Name: an electroporation method to transform rickettsia spp. with a fluorescent protein-expressing shuttle vector in tick cell lines
Uploaded: 2022-10-11T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Electroporation Method to Transform Rickettsia spp. with a Fluorescent Protein-Expressing Shuttle Vector in Tick Cell Lines at JoVE.com

Vi tackar Timothy J. Kurtti och Benjamin Cull för deras insiktsfulla diskussioner och förslag. Denna studie stöddes ekonomiskt av ett bidrag till U.G.M. från NIH (2R01AI049424) och ett bidrag till U.G.M. från Minnesota Agricultural Experiment Station (MIN-17-078).

1. Förökning och rening av R. parkeri från fästingcellsodling
OBS: Alla cellodlingsprocedurer ska utföras i ett klass II-biosäkerhetsskåp.
<ol><li>Förbereda R. parkeri-infekterade fästingceller<ol><li>Odla ISE6-celler i 25 cm2-celliga odlingskolvar vid 34 °C i 5 ml L15C300 medium17, kompletterat med 5% fetalt bovint serum (FBS), 5% tryptosfosfatbuljong (TPB) och 0,1% lipoproteinkoncentrat (LPC). OBS: ISE6 (<em...

<ol>
	<li>Gillespie, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmids+and+rickettsial+evolution:+Insight+from+Rickettsia+felis.">Plasmids and rickettsial evolution: Insight from Rickettsia felis.</a> PLoS One. 2 (3), 266 (2007).</li><li>Murray, G. G., Weinert, L. A., Rhule, E. L., Welch, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phylogeny+of+Rickettsia+using+different+evolutionary+signatures:+How+tree-like+is+bacterial+evolution.">The phylogeny of Rickettsia using different evolutionary signatures: How tree-like is bacterial evolution.</a> Systematic Biology. 65 (2), 265-279 (2016).</li><li>Parola, P., Paddock, C. D., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tick-borne+rickettsioses+around+the+world:+Emerging+diseases+challenging+old+concepts.">Tick-borne rickettsioses around the world: Emerging diseases challenging old concepts.</a> Clinical Microbiology Reviews. 18 (4), 719-756 (2005).</li><li>Fang, R., Blanton, L. S., Walker, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rickettsiae+as+emerging+infectious+agents.">Rickettsiae as emerging infectious agents.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 37 (2), 383-400 (2017).</li><li>Von Wintersdorff, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissemination+of+antimicrobial+resistance+in+microbial+ecosystems+through+horizontal+gene+transfer.">Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 173 (2016).</li><li>Winkler, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rickettsia+species+(as+organisms).">Rickettsia species (as organisms).</a> Annual Review of Microbiology. 44 (1), 131-153 (1990).</li><li>Wood, D. O., Azad, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+rickettsiae:+A+preview.">Genetic manipulation of rickettsiae: A preview.</a> Infection and Immunity. 68 (11), 6091-6093 (2000).</li><li>Perlman, S. J., Hunter, M. S., Zchori-Fein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+diversity+of+Rickettsia.">The emerging diversity of Rickettsia.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1598), 2097-2106 (2006).</li><li>McClure, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+obligate+intracellular+bacteria:+Progress,+challenges+and+paradigms.">Engineering of obligate intracellular bacteria: Progress, challenges and paradigms.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 544-558 (2017).</li><li>Rachek, L. I., Tucker, A. M., Winkler, H. H., Wood, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Rickettsia+prowazekii+to+rifampin+resistance.">Transformation of Rickettsia prowazekii to rifampin resistance.</a> Journal of Bacteriology. 180 (8), 2118-2124 (1998).</li><li>Troyer, J. M., Radulovic, S., Azad, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+in+Rickettsia+typhi+transformation.">Green fluorescent protein as a marker in Rickettsia typhi transformation.</a> Infection and Immunity. 67 (7), 3308-3311 (1996).</li><li>Kim, H. K., Premaratna, R., Missiakas, D. M., Schneewind, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rickettsia+conorii+O+antigen+is+the+target+of+bactericidal+Weil-Felix+antibodies.">Rickettsia conorii O antigen is the target of bactericidal Weil-Felix antibodies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (39), 19659-19664 (2019).</li><li>Burkhardt, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+shuttle+vectors+for+transformation+of+diverse+Rickettsia+species.">Development of shuttle vectors for transformation of diverse Rickettsia species.</a> PLoS One. 6 (12), 29511 (2011).</li><li>Welch, M. D., Reed, S. C., Lamason, R. L., Serio, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+an+epitope-tagged+virulence+protein+in+Rickettsia+parkeri+using+transposon+insertion.">Expression of an epitope-tagged virulence protein in Rickettsia parkeri using transposon insertion.