsias que causan las rickettsias transmitidas por garrapatas más graves y fatales (por ejemplo, Rickettsia rickettsii, el agente causante de la fiebre maculosa de las Montañas Rocosas), el grupo del tifus (TG, por ejemplo, Rickettsia prowazekii, el agente del tifus epidémico), el grupo de transición (TRG, por ejemplo, Rickettsia felis, el agente causante de la fiebre maculosa transmitida por pulgas) y el grupo ancestral (AG, por ejemplo, Rickettsia bellii). 
Entre las enfermedades transmitidas por vectores más antiguas conocidas, las rickettsiosis se adquieren principalmente después de la transmisión de los patógenos a través de las picaduras de artrópodos vectores infectados, incluyendo garrapatas, pulgas, piojos y ácaros 3,4. Aunque el descubrimiento de antibióticos efectivos mejoró los resultados del tratamiento, las rickettsiosis epidémicas emergentes y reemergentes continúan desafiando las estrategias tradicionales de prevención y control. Por lo tanto, una comprensión integral de las interacciones rickettsia / huésped / vector establecería en última instancia una base sólida para desarrollar nuevos enfoques para prevenir y curar estas enfermedades antiguas.
En la naturaleza, la transferencia horizontal de genes (HGT) en bacterias ocurre a través de la conjugación, transducción y transformación5. La transformación bacteriana in vitro utiliza estos conceptos de HGT, aunque la naturaleza intracelular de rickettsiae presenta algunos desafíos. Las condiciones de crecimiento restringidas y los sistemas de conjugación y transducción poco conocidos en diferentes especies de rickettsias han impedido la aplicación de métodos de conjugación y transducción en rickettsias 6,7,8. En comparación con otros géneros bacterianos intracelulares obligados (por ejemplo, Chlamydia, Coxiella, Anaplasma y Ehrlichia), el género Rickettsia difiere con respecto a las estrategias de crecimiento y replicación dentro del citoplasma celular, lo que impone desafíos específicos a la modificación genética de rickettsiae debido a sus características únicas de estilo de vida9.
El obstáculo inicial a superar al intentar la modificación genética de rickettsiae es lograr una transformación exitosa. Por lo tanto, diseñar un enfoque factible con alta eficiencia de transformación sería extremadamente valioso para desarrollar herramientas genéticas para rickettsiae. Aquí, nos centramos en la electroporación, un método de transformación ampliamente reconocido que se ha utilizado para introducir ADN exógeno con éxito en varias especies de rickettsiae, incluyendo Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii y Rickettsia buchneri10,11,12 ,13,14,15,16.
Este artículo describe un procedimiento para la electroporación de la cepa Tate's Hell de R. parkeri (accesición: GCA_000965145.1) con el vector lanzadera pRAM18dSFA derivado del plásmido pRAM18 de la cepa AaR/SC de Rickettsia amblyommatis diseñado para codificar mKATE, una proteína fluorescente de color rojo lejano, y aadA, que confiere resistencia a la espectinomicina y la estreptomicina13,15,20. Los R. parkeri transformados son viables y se mantienen establemente bajo selección de antibióticos en líneas celulares de garrapatas. Además, mostramos que la localización de R. parkeri transformado en células vivas de garrapatas mediante microscopía confocal se puede utilizar para evaluar la calidad de las tasas de transformación en líneas celulares vectoriales.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 &#956;m pore size filter&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences Whatman</td>
			<td>6783-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Luer-lock syringe&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60-90 silicon carbide grit&#160;</td>
			<td>LORTONE, inc</td>
			<td>&#160;591-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>absolute methanol&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A457-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto tryptose phosphate broth&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>260300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin centrifuge Cytospin4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A78300003</td>
			<td>The rotor is detatchable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12362</td>
			<td>used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>extended fine tip transfer pipet&#160;</td>
			<td>Perfector Scientific</td>
			<td>TP03-5301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>900-108</td>
			<td>The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2105 &#38; 165-2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Fiji</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td>raw image editing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KaryoMAX Giemsa stain&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>&#160;2021-10-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41300039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipoprotein concentrate&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>191476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Diaphot</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>epifluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Live ReadyProbes Reagent&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroff-Hausser Counting Chamber</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>&#160;Chamber 3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Vortex Genie 2</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an electroporation method to transform rickettsia spp. with a fluorescent protein-expressing shuttle vector in tick cell lines

