Name: culturing, freezing, processing, and imaging of entire organoids and spheroids while still in a hydrogel
Uploaded: 2022-12-23T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing, Freezing, Processing, and Imaging of Entire Organoids and Spheroids While Still in a Hydrogel at JoVE.com

Vi er taknemmelige for Dale Mertes fra University of Chicago for udarbejdelsen af diagrammer, til Dr. Mehmet Serif Aydin for hans tekniske support ved Istanbul Medipol University Research Institute for Health Sciences and Technologies og til Dr. Rana Kazemi fra Maltepe University for redigering af manuskriptet.

1. Dyrkning af organoider og sfæroider
<ol><li>Placer hydrogelen på is natten over (i køleskab eller et koldt rum) for at tø op.</li>
	<li>Anbring den kommercielt tilgængelige multifunktionsenhed (MD; se Materialetabel) i inkubatoren 1 dag før eksperimentet (37 °C, 5% CO2) for at varme.</li>
	<li>Anbring sterile brede pipettespidser i køleskabet ved 4 °C. BEMÆRK: Trin 1.1-1.3 skal udføres på dag 0, og trin 1.4-1.11 skal udføres på dag 1.</li>
	<li>Placer hyd...

MD, der supplerer formuleringer og protokoller beskrevet her, letter hurtig og spontan 3D-vækst af organoider og sfæroider i et mere kontrolleret miljø og fortsætter eksperimentet under de samme forhold. Prøven forbliver i det samme miljø under hele processen, og næsten 100% af de 3D-voksende arkitekturer forbliver intakte i beholderen. Dette forbedrer homogeniteten under de sekventielle eksperimenter og giver mulighed for en længere kulturperiode. Derudover reduceres antallet af trin under organoider og sfæroid...

Fremtiden for celleforskning og terapi ligger inden for 3D-cellekulturer 1,2,3. Organoid- og sfæroidmodeller lukker kløften mellem in vitro-eksperimenter og dyremodeller ved at skabe bedre modeller, der efterligner menneskelig kropsudvikling, fysiologi og sygdomme 4,5,6,7,8,9. Disse modellers reproducerbarhed og repeterbarhed er dog fortsat udfordrende. Desuden resulterer håndtering, høst, overførsel og centrifugering af disse strukturer med nuværende teknologier i tab eller beskadigelse af organoider og sfæroider under mange forhold, hvilket påvirker resultaterne betydeligt.

På trods af mange protokoller for histologisk farvning, immunohistokemisk farvning, immunofluorescensmærkning og kryopræservering er der ingen universel tilgang relateret til standardisering af eksperimentelle forhold, håndtering og behandling af disse sarte strukturer uden at miste eller beskadige dem. Nuværende protokoller er også utroligt lange, skiftevis fra et par dage til flere uger og inkluderer komplekse procedurer med forskellige reagenser 10,11,12,13,14. Derudover forårsager høst, pipettering, centrifugering og overførsel af 3D-voksende strukturer mellem cellekulturbeholdere og kryoviale ændringer i placeringen af strukturerne og mekaniske kræfter og påvirker i sidste ende differentieringen og modningen af organoiderne og sfæroiderne. Det er blevet rapporteret, at vævstopologi, positionering af cellerne og mekaniske kræfter påvirker celledifferentiering og modning signifikant 6,15,16,17.

