मुराइन मस्तिष्क से सिनैप्टिक घटकों के अलगाव के लिए उपकोशिकीय विभाजन

सिनैप्स मस्तिष्क की बुनियादी कम्प्यूटेशनल इकाइयाँ हैं। प्रस्तुत विधि सिनैप्स और उनकी आणविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक सरल और मूल्यवान उपकरण है और यह भी समझने के लिए कि उन्हें विभिन्न मस्तिष्क विकारों में कैसे बदला जा सकता है। इस तकनीक में मस्तिष्क से पृथक सिनैप्टोसोम संरचनाओं का विभाजन शामिल है।

यह शोधकर्ता को उन प्रभावों को पकड़ने में सक्षम बनाता है जिन्हें सिनैप्स में विभाजित किया जा सकता है। विशिष्ट प्रोटीन के वितरण स्तर और गतिविधि का विश्लेषण सबसिनेप्टिक रिज़ॉल्यूशन के साथ भी किया जा सकता है। यदि सब कुछ सुचारू रूप से चलता है तो एक व्यक्तिगत शोधकर्ता को इस प्रक्रिया को पूरा करने में लगभग 11 घंटे लगते हैं।

एक व्यक्ति जिसने इस तकनीक का कभी प्रदर्शन नहीं किया है, उसे इस प्रक्रिया की लंबाई के साथ कठिनाई हो सकती है क्योंकि यह स्वाभाविक रूप से किसी ऐसे व्यक्ति के लिए थोड़ा अधिक समय लेगा जो चरणों से अपरिचित है। इस प्रयोगात्मक दिन की लंबाई के कारण, हम एक साथी के साथ विच्छेदन करने की अत्यधिक अनुशंसा करते हैं जो आपको त्वरित ऊतक संग्रह की सुविधा प्रदान करने में मदद कर सकता है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि बर्फ पर कोई भी नमूना आवश्यक से अधिक समय तक सेट न हो। हम इस प्रयोग को चलाने से एक दिन पहले बफर और बेंच टॉप सामग्री तैयार करने की भी सलाह देते हैं ताकि जरूरत पड़ने पर सब कुछ आसान पहुंच के भीतर हो।

यह संग्रह ट्यूबों के लिए विशेष रूप से सच है। इस प्रक्रिया के अंत तक कुल 11 उपकोशिकीय अंशों के कई एलिकोट एकत्र किए जाएंगे। इसलिए इन ट्यूबों को समय से पहले स्पष्ट रूप से लेबल करने से आपका दिन बहुत आसान हो जाएगा।

शुरू करने के लिए, पेरिक्रैनियल गहराई तक चीरा लगाने पर त्वचा के नीचे बारीक कैंची डालें और खोपड़ी से खोपड़ी को वापस लेने के लिए इंट्रानेसल सीवन तक एक मध्य चीरा लगाएं। प्रत्येक अस्थायी पहलू की ओर ओसीसीपटल क्षेत्र से काम करते हुए, प्रत्येक बाहरी ध्वनिक मांस से परे खोपड़ी की बाहरी सतह को उजागर करने के लिए प्रावरणी और मांसपेशियों को ट्रिम करें। खोपड़ी के खोपड़ी और रोस्ट्रल पहलू को गैर-प्रमुख हाथ से सुरक्षित करें और दूसरे हाथ से, फोरमेन मैग्नम के पुच्छल पक्ष में दो मिलीमीटर बारीक कैंची डालें जहां रीढ़ की हड्डी बाहर निकलती दिखाई दे रही है।

जब तक कैंची इंट्रापेराइटल हड्डी की आंतरिक सतह तक नहीं पहुंच जाती, तब तक एक मध्य रेखा चीरा लगाएं। कैंची के कोण को बदलें ताकि ब्लेड खोपड़ी की पृष्ठीय सतह के समानांतर चलें। एक गाइड के रूप में धनु और इंटरफ्रंटल सीवन का उपयोग करके पार्श्विका और ललाट हड्डियों के माध्यम से मध्य चीरा रोस्टरैली को आगे बढ़ाना जारी रखें और अंतर्नेजल सीवन से परे चीरा को समाप्त करें।