Las rickettsiosis son causadas por una amplia gama de bacterias intracelulares obligadas pertenecientes al género Rickettsia que pueden transmitirse a huéspedes vertebrados a través de la picadura de artrópodos vectores infectados. Hasta la fecha, las rickettsiosis epidémicas emergentes o reemergentes siguen siendo un riesgo para la salud pública debido a la dificultad en el diagnóstico, ya que los métodos de diagnóstico son limitados y no están estandarizados o universalmente accesibles. El diagnóstico erróneo resultante de la falta de reconocimiento de los signos y síntomas puede dar lugar a un retraso en el tratamiento con antibióticos y a resultados de salud deficientes. Una comprensión integral de las características de la rickettsia mejoraría en última instancia el diagnóstico clínico, la evaluación y el tratamiento con un mejor control y prevención de la enfermedad. 
Los estudios funcionales de los genes rickettsiales son cruciales para comprender su papel en la patogénesis. Este artículo describe un procedimiento para la electroporación de la cepa de Rickettsia parkeri Tate's Hell con el vector lanzadera pRAM18dSFA y la selección de R. parkeri transformado en cultivo de células de garrapatas con antibióticos (espectinomicina y estreptomicina). También se describe un método para la localización de R. parkeri transformado en células de garrapatas utilizando microscopía de inmunofluorescencia confocal, una técnica útil para verificar la transformación en líneas celulares vectoriales. Enfoques similares también son adecuados para la transformación de otras rickettsiae.

La morfología de R. parkeri en células ISE6 bajo un microscopio óptico después de la tinción de Giemsa se muestra en la Figura 1. En la Figura 2, R. parkeri transformada que expresa proteína de fluorescencia roja en células ISE6 se muestra mediante microscopía confocal. Hay un aumento sustancial en la tasa de infección de R. parkeri transformado (rojo) en células ISE6 (azul, corresponde a los núcleos) desde (A</stron...

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An Electroporation Method to Transform Rickettsia spp. with a Fluorescent Protein-Expressing Shuttle Vector in Tick Cell Lines

La electroporación es un método rápido y ampliamente adoptado para introducir ADN exógeno en el género Rickettsia. Este protocolo proporciona un método de electroporación útil para la transformación de bacterias intracelulares obligadas en el género Rickettsia.

Un método de electroporación para transformar Rickettsia spp. con un vector lanzadera fluorescente que expresa proteínas en líneas celulares de garrapatas

Rickettsioses are caused by a broad range of obligate intracellular bacteria belonging to the genus Rickettsia that can be transmitted to vertebrate hosts ...