Derfor er det ønskeligt at forbedre de nuværende konventionelle teknologier til at generere organoider og sfæroider med stabil kvalitet. En metode/anordning, der springer centrifugeringen og andre trin som beskrevet ovenfor over og leverer materialet i et enkelt sikkert miljø fra begyndelsen til slutningen af de mange processer, vil være gavnligt for at nå frem til de mest konsistente og pålidelige data. Derudover vil dette reducere tids-, arbejds- og omkostningsbegrænsninger.
Den multifunktionelle enhed (MD), der er beskrevet her, giver et enkelt sikkert miljø for flere processer af organoider og sfæroider (supplerende figur 1). Denne enhed og komplementeringsprotokoller eliminerer høst-, pipetterings-, overførsels- og centrifugeringstrinnene. Organoiderne og sfæroiderne forbliver i deres in vitro-miljø under de sekventielle processer. Dette miljø omfatter hovedsageligt naturlige eller syntetiske ekstracellulære matrixkomponenter, som kommercielt tilgængelige hydrogeler. Med andre ord tillader de metoder, der er beskrevet her, at en helmonteret prøve af organoider / sfæroider behandles, undersøges og fryses, mens de stadig er i en hydrogeldråbe.
Den biokompatible enhed er modstandsdygtig over for temperaturer mellem 60 °C og -160 °C, hvilket gør det muligt at genoprette organoiderne/steroiderne i en flydende nitrogentank ved -160 °C eller at forberede harpiksblokke til elektronmikroskopi ved 60 °C. Nichen i enheden er designet til at definere et begrænset rum for 3D-voksende strukturer og stimulere dannelsen af sfæroider eller organoider baseret på de tidligere undersøgelser 18,19,20,21,22,23. Den del af enheden er gennemsigtig og indeholder en specifik plast, der giver høj optisk kvalitet (brydningsindeks: 1,43; abbe-værdi: 58; tykkelse: 7,8 mil [0,0078 in eller 198 μm]). Både nichen og den omgivende 'side' del forårsager autofluorescens. Den gennemsigtige niche i midten har et 80 mm 2 område, mens sidedelen er 600 mm2. Beholderens dybde er 15 mm, og tykkelsen er 1,5 mm. Disse funktioner gør det ud over enhedens størrelse og design muligt at foretage observationer under forskellige typer højteknologisk mikroskop og forberede prøverne til elektronmikroskopiske undersøgelser (figur 2). Enhedens lukkesystem giver to positioner, den ene forseglet i fryseren og den anden tillader gasstrøm i inkubatoren. CCK8-proliferations- og cytotoksicitetsassays viser lignende virkninger på celler sammenlignet med de traditionelle cellekulturretter (supplerende figur 2). Trypan blå udelukkelsestest viser høj cellelevedygtighed (94%) under cellekulturen i MD (figur 3).
De processer, der kan udføres for en prøve i den enkelte enhed, omfatter (1) dyrkning, (2) histologisk farvning, (3) immunostaining, herunder immunohistokemisk og immunfluorescensmærkning, (4) frysning, (5) optøning, (6) undersøgelse under optiske mikroskoper, såsom brightfield, darkfield, fluorescens, konfokale og superopløsningsmikroskoper, (7) belægning og undersøgelse direkte under et scanningselektronmikroskop eller (8) forberedelse til transmissionselektronmikroskopi ( Figur 2).
Der findes forskellige metoder til histologisk farvning, immunohistokemisk mærkning eller fluorescerende mærkning af organoider og sfæroider 10,11,12,13,14,24,25. Høstning af dem fra hydrogelen er det første og vigtigste trin i den nuværende teknologi. Efter dette trin tillader nogle metoder helmonteret immunmærkning. De høstede organoider er indlejret i paraffin, sektioneret og mærket til farvning og immunostaining i andre. Afsnittene viser dog muligvis ikke hele prøven og giver kun begrænsede data relateret til strukturens 3D-arkitektur. Desuden er skader på disse 3D-strukturer og tab af antigenicitet velkendte bivirkninger af disse teknologier.
De supplerende nye protokoller for mikroskopiske undersøgelser i denne artikel tillader en analyse af helmonterede prøver, der stadig er i en hydrogel. De her beskrevne protokoller omfatter to nyudviklede formuleringer: opløsning til immunhistokemi (S-IHC) og opløsning til immunfluorescensmærkning (S-IF). Metoderne med disse løsninger giver forskere mulighed for at få mere nøjagtige data, da der ikke er nogen skadelige virkninger af traditionelle arbejdsgange, såsom centrifugering, pipettering og overførsel af de sarte strukturer. Protokollen beskrevet her eliminerer også behovet for høst, blokering, rydning og antigenhentning trin og forkorter hele proceduren til 6-8 timer. Desuden tillader metoden samtidig at tilføje et til tre antistoffer til den samme S-IF. Derfor er det muligt at få resultaterne samme dag, selv efter de mange mærkningseksperimenter, hvilket er en anden fordel ved protokollen beskrevet her; Traditionelle helmonterede immunfluorescensmærkningsprotokoller tager typisk mellem 3 dage og flere uger 10,11,12,13,14.
Paraffinindlejring, et andet skadeligt trin, der reducerer antigenicitet, udelades også. 3D-strukturen forbliver i sit in vitro-miljø fra begyndelsen til slutningen af den mikroskopiske undersøgelse. Da 3D-strukturen forbliver i sine vækstbetingelser, efterligner proteinekspressions- og lokaliseringsdataene in vivo-forholdene bedre. Der forventes mere nøjagtige resultater, da metoden eliminerer de trin, der påvirker prøvens antigenekspression. Tabel 1 og tabel 2 viser, hvordan disse nye protokoller eliminerer trin, sparer tid og arbejdskraft i laboratoriet og reducerer omkostninger og affaldsprodukter sammenlignet med traditionelle arbejdsgange.
Ud over de afgørende trin, der er beskrevet ovenfor, er et andet problem at tilvejebringe et kryopræserveringsmedium og en metode til at bevare prøvens 3D-struktur med højere cellelevedygtighedshastigheder 26,27,28,29,30,31. Kryopræservering er afgørende for at skabe et stabilt modelsystem og muliggøre biobanking af organoider og sfæroider32,33. Biobanking hele den oprindelige 3D-struktur giver mulighed for en mere trofast rekapitulering af den naturlige sundhedstilstand eller sygdom. De vigtigste overvejelser er bekvemmeligheden og pålideligheden af kryopræservering og optøning af organoider / sfæroider. Post-optøning organoid opsving er meget lav i de fleste nuværende teknologier, ofte mindre end 50%. Nylige undersøgelser har imidlertid vist lovende resultater med forbedrede overlevelsesrater26,27,28,29. Lee et al. viste, at 78% af sfæroidcellerne overlevede efter kryopræservering, da de brugte University of Wisconsin-opløsningen indeholdende 15% DMSO28. Celleoverlevelsesforholdet steg til 83% i undersøgelsen af Arai et al.29. Resultaterne efter kryopræservering påvirkes dog væsentligt, da 3D-strukturerne ikke kan opretholde de samme egenskaber og kvalitet. Derudover kræves serumfrie reagenser til god fremstillingspraksis i farmaceutiske og diagnostiske omgivelser. Traditionelle arbejdsgange bruger et medium indeholdende føtalt bovint serum (FBS) og dimethylsulfoxid (DMSO) til langsomfrysningsmetoden, som begge er forbundet med handicap. FBS er et animalsk afledt produkt og kan have batchvariationer. DMSO er et meget vellykket kryoprotektant, men langvarig eksponering, især under optøning, kan forårsage cytotoksiske virkninger30,31.