</a> PloS One. 7 (5), 37310 (2012).</li><li>Oliver, J. D., Burkhardt, N. Y., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motility+characteristics+are+altered+for+Rickettsia+bellii+transformed+to+overexpress+a+heterologous+rickA+gene.">Motility characteristics are altered for Rickettsia bellii transformed to overexpress a heterologous rickA gene.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (3), 1170-1176 (2014).</li><li>Kurtti, T. J., Burkhardt, N. Y., Heu, C. C., Munderloh, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+expressing+Rickettsia+buchneri+and+Rickettsia+peacockii+for+tracking+symbiont-tick+cell+interactions.">Fluorescent protein expressing Rickettsia buchneri and Rickettsia peacockii for tracking symbiont-tick cell interactions.</a> Veterinary Sciences. 3 (4), 34 (2016).</li><li>Oliver, J. D., Ch&#225;vez, A. S., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Ixodes+scapularis+cell+line+with+a+predominantly+neuron-like+phenotype.">An Ixodes scapularis cell line with a predominantly neuron-like phenotype.</a> Experimental and Applied Acarology. 66 (3), 427-442 (2015).</li><li>Grabowski, J. M., Gulia-Nuss, M., Kuhn, R. J., Hill, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+reveals+proteins+for+metabolism+and+protein+processing+associated+with+Langat+virus+infection+in+Ixodes+scapularis+(black-legged+tick)+ISE6+cells.">RNAi reveals proteins for metabolism and protein processing associated with Langat virus infection in Ixodes scapularis (black-legged tick) ISE6 cells.</a> Parasites &amp; Vectors. 10 (1), 1-4 (2017).</li><li>Al-Rofaai, A., Bell-Sakyi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tick+cell+Lines+in+research+on+tick+control.">Tick cell Lines in research on tick control.</a> Frontiers in Physiology. 11, 152 (2020).</li><li>Wang, X. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrion-dependent+apoptosis+is+essential+for+Rickettsia+parkeri+infection+and+replication+in+vector+cells.">Mitochondrion-dependent apoptosis is essential for Rickettsia parkeri infection and replication in vector cells.</a> mSystems. 6 (2), 01209-01220 (2021).</li><li>Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+and+interpretation+of+bacterial+viability+by+using+the+LIVE/DEAD+BacLight+Kit+in+combination+with+flow+cytometry.">Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry.</a> Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).</li><li>Riley, S. P., Macaluso, K. R., Martinez, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotransformation+and+clonal+isolation+of+Rickettsia+species.">Electrotransformation and clonal isolation of Rickettsia species.</a> Current Protocols in Microbiology. 39, 1-20 (2015).</li><li>Burkhardt, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+rickettsial+host+range+for+shuttle+vectors+based+on+dnaA+and+parA+genes+from+the+pRM+plasmid+of+Rickettsia+monacensis.">Examination of rickettsial host range for shuttle vectors based on dnaA and parA genes from the pRM plasmid of Rickettsia monacensis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 88 (7), 00210-00222 (2022).</li><li>Kurtti, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rickettsia+buchneri+sp.+nov.,+a+rickettsial+endosymbiont+of+the+blacklegged+tick+Ixodes+scapularis.">Rickettsia buchneri sp. nov., a rickettsial endosymbiont of the blacklegged tick Ixodes scapularis.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, 965 (2015).</li><li>Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formulation+of+medium+for+tick+cell+culture.">Formulation of medium for tick cell culture.</a> Experimental &amp; Applied Acarology. 7 (3), 219-229 (1989).</li><li>Bell-Sakyi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cell+lines+from+the+tick+Hyalomma+anatolicum+anatolicum.">Continuous cell lines from the tick Hyalomma anatolicum anatolicum.</a> The Journal of Parasitology. 77 (6), 1006-1008 (1991).</li><li>Mattila, J. T., Burkhardt, N. Y., Hutcheson, H. J., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cell+lines+and+a+rickettsial+endosymbiont+from+the+soft+tick+Carios+capensis+(Acari:+Argasidae:+Ornithodorinae).">Isolation of cell lines and a rickettsial endosymbiont from the soft tick Carios capensis (Acari: Argasidae: Ornithodorinae).</a> Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1091-1101 (2007).</li><li>Bell-Sakyi, L., R&#367;&#382;ek, D., Gould, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+from+the+soft+tick+Ornithodoros+moubata.">Cell lines from the soft tick Ornithodoros moubata.</a> Experimental and Applied Acarology. 49 (3), 209-219 (2009).</li></ol>