इसके बाद, नाक की हड्डी के लंबवत तीन मिलीमीटर चीरा लगाएं, जो कि खोपड़ी के लंबवत कैंची को नाक के प्रीमैक्सिलरी सीवन पर स्थित करके और एक को भी काटने के लिए खोपड़ी के लंबवत है। रोस्ट्रल पहलू को सुरक्षित करते समय, खोपड़ी को धीरे से मस्तिष्क से ऊपर उठाने के लिए बनावट बल की एक जोड़ी के एक तरफ का उपयोग करें और फिर इसे पार्श्व और उदर रूप से उठाएं। आवश्यकतानुसार मध्य रेखा के साथ दोहराएं, फिर दूसरे गोलार्ध के लिए जब तक कि पूरे मस्तिष्क की सतह उजागर न हो जाए।

घुमावदार बल या एक महीन स्पैटुला का उपयोग करके धीरे से मस्तिष्क के रोस्ट्रल पक्ष को उठाएं। खोपड़ी से छांटने को पूरा करने के लिए ऑप्टिक और कपाल नसों को काटें। 500 आरपीएम पर 12 ऊपर नीचे पास में बर्फ स्नान पर रखे गए ग्लास डाउन होमोजेनाइज़र का उपयोग करके दिमाग को समरूप करें।

ऊतक के संपूर्ण समरूपीकरण को सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक डाउनस्ट्रोक पर थोड़ी देर के लिए रुकें। कुल मस्तिष्क होमोजेनेट को 14 मिलीलीटर उच्च गति वाले गोल निचले सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और इसे चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 800 जी पर घुमाएं ताकि एस 1.ट्रांसफर एस 1 नामक सुपरनैटेंट को एक नई सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में प्राप्त किया जा सके, गोली को त्याग दिया जा सके। बिसिनकोनिनिक एसिड परख के लिए एस 1 के दो पांच माइक्रोलीटर एलिकोट और पश्चिमी धब्बा के लिए एस 1 के दो 100 माइक्रोलीटर एलिकोट लें।

सिनैप्टिक सोमल सुपरनैटेंट, या एस 2, और क्रूड सिनैप्टोसोम गोली या पी 2 प्राप्त करने के लिए 15 मिनट के लिए 9,000 जी पर एस 1 को चार डिग्री सेल्सियस पर स्पिन करें। बिसिनकोनिनिक एसिड परख के लिए एस 2 के दो, 10 माइक्रोलीटर एलिकोट और पश्चिमी धब्बा के लिए एस 2 के दो 500 माइक्रोलीटर एलिकोट लें। एलिकोट प्राप्त करने के बाद सतह पर तैरने वाले को त्याग दें। चार डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 9,000 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजिंग के बाद, सतह पर तैरने वाला एस 2 और धोया हुआ सिनैप्टोसोम प्राप्त करें, पी 2 'तीन मिलीलीटर बफर ए में सतह पर तैरने वाला और पुन: निलंबित पी 2' को छोड़ दें।

बिसिनकोनिनिक एसिड परख के लिए पी 2 के दो 20 माइक्रोलीटर एलिकोट और पश्चिमी धब्बा के लिए पी 2 के दो 100 माइक्रोलीटर एलिकोट लें। धोए गए सिनैप्टोसोम के हाइपोटोनिक लाइसिस के लिए पी 2 को पुन: निलंबित करने के लिए ठंडा बफर बी के नौ खंड जोड़ें और एक ग्लास डाउन होमोजेनाइज़र में सिनैप्टोसोम को समरूप करें। नमूनों को 50 मिलीलीटर कैप्ड शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें और उन्हें 15 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस ठंडे कमरे में ट्यूब रिवॉल्वर पर घुमाएं।

लाइसिस सुपरनैटेंट या एलएस 1 प्राप्त करने के लिए 20 मिनट के लिए 25,000 जी पर लाइस्ड पी 2 को सेंट्रीफ्यूज करें, और सिनैप्टोसोमल झिल्ली, या एलपी 1 युक्त लाइसिस गोली। बिसिंकोनिक एसिड परख के लिए एलएस 1 के दो, 50 माइक्रोलीटर एलिकोट और पश्चिमी धब्बा के लिए एलएस 1 के दो 400 माइक्रोलीटर एलिकोट लें। अल्ट्रा सेंट्रीफ्यूजेशन के लिए एलएस 1 को एक कैप्ड सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।