Denne artikel beskriver også fryse- / optøningsmetoden for hele organoider eller sfæroider, mens de stadig er i en hydrogel. To formler til frysning af organoider og sfæroider anvendes i undersøgelsen: (1) 10% DMSO indeholdende traditionel fryseopløsning (FS) og (2) et serum- og DMSO-frit kryopræserveringsmedium. Dette kryopræserveringsmedium indeholder ekstracellulære matrixkomponenter, som adskiller sig fra nuværende formler. Den ekstracellulære matrix består af to hovedklasser af makromolekyler, proteoglycaner og fibrøse proteiner, som er afgørende for fysiske stilladser for de cellulære bestanddele, men også initierer processer, der kræves til vævsmorfogenese, differentiering og homeostase 34,35,36,37,38,39,40 . Kollagener giver trækstyrke, regulerer celleadhæsion, understøtter kemotaxis og migration og direkte vævsudvikling37. Derudover giver elastinfibre rekyl til væv, der gennemgår gentagen strækning38. Et tredje fibrøst protein, fibronectin, styrer organisationen af den interstitielle ekstracellulære matrix og har en afgørende rolle i formidling af cellebinding og fungerer som en ekstracellulær mekano-regulator39. Du et al. har demonstreret den kryobeskyttende virkning af kyllingekollagenhydrolysat på det naturlige actomyosin-modelsystem41. Deres resultater tyder på, at kollagenhydrolysat kan hæmme iskrystalvækst, reducere proteinfrysningsdenaturering og oxidation på samme måde som kommercielle kryoprotektanter og give en bedre gelstruktur efter fryse-optøningscyklusser. Derfor giver tilføjelse af ekstracellulære matrixkomponenter til kryopræserveringsmediet et mere sikkert og beskyttende miljø for prøven og understøtter de levende strukturer til at helbrede efter frysning-optøning.
Derudover beskriver denne undersøgelse en ligetil protokol til mærkning af cytoplasmatiske membraner og kerner af levende organoider og sfæroider, mens de stadig er i hydrogelen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol (EtOH)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8187602500</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 30%, 50%, 70%, 80%, 90% and 96% solution and store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8222512500</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor wheat germ agglutinin and Hoechst&#160; in Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS) &#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I34406</td>
			<td>Image-IT LIVE Plasma Membrane and Nuclear Labeling Kit, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-1-Fetoprotein (AFP) Concentrated and Prediluted Polyclonal Antibody</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>CP 028 A</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-albumin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>EPR20195</td>
			<td>Store at +4 &#176;C, Dilution: 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta galactosidase antibody, Chicken polyclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>134435</td>
			<td>Store at +4 &#176;C, Dilution: 1:25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cytokeratin 5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>53121</td>
			<td>Store at +4 &#176;C, Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginase-1 Concentrated and Prediluted Rabbit Monoclonal Antibody</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>ACI 3058 A, B</td>
			<td>Store at +4 &#176;C, Dilution: 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016-500G</td>
			<td>Dissolve in Karnovsky&#39;s fixative to make 2 mM CaCl2; store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 15 mL&#160;</td>
			<td>Nest</td>
			<td>601051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 50 mL&#160;</td>
			<td>Nest</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II Microbiological Safety Cabinet Bio II Advance Plus</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>EN12469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>KM-CC17RU2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>G100-Cu</td>
			<td>Ultra-thin sections put on the grids; 100 lines/inch square mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical Point Dryer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM CPD300</td>
			<td>For drying biological samples for SEM applications in absolute acetone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB/AEC chromogen solution mixture &#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>AEC101</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Ultra 45&#176;, 40-US</td>
			<td>Use for ultra-thin sections for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide for molecular biology</td>
			<td>Biofroxx</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Plastic Pasteur Pippettes</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966-029</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y Solution Alcoholic</td>
			<td>Bright Slide</td>
			<td>2.BS01-105-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epon resin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>45359-1EA-F</td>
			<td>Epoxy Embedding Medium kit, Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum with Additive Fortifier</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P30-3304</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Solution (FS)</td>
			<td>Cellorama</td>
			<td>CellO-F</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass knife maker</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM KMR3</td>
			<td>For make glass knives in 8 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass knife strips (Size 8 mm x 25.4 mm x 400 mm)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>7890-08</td>
			<td>Use for ultra- or semi-thin sections for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde Aqueous Solution, EM grade, 25%&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16210</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 2.5% solution and store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Store at -20 C, Dilution :1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY (H+L) Secondary Antibody,Alexa, 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32933</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35502</td>