Här demonstrerar vi en metod för att införa exogent DNA kodat på skyttelplasmiden pRAM18dSFA i rickettsiae med hjälp av elektroporation. I denna procedur renades cellfri rickettsiae från värdceller, transformerades med en rickettsial shuttlevektor och släpptes ut på fästceller för infektion. Dessutom beskrivs ett konfokalt immunofluorescensförfarande för att detektera röd fluorescensproteinuttryckande R. parkeri i fästingceller. Liknande metoder är tillämpliga på andra Rickettsia-arter...

Rickettsioses orsakas av ett brett spektrum av obligatoriska intracellulära bakterier som tillhör släktet Rickettsia (familj Rickettsiaceae, ordning Rickettsiales). Släktet Rickettsia klassificeras i fyra huvudgrupper baserat på fylogenetiska egenskaper1,2: den fläckiga febergruppen (SFG), som innehåller de rickettsiae som orsakar de allvarligaste och dödligaste fästingburna rickettsioserna (t.ex. Rickettsia rickettsii, orsaksmedlet för Rocky Mountain Spotted Fever), tyfusgruppen (TG, t.ex. Rickettsia prowazekii, agenten för epidemisk tyfus), övergångsgruppen (TRG, t.ex. Rickettsia felis, orsaksmedlet för loppburen fläckig feber) och förfädersgruppen (AG, t.ex. Rickettsia bellii). 
Bland de äldsta kända vektorburna sjukdomarna förvärvas rickettsioses huvudsakligen efter överföring av patogenerna genom bett av infekterade leddjursvektorer, inklusive fästingar, loppor, löss och kvalster 3,4. Även om upptäckten av effektiva antibiotika förbättrade behandlingsresultaten, fortsätter nya och återuppkommande epidemiska rickettsioses att utmana traditionella förebyggande och kontrollstrategier. Således skulle en omfattande förståelse av rickettsia / värd / vektorinteraktioner i slutändan skapa en stark grund för att utveckla nya metoder för att förebygga och bota dessa gamla sjukdomar.
I naturen sker horisontell genöverföring (HGT) i bakterier genom konjugering, transduktion och transformation5. In vitro bakteriell transformation använder dessa HGT-koncept, även om rickettsiaes intracellulära natur innebär vissa utmaningar. De begränsade tillväxtförhållandena och dåligt förstådda konjugerings- och transduktionssystemen hos olika arter av rickettsiae har förhindrat tillämpningen av konjugerings- och transduktionsmetoder i rickettsiae 6,7,8. Jämfört med andra obligatoriska intracellulära bakteriesläkten (t.ex. klamydia, Coxiella, Anaplasma och Ehrlichia) skiljer sig släktet Rickettsia med avseende på tillväxt- och replikationsstrategierna inom cellcytoplasman, vilket innebär specifika utmaningar för den genetiska modifieringen av rickettsiae på grund av deras unika livsstilsegenskaper9.
Det första hindret att övervinna när man försöker genetisk modifiering av rickettsiae är att uppnå framgångsrik omvandling. Således skulle utformningen av ett genomförbart tillvägagångssätt med hög transformationseffektivitet vara extremt värdefullt för att utveckla genetiska verktyg för rickettsiae. Här fokuserar vi på elektroporation, en allmänt erkänd transformationsmetod som har använts för att framgångsrikt introducera exogent DNA i flera arter av rickettsiae, inklusive Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii och Rickettsia buchneri10,11,12 ,13,14,15,16.
Detta dokument beskriver ett förfarande för elektroporering av R. parkeri-stammen Tate's Hell (anslutning: GCA_000965145.1) med skyttelvektorn pRAM18dSFA härledd från Rickettsia amblyommatis-stammen AaR / SC-plasmid pRAM18 konstruerad för att koda mKATE, ett långt rött fluorescerande protein, och aadA, vilket ger spektinomycin och streptomycinresistens13,15,20. Transformerade R. parkeri är livskraftiga och stabilt underhållna under antibiotikaval i fästingcellinjer. Dessutom visar vi att lokaliseringen av transformerade R. parkeri i levande fästingceller via konfokalmikroskopi kan användas för att bedöma kvaliteten på transformationshastigheter i vektorcellinjer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 &#956;m pore size filter&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences Whatman</td>
			<td>6783-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Luer-lock syringe&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60-90 silicon carbide grit&#160;</td>
			<td>LORTONE, inc</td>
			<td>&#160;591-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>absolute methanol&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A457-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto tryptose phosphate broth&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>260300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin centrifuge Cytospin4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A78300003</td>
			<td>The rotor is detatchable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12362</td>
			<td>used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>extended fine tip transfer pipet&#160;</td>
			<td>Perfector Scientific</td>
			<td>TP03-5301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>900-108</td>
			<td>The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2105 &#38; 165-2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Fiji</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td>raw image editing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KaryoMAX Giemsa stain&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>&#160;2021-10-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41300039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipoprotein concentrate&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>191476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Diaphot</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>epifluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Live ReadyProbes Reagent&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroff-Hausser Counting Chamber</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>&#160;Chamber 3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Vortex Genie 2</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an electroporation method to transform rickettsia spp. with a fluorescent protein-expressing shuttle vector in tick cell lines

