Subcellulær fraktionering til isolering af synaptiske komponenter fra Murine-hjernen

Synapser er de grundlæggende beregningsenheder i hjernen. Den præsenterede metode er et simpelt og værdifuldt værktøj til at studere synapserne og deres molekylære processer og også til at forstå, hvordan de kan ændres i forskellige hjernesygdomme. Denne teknik involverer en fraktionering af synaptosomstrukturer isoleret fra hjernen.

Dette gør det muligt for forskeren at fange effekter, der kan opdeles ved synapsen. Fordelingsniveauerne og aktiviteten af specifikke proteiner kan også analyseres med subsynaptisk opløsning. Denne procedure tager omkring 11 timer for en individuel forsker at gennemføre, hvis alt går glat.

En person, der aldrig har udført denne teknik, kan have svært ved længden af denne procedure, da det naturligvis vil tage lidt længere tid for en person, der ikke er bekendt med trinene. På grund af længden af denne eksperimentelle dag anbefaler vi stærkt at udføre dissektionerne med en partner, der kan hjælpe dig med at lette hurtig vævsindsamling for at sikre, at ingen prøver sættes på is i længere tid end nødvendigt. Vi anbefaler også at forberede buffere og bænkmaterialer dagen før dette eksperiment, så alt er inden for rækkevidde, når det er nødvendigt.

Dette gælder især for opsamlingsrørene. Flere alikvoter af i alt 11 subcellulære fraktioner vil blive indsamlet ved afslutningen af denne procedure. Så at have disse rør tydeligt mærket på forhånd vil gøre din dag meget lettere.

Til at begynde med skal du indsætte en fin saks under huden ved halshugningssnittet til en perikraniel dybde og lave et midtersagetalt snit op til den intranasale sutur for at trække hovedbunden tilbage fra kraniet. Arbejd fra det occipitale område mod hvert tidsmæssigt aspekt, trim fascia og muskel for at udsætte den ydre overflade af kraniet ud over hver ekstern akustisk meatus. Fastgør hovedbunden og rostralaspektet af kraniet med den ikke-dominerende hånd, og indsæt med den anden hånd en fin saks to millimeter i den kaudale side af foramen magnum, hvor rygmarven er synlig ud.

Lav et midterlinjesnit, indtil saksen når den indre overflade af intraparietalbenet. Skift saksens vinkel, så knivene løber parallelt med kraniets dorsale overflade. Fortsæt med at fremme det midsagittale snit rostrally gennem parietal- og frontalbenene ved hjælp af sagittale og interfrontale suturer som vejledning og afslut snittet lige ud over den internasale sutur.

Lav derefter et tre millimeter vinkelret snit til næsebenet, rostral til den internasale sutur, ved at placere saksen vinkelret på kraniet med hvert blad placeret ved en nasal præmaxillær sutur og gøre en jævn skåret. Mens du sikrer rostralaspektet, skal du bruge den ene side af et par teksturerede tang til forsigtigt at løfte kraniet op fra hjernen og derefter løfte det sideværts og ventralt. Gentag langs midterlinjen efter behov, derefter for den anden halvkugle, indtil hele hjerneoverfladen er udsat.

Brug buede tang eller en fin spatel løfter forsigtigt den rostrale side af hjernen. Skær de optiske og kraniale nerver for at fuldføre udskæringen fra kraniet. Homogeniser hjernerne ved hjælp af en glas downs homogenisator placeret på et isbad i 12 op ned passerer ved 500 o / min.

Hold en kort pause ved hvert nedslag for at sikre grundig homogenisering af vævet. Overfør det samlede hjernehomogenat til et 14 milliliter højhastigheds rundt bundcentrifugerør og drej det ved 800 G i 10 minutter ved fire grader Celsius for at opnå supernatanten kaldet S1.overfør S1 til et nyt centrifugerør, kassér pellet. Tag to fem mikroliter aliquoter af S1 til bicinchoninsyreassay og to 100 mikroliter aliquoter af S1 til western blot.

Spin S1 ved 9.000 G i 15 minutter ved fire grader Celsius for at opnå den synaptiske somale supernatant eller S2 og rå synaptosompellet eller P2. Tag to, 10 mikroliter aliquot S2 til bicinchoninsyreassay og to 500 mikroliter aliquoter S2 til western blot. Kassér supernatanten efter opnåelse af aliquoterne. efter centrifugering ved 9.000 G i 15 minutter ved fire grader Celsius, opnå supernatanten S2'og vasket synaptosom, P2'Kassér supernatanten og suspender P2'i tre milliliter buffer A.Undgå at resuhere den mørkerøde del i bunden af pelleten, som hovedsageligt indeholder mitokondrier.

Tag to 20 mikroliter aliquot P2'til bicinchoninsyreassay og to 100 mikroliter aliquoter P2'til western blot. Til den hypotoniske lysis af vasket synaptosom, tilføj ni volumener kølet buffer B for at resuspendere P2'og homogenisere synaptosomet i en glasdunhomogenisator. Overfør prøverne til 50 milliliter koniske centrifugerør med låg, og drej dem på en rørrevolver i et fire grader Celsius kølerum i 15 minutter.