			<td>Store at +4 &#176;C,&#160; Dilution :1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>84540</td>
			<td>Store at +4 &#176;C,&#160; Dilution :1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35552</td>
			<td>Store at +4 &#176;C,&#160; Dilution :1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>84541</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Harris&#160;</td>
			<td>Bright Slide</td>
			<td>2.BS01-104-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-8065</td>
			<td>Store in nitrogen tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human/Rat OV-6 Antibody Monoclonal Mouse IgG1 Clone # OV-6</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB2020</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354248</td>
			<td>Matrigel, Basement Membrane Matrix High Concentration (HC), LDEV-free, 10 mL, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Matrigel, Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A1413201</td>
			<td>Geltrex, LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>Biotechne, R&#38;D Systems</td>
			<td>BME001-01</td>
			<td>Cultrex Ultramatrix RGF BME, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Karnovsky&#39;s fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>%2 PFA, %2.5 Glutaraldehyde in 0.15 M Cacodylate Buffer, 2 mM CaCl2; prepare fresh; use for TEM &#38; SEM samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11189-100G</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead aspartate solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 40 mg aspartic acid in 10 mL ddH2O and add 66 mg lead nitrate. Solution stabilize at 60 &#176;C and adjust pH to 5; prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead nitrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17900</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Biotek Synergy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose Device (MD)</td>
			<td>Cellorama</td>
			<td>CellO-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear-DNA stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3569</td>
			<td>Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg/mL Solution in Water, Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear-DNA stain</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>DAPI solution, Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide (OsO4) ,4%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19190</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 2% solution; store at +4 &#176;C and in airtight container; protect light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ov6 antibody</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>MAB2020</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA) solution, 4%&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.04005.1000</td>
			<td>Dissolve 4% PFA in dH2O and boil, cool and aliquot; store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution 4% in PBS, 1 L</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-281692</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), tablets</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>2810305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post-fixative solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>%2 OsO4, %2.5 Potassium Ferrocyanide in dH2O; prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferrocyanide aqueous solution, 5%&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>26603-01</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primovert - Inverted Bright Field Microscope - ZEISS</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Item no.: 491206-0001-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom microcentrifuge tubes, 2 mL</td>
			<td>Nest</td>
			<td>620611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscopy with STEM attachment</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>GeminiSEM 500</td>
			<td>We use Inlens Secondary Electron (SE) detector at 2-3 kV for scanning electron micrographs and aSTEM detector at 30 kV for transmission electron micrographs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab Pack</td>
			<td>ScyTek Laboratories</td>
			<td>SHP125</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Buffer, 0.4 M, pH 7.2</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>11655</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 0.2 M and store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium/Potassium ATPase alpha 1 antibody [M7-PB-E9]</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX22871</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution for Immunofluorescence Labeling (S-IF)</td>
			<td>Cellorama</td>
			<td>CellO-IF</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution for Immunohistochemistry (S-IHC)</td>
			<td>Cellorama</td>
			<td>CellO-P</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen trimming device</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM TRIM2</td>
			<td>For prepare epon sample block to ultramicrotome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputter coater</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM ACE200</td>
			<td>Coat the SEM samples with 6 nm gold/palladium for 90 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide (TCH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223220-5G</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 0.5% solution and filter with 0.22 &#181;m membrane filter; store at RT; prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra gel super glue</td>
			<td>Pattex</td>
			<td>PSG2C</td>
			<td>For glue polymerized epon block with sample to holder epon block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM UC7</td>
			<td>For prepare high-quality ultra- or semi-thin sections for transmission electron microscopy (TEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips, 10 &#181;L</td>
			<td>Nest</td>
			<td>171215-1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips, 1000 &#181;L</td>
			<td>Isolab</td>
			<td>L-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips, 200 &#181;L&#160;</td>
			<td>Nest</td>
			<td>110919HA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 2% solution and filter with 0.22 &#181;m membrane filter; keep tightly closed container store at RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing, freezing, processing, and imaging of entire organoids and spheroids while still in a hydrogel