Rickettsioses orsakas av ett brett spektrum av obligatoriska intracellulära bakterier som tillhör släktet Rickettsia som kan överföras till ryggradsdjursvärdar genom bett av infekterade leddjursvektorer. Hittills är nya eller återuppkommande epidemiska rickettsioses fortfarande en folkhälsorisk på grund av svårigheten att diagnostisera, eftersom diagnostiska metoder är begränsade och inte standardiserade eller allmänt tillgängliga. Feldiagnos till följd av bristande erkännande av tecken och symtom kan leda till försenad antibiotikabehandling och dåliga hälsoutfall. En omfattande förståelse av Rickettsia-egenskaper skulle i slutändan förbättra klinisk diagnos, bedömning och behandling med förbättrad kontroll och förebyggande av sjukdomen. 
Funktionella studier av rickettsialgener är avgörande för att förstå deras roll i patogenesen. Detta dokument beskriver ett förfarande för elektroporering av Rickettsia parkeri-stammen Tate's Hell med skyttelvektorn pRAM18dSFA och valet av transformerad R. parkeri i fästcellsodling med antibiotika (spektinomycin och streptomycin). En metod beskrivs också för lokalisering av transformerad R. parkeri i fästingceller med hjälp av konfokal immunofluorescensmikroskopi, en användbar teknik för att kontrollera transformation i vektorcellinjer. Liknande tillvägagångssätt är också lämpliga för omvandling av andra rickettsiae.

Morfologin hos R. parkeri i ISE6-celler under ett ljusmikroskop efter Giemsa-färgning visas i figur 1. I figur 2 visas transformerat R. parkeri som uttrycker rött fluorescensprotein i ISE6-celler med konfokalmikroskopi. Det finns en betydande ökning av infektionshastigheten för transformerad R. parkeri (röd) i ISE6-celler (blå, motsvarar kärnorna) från (A) dag 7 till (B) dag 10 av inkubation.</...

Watch this Scientific Journal Video about An Electroporation Method to Transform Rickettsia spp. with a Fluorescent Protein-Expressing Shuttle Vector in Tick Cell Lines at JoVE.com

An Electroporation Method to Transform Rickettsia spp. with a Fluorescent Protein-Expressing Shuttle Vector in Tick Cell Lines

Elektroporering är en snabb, allmänt antagen metod för att införa exogent DNA i släktet Rickettsia. Detta protokoll ger en användbar elektroporationsmetod för omvandling av obligatoriska intracellulära bakterier i släktet Rickettsia.