Centrifuge den lyserede P2'ved 25.000 G i 20 minutter ved fire grader Celsius for at opnå lysis supernatant eller LS1 og lysis pellet indeholdende synaptosomale membraner eller LP1. Tag to, 50 mikroliter aliquoter LS1 til bicinchoninsyreassay og to 400 mikroliter aliquoter LS1 til western blot. Overfør LS1 til et centrifugerør med låg til ultracentrifugering.

Centrifuge LS1 i en ultracentrifugerotor med fast vinkel ved 100.000 G i 60 minutter ved fire grader Celsius for at opnå synaptisk cytosolsupernatant eller LS2 og synaptisk vesikelpellet eller LP2. Resuspend LP2 i 500 mikroliter buffer A og ved hjælp af en 23 gauge nål og en en milliliter sprøjte ren LP to med blid trituration. Tag to, 10 mikroliter aliquoter LP2 til bicinchoninsyreassay og to, 250 mikroliter aliquoter LP2 til western blot.

Overfør omkring 30 ml LS2 til centrifugalfilterenheder med en 10 miliDalton cutoff og koncentrer LS2 til ca. 0,5 milliliter ved at dreje ved 5.000 G i op til en time ved fire grader Celsius. Tag to, 10 mikroliter aliquoter koncentreret LS2 til bicinchoninisk assay og to, 250 mikroliter aliquoter koncentreret LS2 til western blot. Resuspend LP1 i en milliliter buffer B, Og tag to, 10 mikroliter alikvoter LP1 til bicinchoninsyreassay og to 50 mikroliter alikvoter af LP1 til western blot.

Juster den resterende LP1 til et endeligt volumen på 7,5 ml og en endelig saccharosekoncentration på 1,1 molar med buffer B og buffer C.Overfør derefter 7,5 ml af den resuspenderede LP1 til et 14 ml ultracentrifugerør. Overlejr forsigtigt LP1 med 3,75 ml buffer D og marker toppen af opløsningen med en pen. Derefter overlejres med ca. 1,25 ml buffer A.Og marker ligeledes toppen af opløsningen med en pen.

Balance rørene til ultracentrifugering efter vægt, ikke volumen, med dråbevis tilsætning af buffer A til inden for 10 milligram. Centrifuge ved 48.000 G i 2,5 timer ved fire grader Celsius i en svingende spand ultracentrifugerotor og erhverve billeder af de intakte gradienter for at dokumentere tydeligheden af hver saccharosegrænseflade og succesen med fraktionering. Fjern forsigtigt det overfladiske lag af 320 millimolar saccharose og gendan myelinfraktionen ved grænsefladen på 320 millimolar, 855 millimolar saccharose i et volumen på 800 mikroliter.

Pipeter op fra rørvæggen på en cirkulær måde for at sikre, at den komplette fraktion opsamles. Gendan derefter SPM-fraktionen ved grænsefladen på 855 millimolar, 1,1 millimolar saccharose i et volumen på 1000 mikroliter. Opsæt forsigtigt den resterende saccharose og genvind mitokondriepelleten ved at resuere i 200 mikroliter buffer B.Fortynd SPM-fraktionen med to volumener buffer B, og centrifuger derefter i en rotor med fast vinkel i et 3,5 ml centrifugerør.

Supernatanten kasseres, og SPM-pelleten gensuspenderes i buffer A for et endeligt volumen på 250 mikroliter. Tag to, fem mikroliter alikvoter af SPM til bicinchoninsyreassayet og del den resterende SPM i halvdelen for western blot. Elektronmikroskopibilleder af synaptosomet er vist i denne figur.

Et synaptosom, der indeholder synaptiske vesikler både før og efter synaptiske komponenter og synaptiske vesikler i en mitokondrion er vist her. Immunoblot-analyse af subcellulære fraktioner blev udført for at vurdere markører for fraktionsrenhed. Sammenlignet med det oprindelige hele hjernehomogenat afslørede analysen berigelsen af n-cadherin i den synaptiske plasmamembranfraktion, alfasynuclein i den synaptiske cytosol, synaptophysin i den synaptiske vesikelfraktion og myelinbasisk protein i myelinfraktionen.

Når fraktionsrenhed er blevet fastslået, kan kvantitativ immunoblotting bruges til at bestemme lokaliseringen af proteiner af interesse eller forespørge forskelle i proteinfordeling mellem genotyper eller behandlinger. Når du forsøger denne procedure, skal du sørge for at bruge vaskemiddelfri glasvarer, så intakt synaptosom kan indsamles. Vær også forsigtig, mens du forbereder saccharosegradienter for at sikre, at du får klare grænseflader.

Dette giver dig mulighed for med succes at isolere den synaptiske plasmamembranfraktion. Forskellige strukturelle og funktionelle analyser kan udføres for at hjælpe kvaliteten af synaptiske fraktioner såsom elektronmikroskopi, immunoblotting, proteomics og andre molekylære metoder. Neurotransmitterfrigivelse eller enzymatiske assays kan også udføres for at hjælpe synaptosomets metaboliske levedygtighed.

Isoleringen af synaptosomstrukturer var en paradigmeskiftende teknik til analyse af synapsfunktion og sammensætning. Når vi ser tidlig synaptisk dysfunktion i neurodegeneration, vil den omhyggelige dissektion af molekylære ændringer på synapseniveau hjælpe os med at udforske de molekylære mekanismer i disse lidelser.