Organoider og sfæroider, tredimensionelle voksende strukturer i cellekulturlaboratorier, bliver i stigende grad anerkendt som overlegne modeller sammenlignet med todimensionelle kulturmodeller, da de efterligner menneskekroppen bedre og har fordele i forhold til dyreforsøg. Imidlertid står disse undersøgelser ofte over for problemer med reproducerbarhed og konsistens. Under de lange eksperimentelle processer - med overførsler af organoider og sfæroider mellem forskellige cellekulturbeholdere, pipettering og centrifugering - bliver disse modtagelige og skrøbelige 3D-voksende strukturer ofte beskadiget eller tabt. I sidste ende påvirkes resultaterne væsentligt, da 3D-strukturerne ikke kan opretholde de samme egenskaber og kvalitet. De metoder, der er beskrevet her, minimerer disse stressende trin og sikrer et sikkert og ensartet miljø for organoider og sfæroider gennem hele behandlingssekvensen, mens de stadig er i en hydrogel i en multifunktionel enhed. Forskerne kan vokse, fryse, tø op, behandle, plette, mærke og derefter undersøge strukturen af organoider eller sfæroider under forskellige højteknologiske instrumenter, fra konfokale til elektronmikroskoper, ved hjælp af en enkelt multifunktionsenhed. Denne teknologi forbedrer undersøgelsernes reproducerbarhed, pålidelighed og validitet, samtidig med at der opretholdes et stabilt og beskyttende miljø for 3D-dyrkningsstrukturerne under behandlingen. Derudover minimerer eliminering af stressende trin håndteringsfejl, reducerer den tid, det tager, og mindsker risikoen for forurening.