En elektroporationsmetod för att omvandla Rickettsia spp.

Rickettsioses are caused by a broad range of obligate intracellular bacteria belonging to the genus Rickettsia that can be transmitted to vertebrate hosts ...

Funktionella studier av Rickettsia-gener är avgörande för att förstå deras roll i patogenesen, så vi behöver pålitliga metoder för att förändra generna på ett kontrollerat sätt. Vårt protokoll använder elektroporation för att införa exogent DNA i obligatoriska intracellulära bakterier av släktet Rickettsia, vilket gör att vi kan studera effekterna av det införda DNA: t. Demonstrerar proceduren tillsammans med mig idag kommer att vara Lisa Price, en forskare från Dr.Munderloh och Dr.Kurttis laboratorium.För att börja, förbered en 90 till 100% Rickettsia parkeri-infekterad ISE6-cellodling som beskrivs i texten. För att bestämma infektionshastigheten genom Giemsa-färgning, späd sedan cellsuspensionen till ett förhållande av 1:5 med fullständigt medium och sätt in 100 mikroliter av cellsuspensionen på ett glasmikroskopglas genom centrifugering vid 113 G i fem minuter. Efter att ha låtit gliden lufttorka, fixa den en absolut metanol i fem minuter vid rumstemperatur.Inkubera sedan bilden och Giemsa-fläcken i 30 minuter vid 37 grader Celsius. Skölj sedan bilden i vatten och när den är torr, se den under ett lätt mikroskop med oljemål. Bestäm procentandelen infekterade celler genom att räkna de infekterade och icke-infekterade cellerna.För att förbereda den cellfria Rickettsia parkeri, häll cirka 0,2 ml steril 60 till 90 kiselkarbidkorn i två två milliliter sterila mikrocentrifugrör och lägg rören åt sidan. Från en tidigare inokulerad Rickettsia parkeri-infekterad kolv innehållande fem milliliter medium, avlägsna två milliliter av mediet, var försiktig så att du inte stör cellskiktet. Återsuspendera sedan cellerna med de återstående tre milliliter av mediet.Dela denna suspension lika mellan de två beredda silikonkarbidkornrören och virvla röret med hög hastighet i 30 sekunder. Lägg dem sedan på is. Förbered sedan en steril fem-milliliters luerlåsspruta genom att förlänga kolven och sätt in kolvänden i en polystyrenbas som används för att hålla 15-milliliter koniska rör.Använd en barriär två-milliliter Pasteur-pipett som drivs med en gummilampa, ta försiktigt bort supernatanten i virvelcellerna utan att aspirera något grus. För sedan in pipettspetsen i sprutnavets öppning och mata ut innehållet i sprutan med försiktigt tryck. Därefter filtrerar du Rickettsia parkeri-kulturen i sterila 1,5-milliliterrör genom ett sterilt tvåmikrometer porstorleksfilter monterat på sprutnavet och centrifugerar rören vid 13 600 G i fem minuter vid fyra grader Celsius.Efter avlägsnande av supernatanten, tvätta cellpelleten två gånger med 1,2 ml 300 millimolär iskall sackaroslösning. Centrifugera provet och avlägsna supernatanten mellan tvättarna. Vid slutet av centrifugeringen, återsuspendera den poolade cellpelleten med 100 till 150 mikroliter iskall sackaroslösning för två till tre transformationsprover.Dela sedan provet i 50-mikroliter alikvoter i förkylda, sterila, 1,5-mikroliter mikrocentrifugrör. För transformation vid tre mikrogram endotoxinfritt pRAM18sSFA-plasmid-DNA till varje rör innehållande 50 mikroliter Rickettsia parkeri på is och rör om försiktigt med en pipettspets. Överför blandningen till en förkyld steril elektroporeringskyvett med en mellanrumsstorlek på 0,1 centimeter.Tryck försiktigt på kyvetten för att fördela blandningen jämnt och inkubera på is i 10 till 30 minuter. Under tiden avlägsnar du mediet från en helt sammanflytande tidigare odlad ISE6-cellodlingskolv och återsuspenderar cellskiktet genom att försiktigt skölja cellerna med 1,5 ml färskt medium innehållande natriumbikarbonat och HEPES-buffert. Efter att ha genererat en homogen cellsuspension, överför hela volymen till ett enda sterilt två-milliliter mikrocentrifugrör.Därefter elektropolera Rickettsia parkeri och plasmid-DNA-blandningen med användning av en elektroporator. Efter elektroporering, använd en steril förlängd finspetspipett för att överföra en liten mängd av ISE6-cellsuspensionen till kyvetten och pipettera försiktigt upp och ner för att återställa den elektroporerade Rickettsia parkeri. Överför sedan innehållet i kyvetten till två-milliliterröret som innehåller resten av ISE6-cellsuspensionen.Centrifugera sedan provet vid rumstemperatur, först vid 700 G i två minuter för att dra ner ISE6-cellerna och sedan vid 13 600 G i en minut för att dra ner Rickettsia. Inkubera röret vid 34 grader Celsius i 15 minuter till en timme. Efter inkubation överförs det återsuspenderade innehållet i en omvandling till en 25 kvadratcentimeter cellodlingskolv innehållande 3,5 ml färskt medium med natriumbikarbonat och HEPES-buffert.Gunga kolven för att sprida blandningen jämnt och inkubera vid 34 grader Celsius. Efter 16 till 24 timmar tillsätt 10 mikroliter vardera av spektinomycin och streptomycin i den inkuberade kolven. Gunga kolven för att blanda antibiotikan jämnt i mediet innan kolven återförs till inkubatorn.Framgångsrik förökning av vilda rickettsia parkeri- och ISE6-celler var uppenbar genom Giemsa-färgning. Kärnorna i ISE6-cellerna färgade mörklila med Giemsa i den intracellulära såväl som extracellulära Rickettsi är synliga. Transformation av Rickettsia parkeri som uttrycker det röda fluorescensproteinet i ISE6-celler bekräftades genom konfokalmikroskopi efter sju dagars inkubation.En väsentlig ökning av infektionshastigheten observerades efter 10 dagar. Håll allt sterilt under hela proceduren. Var uppmärksam på detaljer och ha tålamod, eftersom vissa arter av Rickettsia tar lång tid att förvandlas, särskilt långsamt växande endosymbionter.Detta protokoll har möjliggjort studier av flera aspekter av Rickettsia-biologi och deras interaktioner med deras leddjursvektorer och däggdjursvärdar. Till exempel har fluorescerande proteinuttryckande Rickettsi använts för att spåra motilitet och symbiont tick cell interaktioner.