Los estudios funcionales de los genes de Rickettsia son cruciales para comprender su papel en la patogénesis, por lo que necesitamos métodos confiables para alterar los genes de manera controlada. Nuestro protocolo utiliza la electroporación para introducir ADN exógeno en bacterias intracelulares obligadas del género Rickettsia, lo que nos permite estudiar los efectos del ADN introducido. Demostrando el procedimiento junto conmigo hoy estará Lisa Price, investigadora del Dr. Munderloh y del laboratorio del Dr. Kurtti.Para comenzar, prepare un cultivo de células ISE6 infectado con Rickettsia parkeri al 90 a 100% como se describe en el texto. Luego, para determinar la tasa de infección por tinción de Giemsa, diluya la suspensión celular a una proporción de 1: 5 con medio completo y deposite 100 microlitros de la suspensión celular en un portaobjetos de microscopio de vidrio por centrifugación a 113 G durante cinco minutos. Después de dejar que la diapositiva se seque al aire, fíjela en un metanol absoluto durante cinco minutos a temperatura ambiente.Luego, incuba el tobogán y tinción de Giemsa durante 30 minutos a 37 grados centígrados. A continuación, enjuague el portaobjetos en agua y una vez seco, véalo bajo un microscopio óptico con objetivos de aceite. Determine el porcentaje de células infectadas contando las células infectadas y no infectadas.Para preparar el Rickettsia parkeri libre de células, vierta aproximadamente 0,2 mililitros de arena estéril de carburo de silicio de 60 a 90 en dos tubos de microcentrífuga estériles de dos mililitros y deje los tubos a un lado. De un matraz previamente inoculado infectado con Rickettsia parkeri que contenga cinco mililitros de medio, extraer dos mililitros del medio, teniendo cuidado de no perturbar la capa celular. Luego, resuspenda las células con los tres mililitros restantes del medio.Divida esta suspensión en partes iguales entre los dos tubos de arena de carburo de silicona preparados y haga un vórtice del tubo a alta velocidad durante 30 segundos. Luego, colócalos en hielo. A continuación, prepare una jeringa luer lock estéril de cinco mililitros extendiendo el émbolo e inserte el extremo del émbolo en una base de poliestireno utilizada para sostener tubos cónicos de 15 mililitros.Usando una pipeta Pasteur de barrera de dos mililitros operada con una bombilla de goma, retire cuidadosamente el sobrenadante de las células de vórtice sin aspirar ningún grano. A continuación, inserte la punta de la pipeta en la abertura del cubo de la jeringa y expulse el contenido en la jeringa con una presión suave. A continuación, filtre el cultivo de Rickettsia parkeri en tubos estériles de 1,5 mililitros a través de un filtro estéril de dos micrómetros de tamaño de poro instalado en el cubo de la jeringa y centrifugar los tubos a 13, 600 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.Después de retirar el sobrenadante, lave el pellet celular dos veces con 1.2 mililitros de solución de sacarosa helada de 300 milimolares. Centrifugar la muestra y retirar el sobrenadante entre lavados. Al final de la centrifugación, resuspender el pellet de celda agrupado con 100 a 150 microlitros de solución de sacarosa helada para dos o tres muestras de transformación, respectivamente.Luego, divida la muestra en alícuotas de 50 microlitros en tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 microlitros preenfriados. Para la transformación a tres microgramos de ADN plásmido pRAM18sSFA libre de endotoxinas a cada tubo que contiene 50 microlitros de Rickettsia parkeri en hielo y agitar suavemente con una punta de pipeta. Transfiera la mezcla a una cubeta de electroporación estéril preenfriada con un espacio de 0,1 centímetros.Golpee suavemente la cubeta para distribuir la mezcla uniformemente e incubar en hielo durante 10 a 30 minutos. Mientras tanto, retire el medio de un matraz de cultivo celular ISE6 previamente cultivado completamente confluente y resuspenda la capa celular enjuagando suavemente las células con 1,5 mililitros de medio fresco que contenga bicarbonato de sodio y tampón HEPES. Después de generar una suspensión celular homogénea, transfiera todo el volumen a un solo tubo de microcentrífuga estéril de dos mililitros.A continuación, electroporate la mezcla de ADN de Rickettsia parkeri y plásmido usando un electroporador. Después de la electroporación, use una pipeta estéril extendida de punta fina para transferir una pequeña cantidad de la suspensión de células ISE6 a la cubeta y pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para recuperar la Rickettsia parkeri electroporada. Luego, transfiera el contenido de la cubeta al tubo de dos mililitros que contiene el resto de la suspensión de celdas ISE6.A continuación, centrifugar la muestra a temperatura ambiente, primero a 700 G durante dos minutos para bajar las células ISE6, y luego a 13, 600 G durante un minuto para bajar la Rickettsia. Incubar el tubo a 34 grados centígrados durante 15 minutos a una hora. Después de la incubación, transferir el contenido resuspendido de una transformación a un matraz de cultivo celular de 25 centímetros cuadrados que contenga 3,5 mililitros de medio fresco con bicarbonato de sodio y tampón HEPES.Mece el matraz para esparcir la mezcla uniformemente e incubar a 34 grados centígrados. Después de 16 a 24 horas, añadir 10 microlitros de espectinomicina y estreptomicina en el matraz incubado. Meca el matraz para mezclar los antibióticos uniformemente en el medio antes de devolverlo a la incubadora.La propagación exitosa de células salvajes de Rickettsia parkeri e ISE6 fue evidente por la tinción de Giemsa. Los núcleos de las células ISE6 teñidas de púrpura oscuro con Giemsa en el Rickettsi intracelular y extracelular son visibles. La transformación de Rickettsia parkeri expresando la proteína de fluorescencia roja en células ISE6 se confirmó mediante microscopía confocal después de siete días de incubación.Se observó un aumento sustancial en la tasa de infección después de 10 días. Mantenga todo estéril durante todo el procedimiento. Preste atención a los detalles y sea paciente, ya que algunas especies de Rickettsia tardan mucho tiempo en transformarse, especialmente los endosimbiontes de crecimiento lento.Este protocolo ha permitido el estudio de múltiples aspectos de la biología de Rickettsia y sus interacciones con sus artrópodos vectores y huéspedes mamíferos. Por ejemplo, Rickettsi que expresa proteínas fluorescentes se ha utilizado para rastrear la motilidad y las interacciones simbiontes de las células de garrapata.

Research

JoVE Journal

Biology

An Electroporation Method to Transform Rickettsia spp. with a Fluorescent Protein-Expressing Shuttle Vector in Tick Cell Lines

Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.

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Investigación

Biología

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