Denne artikel repræsenterer en multifunktionel enhed (MD) og supplerende metoder til dyrkning, frysning, optøning, histologisk farvning, immunohistokemisk farvning, immunofluorescensmærkning, belægning og behandling af hele organoider eller sfæroider, mens de stadig er i en hydrogel i et enkelt unikt designet miljø. Den nuværende undersøgelse var designet til at forberede HepG2 leverkræft sfæroider i 35 hydrogel dråber i 35 MD'er. Derudover blev lungeorganoider i MD'er immunfluorescerende mærket som et eksemp...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing, Freezing, Processing, and Imaging of Entire Organoids and Spheroids While Still in a Hydrogel at JoVE.com

Culturing, Freezing, Processing, and Imaging of Entire Organoids and Spheroids While Still in a Hydrogel

Denne undersøgelse beskriver metoder til dyrkning, frysning, optøning, forarbejdning, farvning, mærkning og undersøgelse af hele sfæroider og organoider under forskellige mikroskoper, mens de forbliver intakte i en hydrogel i en multifunktionel enhed.

Dyrkning, frysning, behandling og billeddannelse af hele organoider og sfæroider, mens de stadig er i en hydrogel

Organoids and spheroids, three-dimensional growing structures in cell culture labs, are becoming increasingly recognized as superior models compared to ...