Research

JoVE Journal

Biology

An Electroporation Method to Transform Rickettsia spp. with a Fluorescent Protein-Expressing Shuttle Vector in Tick Cell Lines

Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.

Passaging nyanser mänskliga embryonala stamceller-linjer med Trypsin

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin.  Human embryonic stem cells are artifacts ...

Tracheotomy: A Method for Transplantation of Stem Cells to the Lung

Trakeotomi: En metod för transplantation av stamceller till Lung

Lung disease is a leading cause of death and likely to become an epidemic given increases in pollution and smoking worldwide. Advances in stem cell ...

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

In utero och ex vivo elektroporation för genuttryck i Mus Retinal ganglion celler

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Använda Gene Pulser MXcell elektroporation System till transfektera primärceller med hög verkningsgrad

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Omprogrammering Mänskliga somatiska celler in i inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) Använda retroviral vektor med GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

En guide till Modern Kvantitativ Fluorescerande Western blotting med Felsökning Strategier

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation

Interna och Observation av fluorescerande Biomolekyler i levande mikroorganismer via elektroporation

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing ...

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

Förfarande för att mäta aktiviteten hos Deubiquitinating Enzymer i cellinjer och vävnadsprover

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

Jämförelse av tre olika metoder för bestämning av cellproliferation i bröstcancercellinjer

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

En effektiv In Vitro införlivande metod av en Transcriptionally reglerade Sleeping Beauty System paketeras i en Integration defekta Lentiviral Vector

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB ...