Name: culturing, freezing, processing, and imaging of entire organoids and spheroids while still in a hydrogel
Uploaded: 2022-12-23T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing, Freezing, Processing, and Imaging of Entire Organoids and Spheroids While Still in a Hydrogel at JoVE.com

我们感谢芝加哥大学的Dale Mertes准备图表，感谢Mehmet Serif Aydin博士在伊斯坦布尔Medipol大学健康科学与技术研究所的技术支持，感谢Maltepe大学的Rana Kazemi博士编辑手稿。

1. 培养类器官和球状体
<ol><li>将水凝胶放在冰上过夜（在冰箱或冷藏室中）解冻。</li>
	<li>在实验前1天将市售的多用途装置（MD;参见 材料表）放入培养箱中（37°C，5%CO2）加热。</li>
	<li>将无菌宽端移液器吸头放入4°C的冰箱中。 注意：步骤 1.1-1.3 将在第 0 天执行，步骤 1.4-1.11 将在第 1 天执行。</li>
	<li>将水凝胶放在层流罩中的冰上15分钟。<ol><li>可选：根据制?...

MD补充了此处描述的配方和方案，有助于类器官和球体在更受控的环境中快速自发地3D生长，并在相同条件下继续实验。在整个过程中，标本保持在同一环境中，并且几乎100%的3D生长结构在容器中保持完整。这提高了连续实验期间的均质性，并允许延长培养期。此外，与传统工作流程（图4）相比，类器官和球体处理过程中的步骤数量大大减少，从而最大限度地减少了处理时?...

细胞研究和治疗的未来在于3D细胞培养1，2，3。类器官和球状体模型通过创建更好的模型来模仿人体发育、生理学和疾病，缩小体外实验和动物模型之间的差距4，5，6，7，8，9。然而，这些模型的可重复性和可重复性仍然具有挑战性。此外，使用当前技术处理、收获、转移和离心这些结构会导致类器官和球体在许多情况下丢失或损坏，从而显着影响结果。

尽管有许多用于组织学染色、免疫组织化学染色、免疫荧光标记和冷冻保存的方案，但没有通用的方法可用于标准化实验条件、处理和处理这些脆弱的结构而不会丢失或损坏它们。目前的方案也非常长，从几天到几周不等，包括各种试剂10，11，12，13，14的复杂程序。此外，在细胞培养容器和冷冻管之间收获、移液、离心和转移 3D 生长结构会导致结构定位和机械力发生变化，并最终影响类器官和球状体的分化和成熟。据报道，组织拓扑结构、细胞定位和机械力显着影响细胞分化和成熟6，15，16，17。

因此，需要改进现有的常规技术，以生成质量稳定的类器官和球状体。跳过上述离心和其他步骤并在多个过程的开始到结束的单一安全环境中提供材料的方法/设备将有利于获得最一致和可靠的数据。此外，这将减少时间、劳动力和成本限制。
此处描述的多用途器件（MD）为类器官和球状体的多个过程提供了单一的安全环境（补充图 1）。该设备和补充方案消除了收获、移液、转移和离心步骤。类器官和球状体在顺序过程中保持体 外 环境。这种环境主要包括天然或合成的细胞外基质成分，如市售水凝胶。换句话说，这里描述的方法允许在水凝胶滴中处理、检查和冷冻类器官/球状体的全安装样品。
生物相容性装置可耐受60°C至-160°C之间的温度，这使得在-160°C的液氮罐中恢复类器官/类固醇或在60°C下制备用于电子显微镜的树脂块是可行的。 该设备中的壁龛旨在为3D生长结构定义有限的空间，并根据先前的研究18，19，20，21，22，23刺激球状体或类器官的形成。设备的这一部分是透明的，并包含一种特殊的塑料，可提供高光学质量（折射率：1.43;阿贝值：58;厚度：7.8密耳[0.0078英寸或198微米]）。壁龛和周围的“侧面”部分都会引起自发荧光。中间的透明壁龛具有 80 mm 2 区域，而侧面为 600 mm2。容器的深度为15毫米，厚度为1.5毫米。除了设备的尺寸和设计外，这些功能还可以在不同类型的高科技显微镜下进行观察，并为电子显微镜检查准备样品（图2）。设备的关闭系统提供两个位置，一个密封在冰箱中，另一个允许气体在培养箱中流动。与传统的细胞培养皿相比，CCK8增殖和细胞毒性测定对细胞的影响相似（补充图2）。台盼蓝排除试验在MD细胞培养过程中显示出高细胞活力（94%）（图3）。
可以在单个设备中对一个样品执行的过程包括（1）培养，（2）组织学染色，（3）免疫染色，包括免疫组织化学和免疫荧光标记，（4）冷冻，（5）解冻，（6）在光学显微镜下检查，例如明场，暗场，荧光，共聚焦和超分辨率显微镜，（7）直接在扫描电子显微镜下涂覆和检查，或（8）准备透射电子显微镜（图2）。
存在用于组织学染色、免疫组织化学标记或荧光标记类器官和球状体10、11、12、13、14、24、25 的不同方法。从水凝胶中收获它们是当前技术的第一步，也是主要步骤。在此步骤之后，一些方法允许整体安装免疫标记。收获的类器官嵌入石蜡中，切片，并标记用于其他类器官的染色和免疫染色。但是，这些部分可能不会显示整个示例，并且仅提供与结构的 3D 架构相关的有限数据。此外，对这些3D结构的破坏和抗原性的丧失是这些技术众所周知的副作用。
本文中用于显微镜检查的补充新方案允许分析仍在水凝胶中的整个安装样品。这里描述的方案包括两种新开发的配方：免疫组织化学溶液（S-IHC）和免疫荧光标记溶液（S-IF）。这些解决方案的方法使研究人员能够获得更准确的数据，因为传统工作流程没有有害影响，例如离心、移液和转移精细结构。这里描述的方案还消除了收获，阻断，清除和抗原修复步骤的需要，并将整个过程缩短至6-8小时。此外，该方法允许同时向同一S-IF添加一到三种抗体。因此，即使在多次标记实验之后，也可以在同一天获得结果，这是此处描述的协议的另一个优点;传统的全接口免疫荧光标记方案通常需要3天到数周10，11，12，13，14。
石蜡包埋是另一个降低抗原性的有害步骤，也被省略了。3D结构从显微镜检查的开始到结束都保持在体外环境中。由于3D结构仍处于其生长状态，因此蛋白质表达和定位数据更好地模拟体内条件。由于该方法消除了影响样品抗原表达的步骤，因此预计结果会更准确。表1和表2展示了与传统工作流程相比，这些新方案如何消除步骤，节省实验室时间和劳动力，并降低成本和浪费产品。 
除了上述关键步骤外，另一个问题是提供一种冷冻保存介质和方法，以保存具有更高细胞活力率的样品的3D结构26，27，28，29，30，31。冷冻保存对于创建稳定的模型系统和实现类器官和球状体的生物样本库至关重要32，33。生物样本库 整个原始3D结构将允许更忠实地概括健康或疾病的自然状态。关键考虑因素是冷冻保存和类器官/球状体解冻的便利性和可靠性。 在大多数当前技术中，解冻后类器官回收率非常低，通常低于50%。然而，最近的研究表明，存活率提高的结果很有希望26，27，28，29。Lee等人证明，当他们使用含有15%DMSO 28的威斯康星大学溶液时，78%的球状体细胞在冷冻保存后存活。在Arai等人的研究中，细胞存活率增加到83%29。然而，由于3D结构无法保持相同的特性和质量，冷冻保存后的结果会受到显着影响。此外，制药和诊断环境中的良好生产规范需要无血清试剂。 传统的工作流程使用含有胎牛血清（FBS）和二甲基亚砜（DMSO）的培养基进行慢冻方法，这两者都与障碍有关。FBS是一种动物源性产品，可以有批次变化。DMSO是一种非常成功的冷冻保护剂，但长期暴露，特别是在解冻期间，可能会导致细胞毒性作用30，31。
本文还介绍了整个类器官或球体在水凝胶中的冷冻/解冻方法。该研究使用了两种用于冷冻类器官和球状体的公式：（1）含有传统冷冻溶液（FS）的10%DMSO和（2）不含血清和DMSO的冷冻保存培养基。这种冷冻保存培养基含有细胞外基质成分，与目前的配方不同。细胞外基质包括两大类大分子，蛋白聚糖和纤维蛋白，它们对于细胞成分的物理支架至关重要，但也启动组织形态发生、分化和体内平衡所需的过程34，35，36，37，38，39，40.胶原蛋白提供拉伸强度，调节细胞粘附，支持趋化性和迁移性，并指导组织发育37。此外，弹性蛋白纤维为经历重复拉伸的组织提供反冲38。第三种纤维蛋白纤连蛋白指导间质细胞外基质的组织，在介导细胞附着中起着至关重要的作用，并起到细胞外机械调节剂的作用39。Du等人已经证明了鸡胶原蛋白水解物对天然肌动球蛋白模型系统的冷冻保护作用41。他们的结果表明，胶原蛋白水解物可以抑制冰晶生长，减少蛋白质冻变性和氧化，类似于商业冷冻保护剂，并在冻融循环后提供更好的凝胶结构。 因此，在冷冻保存培养基中添加细胞外基质成分为样品提供了更安全和保护性的环境，并支持活结构在冻融后愈合。
此外，本研究描述了一种简单的方案，当活类器官和球状体仍在水凝胶中时，标记它们的细胞质膜和细胞核。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol (EtOH)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8187602500</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 30%, 50%, 70%, 80%, 90% and 96% solution and store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8222512500</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor wheat germ agglutinin and Hoechst&#160; in Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS) &#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I34406</td>
			<td>Image-IT LIVE Plasma Membrane and Nuclear Labeling Kit, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-1-Fetoprotein (AFP) Concentrated and Prediluted Polyclonal Antibody</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>CP 028 A</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-albumin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>EPR20195</td>
			<td>Store at +4 &#176;C, Dilution: 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta galactosidase antibody, Chicken polyclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>134435</td>
			<td>Store at +4 &#176;C, Dilution: 1:25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cytokeratin 5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>53121</td>
			<td>Store at +4 &#176;C, Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginase-1 Concentrated and Prediluted Rabbit Monoclonal Antibody</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>ACI 3058 A, B</td>
			<td>Store at +4 &#176;C, Dilution: 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016-500G</td>
			<td>Dissolve in Karnovsky&#39;s fixative to make 2 mM CaCl2; store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 15 mL&#160;</td>
			<td>Nest</td>
			<td>601051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 50 mL&#160;</td>
			<td>Nest</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II Microbiological Safety Cabinet Bio II Advance Plus</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>EN12469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>KM-CC17RU2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>G100-Cu</td>
			<td>Ultra-thin sections put on the grids; 100 lines/inch square mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical Point Dryer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM CPD300</td>
			<td>For drying biological samples for SEM applications in absolute acetone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB/AEC chromogen solution mixture &#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>AEC101</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Ultra 45&#176;, 40-US</td>
			<td>Use for ultra-thin sections for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide for molecular biology</td>
			<td>Biofroxx</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Plastic Pasteur Pippettes</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966-029</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y Solution Alcoholic</td>
			<td>Bright Slide</td>
			<td>2.BS01-105-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epon resin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>45359-1EA-F</td>
			<td>Epoxy Embedding Medium kit, Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum with Additive Fortifier</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P30-3304</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Solution (FS)</td>
			<td>Cellorama</td>
			<td>CellO-F</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass knife maker</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM KMR3</td>
			<td>For make glass knives in 8 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass knife strips (Size 8 mm x 25.4 mm x 400 mm)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>7890-08</td>
			<td>Use for ultra- or semi-thin sections for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde Aqueous Solution, EM grade, 25%&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16210</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 2.5% solution and store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Store at -20 C, Dilution :1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY (H+L) Secondary Antibody,Alexa, 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32933</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35502</td>
			<td>Store at +4 &#176;C,&#160; Dilution :1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>84540</td>
			<td>Store at +4 &#176;C,&#160; Dilution :1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35552</td>
			<td>Store at +4 &#176;C,&#160; Dilution :1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>84541</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Harris&#160;</td>
			<td>Bright Slide</td>
			<td>2.BS01-104-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-8065</td>
			<td>Store in nitrogen tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human/Rat OV-6 Antibody Monoclonal Mouse IgG1 Clone # OV-6</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB2020</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354248</td>
			<td>Matrigel, Basement Membrane Matrix High Concentration (HC), LDEV-free, 10 mL, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Matrigel, Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A1413201</td>
			<td>Geltrex, LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>Biotechne, R&#38;D Systems</td>
			<td>BME001-01</td>
			<td>Cultrex Ultramatrix RGF BME, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Karnovsky&#39;s fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>%2 PFA, %2.5 Glutaraldehyde in 0.15 M Cacodylate Buffer, 2 mM CaCl2; prepare fresh; use for TEM &#38; SEM samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11189-100G</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead aspartate solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 40 mg aspartic acid in 10 mL ddH2O and add 66 mg lead nitrate. Solution stabilize at 60 &#176;C and adjust pH to 5; prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead nitrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17900</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Biotek Synergy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose Device (MD)</td>
			<td>Cellorama</td>
			<td>CellO-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear-DNA stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3569</td>
			<td>Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg/mL Solution in Water, Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear-DNA stain</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>DAPI solution, Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide (OsO4) ,4%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19190</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 2% solution; store at +4 &#176;C and in airtight container; protect light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ov6 antibody</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>MAB2020</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA) solution, 4%&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.04005.1000</td>
			<td>Dissolve 4% PFA in dH2O and boil, cool and aliquot; store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution 4% in PBS, 1 L</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-281692</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), tablets</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>2810305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post-fixative solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>%2 OsO4, %2.5 Potassium Ferrocyanide in dH2O; prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferrocyanide aqueous solution, 5%&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>26603-01</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primovert - Inverted Bright Field Microscope - ZEISS</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Item no.: 491206-0001-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom microcentrifuge tubes, 2 mL</td>
			<td>Nest</td>
			<td>620611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscopy with STEM attachment</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>GeminiSEM 500</td>
			<td>We use Inlens Secondary Electron (SE) detector at 2-3 kV for scanning electron micrographs and aSTEM detector at 30 kV for transmission electron micrographs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab Pack</td>
			<td>ScyTek Laboratories</td>
			<td>SHP125</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Buffer, 0.4 M, pH 7.2</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>11655</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 0.2 M and store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium/Potassium ATPase alpha 1 antibody [M7-PB-E9]</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX22871</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution for Immunofluorescence Labeling (S-IF)</td>
			<td>Cellorama</td>
			<td>CellO-IF</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution for Immunohistochemistry (S-IHC)</td>
			<td>Cellorama</td>
			<td>CellO-P</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen trimming device</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM TRIM2</td>
			<td>For prepare epon sample block to ultramicrotome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputter coater</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM ACE200</td>
			<td>Coat the SEM samples with 6 nm gold/palladium for 90 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide (TCH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223220-5G</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 0.5% solution and filter with 0.22 &#181;m membrane filter; store at RT; prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra gel super glue</td>
			<td>Pattex</td>
			<td>PSG2C</td>
			<td>For glue polymerized epon block with sample to holder epon block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM UC7</td>
			<td>For prepare high-quality ultra- or semi-thin sections for transmission electron microscopy (TEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips, 10 &#181;L</td>
			<td>Nest</td>
			<td>171215-1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips, 1000 &#181;L</td>
			<td>Isolab</td>
			<td>L-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips, 200 &#181;L&#160;</td>
			<td>Nest</td>
			<td>110919HA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 2% solution and filter with 0.22 &#181;m membrane filter; keep tightly closed container store at RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing, freezing, processing, and imaging of entire organoids and spheroids while still in a hydrogel

类器官和球状体是细胞培养实验室中的三维生长结构，与二维培养模型相比，它们越来越被认为是优越的模型，因为它们可以更好地模仿人体并且比动物研究更具优势。然而，这些研究通常面临可重复性和一致性的问题。在漫长的实验过程中 - 在不同的细胞培养容器之间转移类器官和球状体，移液和离心 - 这些敏感和脆弱的3D生长结构经常被损坏或丢失。最终，结果会受到显着影响，因为3D结构无法保持相同的特性和质量。这里描述的方法最大限度地减少了这些压力步骤，并确保类器官和球体在整个处理过程中保持安全和一致的环境，同时它们仍在多用途装置中的水凝胶中。研究人员可以使用单个多用途设备在各种高科技仪器（从共聚焦到电子显微镜）下生长，冷冻，解冻，处理，染色，标记，然后检查类器官或微球的结构。该技术提高了研究的可重复性、可靠性和有效性，同时在加工过程中为3D生长结构保持稳定和保护性的环境。此外，消除压力大的步骤可最大限度地减少处理错误，减少所花费的时间，并降低污染风险。

本文代表了一种多用途装置（MD）和补充方法，用于培养，冷冻，解冻，组织学染色，免疫组织化学染色，免疫荧光标记，包被和处理整个类器官或球状体，同时仍然在单一的独特设计环境中的水凝胶中。目前的研究旨在制备35个MD中的35水凝胶滴剂中的HepG2肝癌球状体。 实验一式三份进行以确保准确性。此外，MD中的肺类器官被免疫荧光标记作为一个例子，以证明当前类器官研究方法的结果。
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Culturing, Freezing, Processing, and Imaging of Entire Organoids and Spheroids While Still in a Hydrogel

本研究描述了在各种显微镜下培养、冷冻、解冻、处理、染色、标记和检查整个球状体和类器官的方法，同时它们在多用途装置内的水凝胶中保持完整。

在水凝胶中培养、冷冻、处理和成像整个类器官和球状体

Organoids and spheroids, three-dimensional growing structures in cell culture labs, are becoming increasingly recognized as superior models compared to ...

类器官和球状体非常脆弱，在处理时会严重损坏。我们的实验方案确保这些3D生长结构在各种过程中保持完整，从而提高准确性、可重复性、可靠性和可重复性。研究人员可以在各种显微镜下培养、冷冻、解冻、处理、染色、标记和检查整个类器官和球状体，同时它们在单个多用途装置中的水凝胶中保持完整。它可以在一个多功能设备中创建疾病模型并跟踪顺序步骤。该技术在检查用于疾病诊断和预后的生物标志物时带来了更高的准确性。该方法可应用于任何 3D 生长系统，包括类器官、球状体、单个细胞或活生物体。要开始类器官或球状体培养，请将正确解冻的水凝胶放在层流罩内的冰上15分钟。此外，将装有肝细胞癌或HEPG2细胞沉淀的试管放在冰上。接下来，将30至35微升100%水凝胶板在预热的多用途装置的壁龛内以产生凝胶滴，将10， 000个HEPG2细胞放在水凝胶滴顶部的中心，并在37摄氏度下孵育设置15分钟。孵育后，用200微升含有10%胎牛血清或FBS的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）覆盖水凝胶滴。在将其放入培养箱之前，将盖子正确放在设备上，让气体流动。每隔一天，用含有10%FBS的200微升DMEM喂养细胞。在倒置显微镜下检查微球的生长。在开始类器官的免疫荧光标记之前，将所需的培养基和溶液预热至37摄氏度。在加入预热至37摄氏度的200微升4%多聚甲醛之前，吸出水凝胶滴周围的细胞培养基，并将其置于37摄氏度的培养箱中15至30分钟。然后，吸出固定剂并洗涤用于免疫荧光标记或SIF的溶液，预热至37摄氏度三次，每次10分钟。在继续下一步之前，将蒸馏水添加到壁龛周围的区域以提供湿度。吸出水凝胶液滴周围的SIF，并在SIF中加入100微升预热的一抗溶液，然后在37摄氏度下孵育30至60分钟。然后，吸出一抗溶液，并用预热至37摄氏度的SIF洗涤三次，每次10分钟。洗涤后，吸出剩余的SIF，并向水凝胶中加入100微升SIF预热的二抗溶液。将水凝胶在37摄氏度的黑暗中孵育30至60分钟。孵育后，吸出二抗溶液，并在黑暗中用PBS在37摄氏度下洗涤水凝胶滴剂3次，每次10分钟。接下来，吸出残留的PBS，并在黑暗中将水凝胶与含有封片剂或甘油的100微升核DNA染色剂一起孵育在37摄氏度。在紧紧关闭含有水凝胶的多用途装置之前，用甘油填充壁龛以避免干燥。要通过共聚焦显微镜检查类器官，请按照手稿中的说明设置显微镜参数。要冷冻类器官，吸出细胞培养基，加入200微升预热的冷冻溶液，并将样品在37摄氏度下孵育一小时。在将设备放入泡沫盒之前，请盖紧设备的盖子。将此泡沫盒放入另一个泡沫盒中，并紧紧关闭两个泡沫盒。将盒子在零下 20 摄氏度下放置两个小时，然后在零下 80 摄氏度的冰箱中放置过夜。要将类器官储存超过六个月，请从盒子中取出包含类器官的多用途装置并将其转移到液氮罐中。要解冻类器官，请从冰箱或液氮罐中取出含有样品的多用途装置，并将其直接放入37摄氏度的培养箱中。解冻后，轻轻吸出培养基和冷冻溶液混合物，然后加入新鲜培养基并继续对整个安装类器官水凝胶进行成像。在实时成像中，水凝胶内生长的类器官在插入细胞沉淀后三到五天变得可见，特别是在水凝胶圆顶的外围。此处显示了倒相衬显微镜下含有微球的水凝胶在不同水平上图像的时间序列。对细胞膜和细胞核进行活染色后，全安装活类器官的共聚焦显微镜图像在外围和中心显示出相似的标记密度。此外，可以使用一种抗体、两种抗体以及三种抗体成功地进行全卡口类固醇的免疫荧光标记，无需任何额外的治疗步骤。代表性分析显示设备中有两种免疫荧光标记的气道类器官。多功能装置中整个微球的SEM图像和切片类固醇的10张图像表明球状体，细胞质细胞器和其他超微结构细胞特征的3D结构保存完好，证明了所述方案的有效性。冷冻样品后，水凝胶圆顶边界处的不规则性很明显。然而，球体的大小和圆度仍然相似。解冻冷冻样品后，观察培养表面上的细胞迁移。该技术非常简单。但是，研究人员在吸出或添加水凝胶液滴周围的任何液体时应非常温和，以防止损坏样品。研究人员可以使用高科技显微镜在单个设备中观察相同的样品并进行相关研究。

Research

JoVE Journal

Biology

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科研

生物学

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