Organoider og sfæroider, der er meget skrøbelige, bliver alvorligt beskadiget under håndtering. Vores protokol sikrer, at disse 3D-voksende strukturer forbliver intakte under forskellige processer, hvilket øger nøjagtigheden, reproducerbarheden, pålideligheden og repeterbarheden. Forskeren kan dyrke, fryse, tø op, behandle, farve, mærke og undersøge hele organoider og sfæroider under forskellige mikroskoper, mens de forbliver intakte i en hydrogel inden for en enkelt multifunktionel enhed.Det muliggør oprettelse af en sygdomsmodel og sporing af sekventielle trin i en multifunktionel enhed. Teknologien giver mere nøjagtighed, når man undersøger biomarkører til diagnose og prognose for sygdomme. Denne metode kan anvendes på ethvert 3D-dyrkningssystem, herunder organoider, sfæroider, individuelle celler eller levende organismer.For at starte organoid- eller sfæroidkulturen skal du placere den korrekt optøede hydrogel på is inde i en laminær strømningshætte i 15 minutter. Hold også røret, der indeholder en pellet af det hepatocellulære karcinom eller HEPG2-celler, på is. Derefter plade 30 til 35 mikroliter 100% hydrogel inden for nichen af den forvarmede multifunktionsenhed for at skabe et geldråbe, placere 10.000 HEPG2-celler i midten af toppen af hydrogeldråben og inkubere opsætningen ved 37 grader Celsius i 15 minutter.Efter inkubation skal du dække hydrogeldråben med 200 mikroliter Dulbeccos modificerede Eagle Medium eller DMEM, der indeholder 10% føtalt bovint serum eller FBS. Placer låget korrekt på enheden, så gasstrømmen tillades, inden den placeres i inkubatoren. Hver anden dag fodres cellerne med 200 mikroliter DMEM indeholdende 10% FBS.Kontroller væksten af sfæroiderne under et omvendt mikroskop. Før du starter immunfluorescensmærkning af organoiderne, opvarmes de nødvendige medier og opløsninger til 37 grader Celsius. Aspirer cellekulturmediet omkring hydrogeldråben, før der tilsættes 200 mikroliter 4% paraformaldehyd forvarmet til 37 grader Celsius, og fikser det ved at placere det i en inkubator ved 37 grader Celsius i 15 til 30 minutter.Derefter opsuges fikseringsmidlet og vask opløsningen til immunfluorescensmærkning eller SIF, forvarmet til 37 grader Celsius tre gange i 10 minutter hver. Tilsæt destilleret vand til området omkring nichen for at give fugtighed, inden du fortsætter med de næste trin. SIF omkring hydrogeldråben aspireres, og der tilsættes 100 mikroliter af den forvarmede primære antistofopløsning i SIF til hydrogelen, inden den inkuberes ved 37 grader Celsius i 30 til 60 minutter.Derefter opsuges den primære antistofopløsning og vaskes med SIF forvarmet til 37 grader Celsius tre gange i 10 minutter hver. Efter vask aspireres den resterende SIF og tilsættes 100 mikroliter af den forvarmede sekundære antistofopløsning i SIF til hydrogelen. Inkuber hydrogelen ved 37 grader Celsius i mørke i 30 til 60 minutter.Efter inkubationen aspireres den sekundære antistofopløsning og hydrogeldråben vaskes med PBS ved 37 grader Celsius tre gange i mørke i 10 minutter hver. Derefter aspireres den resterende PBS og hydrogelen inkuberes med 100 mikroliter nuklear DNA-plet indeholdende monteringsmedium eller glycerol ved 37 grader Celsius i mørke. Fyld nichen med glycerol for at undgå tørring, før du lukker den multifunktionelle enhed, der indeholder hydrogelen, tæt.For at undersøge organoiderne ved konfokal mikroskopi skal du indstille mikroskopparametrene efter instruktionerne i manuskriptet. For at fryse organoiderne skal du opsuge cellekulturmediet, tilsæt 200 mikroliter af den forvarmede fryseopløsning og inkubere prøven ved 37 grader Celsius i en time. Luk låget på enheden tæt, før du placerer det inde i en skumkasse.Placer denne skumkasse i en anden skumkasse, og luk begge skumkasser tæt. Hold kassen ved minus 20 grader Celsius i to timer, og lad den derefter stå natten over i en minus 80 grader Celsius fryser. For at opbevare organoiderne i mere end seks måneder skal du fjerne den multifunktionelle enhed, der indeholder organoiderne, fra kasserne og overføre den til væskenitrogentanken.For at optø organoiderne skal du tage den multifunktionelle enhed, der indeholder prøven, fra enten fryseren eller væskenitrogentanken og placere den direkte i en inkubator ved 37 grader Celsius. Når den er optøet, skal du forsigtigt opsuge blandingen af medium og fryseopløsning, inden du tilføjer det friske medium og fortsætter med at afbilde den helmonterede organoidhydrogel. I levende billeddannelse blev de voksende organoider inde i hydrogelen synlige tre til fem dage efter indsættelse af cellepellet, især i periferien af hydrogelkuplen.Tidsserien af billeder på forskellige niveauer af en hydrogel indeholdende sfæroider under et omvendt fasekontrastmikroskop er vist her. Konfokale mikroskopibilleder af de helmonterede levende organoider efter levende farvning af cellemembranen og kernen viste lignende mærkningstæthed i periferien og midten. Endvidere kunne immunfluorescensmærkningen af de helmonterede steroider med succes udføres med et antistof, to antistoffer samt tre antistoffer, hvilket eliminerer ethvert behov for yderligere behandlingstrin.Den repræsentative analyse viser to immunfluorescerende mærkede luftvejsorganoider i en enhed. SEM-billeder af hele sfæroider i multifunktionsenheden og 10 billeder af sektionerede steroider indikerede velbevaret 3D-arkitektur af sfæroider, cytoplasmatiske organeller og andre ultrastrukturelle cellulære træk, hvilket viser effektiviteten af den beskrevne protokol. Uregelmæssighed ved grænserne for hydrogelkuplen var tydelig efter frysning af prøverne.Imidlertid forblev størrelsen og rundheden af sfæroiderne ens. Cellemigration på dyrkningsoverfladen blev observeret efter optøning af de frosne prøver. Teknikken er meget enkel.Forskeren skal dog være meget blid, mens han aspirerer eller tilføjer væsker omkring hydrogeldråben for at forhindre beskadigelse af prøven. Forskeren kan se på den samme prøve i en enkelt enhed ved hjælp af et højteknologisk mikroskop og gennemføre en korrelativ undersøgelse.

Research

JoVE Journal

Biology

Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Dyrkning af human Nasal epithelialceller på Air Liquid grænseflade

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Tissue Triage og Frysning af modeller af Skeletmuskel Sygdom

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

High-throughput Billede Analyse af Tumor Spheroids: Et brugervenligt program til at måle størrelsen af ​​Spheroids automatisk og præcist

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem Højtryks-Frysning og Quick Freeze Substitution af plantevævene for Transmission Electron Microscopy

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Kvantificering af Protein Expression og Co-lokalisering Brug Multiplexed immunhistokemisk farvede og Multispektral Imaging

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Encellet opløsning tredimensionel billeddannelse af intakte organoider

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

3D Dyrkning af organoider fra Intestinal Villi Epithelium under dedifferentiation

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

En platform med høj kapacitet til kultur og 3D-billeddannelse af organoider

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

Author Spotlight: The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research  

3D-dyrkning af organoider fra murinale krypter og en enkelt stamcelle til organoidforskning

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...