सिनैप्टिक साइटोसोल सुपरनैटेंट, या एलएस 2, और सिनैप्टिक पुटिका गोली, या एलपी 2 प्राप्त करने के लिए 60 मिनट के लिए 100, 000 जी पर 100, 000 जी पर एक निश्चित कोण अल्ट्रा सेंट्रीफ्यूज रोटर में सेंट्रीफ्यूज एलएस 1। बफर ए के 500 माइक्रोलीटर में एलपी 2 को पुन: निलंबित करें और 23 गेज सुई और एक मिलीलीटर सिरिंज सरासर एलपी दो का उपयोग करें। बिसिनकोनिनिक एसिड परख के लिए एलपी 2 के दो, 10 माइक्रोलीटर एलिकोट और पश्चिमी धब्बा के लिए एलपी 2 के दो, 250 माइक्रोलीटर एलिकोट लें।

एलएस 2 के लगभग 30 मिलीलीटर को 10 मिलीडल्टन कटऑफ के साथ केन्द्रापसारक फिल्टर इकाइयों में स्थानांतरित करें और चार डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे तक 5,000 ग्राम पर घूमकर एलएस 2 को लगभग 0.5 मिलीलीटर तक केंद्रित करें। बिसिंकोनिक परख के लिए केंद्रित एलएस 2 के दो, 10 माइक्रोलीटर एलिकोट लें, और पश्चिमी धब्बा के लिए केंद्रित एलएस 2 के दो, 250 माइक्रोलीटर एलिकोट। बफर बी के एक मिलीलीटर में एलपी 1 को पुन: निलंबित करें, और बिसिनकोनिनिक एसिड परख के लिए एलपी 1 के दो, 10 माइक्रोलीटर एलिकोट और पश्चिमी धब्बा के लिए एलपी 1 के दो 50 माइक्रोलीटर एलिकोट लें।

शेष एलपी 1 को 7.5 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा में समायोजित करें, और बफर बी और बफर सी के साथ 1.1 मोलर की अंतिम सुक्रोज एकाग्रता को समायोजित करें। एलपी 1 को 3.75 मिलीलीटर बफर डी के साथ सावधानीपूर्वक ओवरले करें और एक पेन के साथ घोल के शीर्ष को चिह्नित करें। फिर लगभग 1.25 मिलीलीटर बफर ए के साथ ओवरले करें और इसी तरह एक पेन के साथ घोल के शीर्ष को चिह्नित करें।

अल्ट्रा सेंट्रीफ्यूजेशन के लिए ट्यूबों को वजन से संतुलित करें, न कि मात्रा के अनुसार, बफर ए को 10 मिलीग्राम के भीतर छोड़ने के साथ। एक स्विंगिंग बकेट अल्ट्रा सेंट्रीफ्यूज रोटर में चार डिग्री सेल्सियस पर 2.5 घंटे के लिए 48,000 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज और प्रत्येक सुक्रोज इंटरफ़ेस की विशिष्टता और फ्रैक्शनेशन की सफलता का दस्तावेजीकरण करने के लिए बरकरार ग्रेडिएंट की छवियां प्राप्त करें। सावधानीपूर्वक 320 मिलीमोलर सुक्रोज की सतही परत को हटा दें और 800 माइक्रोलीटर वॉल्यूम में 320 मिलीमोलर, 855 मिलीमोलर सुक्रोज इंटरफ़ेस पर माइलिन अंश को पुनर्प्राप्त करें।

ट्यूब की दीवार से पिपेट को गोलाकार तरीके से ऊपर उठाया जाता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि पूरा अंश एकत्र किया गया है। फिर 1000 माइक्रोलीटर वॉल्यूम में 855 मिलीमोलर, 1.1 मिलीमोलर सुक्रोज इंटरफ़ेस पर एसपीएम अंश को पुनर्प्राप्त करें। शेष सुक्रोज को सावधानीपूर्वक हटा दें और बफर बी के 200 माइक्रोलीटर में पुन: निलंबन करके माइटोकॉन्ड्रियल गोली को पुनर्प्राप्त करें। एसपीएम अंश को बफर बी के दो संस्करणों के साथ पतला करें, और फिर 3.5 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एक निश्चित कोण रोटर में सेंट्रीफ्यूज करें।

सुपरनैटेंट को छोड़ दें और 250 माइक्रोलीटर की अंतिम मात्रा के लिए बफर ए में एसपीएम गोली को फिर से निलंबित करें। बिसिनकोनिनिक एसिड परख के लिए एसपीएम के दो, पांच माइक्रोलीटर एलिकोट लें और शेष एसपीएम को पश्चिमी धब्बा के लिए आधे में विभाजित करें। सिनैप्टोसोम की इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों को इस आंकड़े में दिखाया गया है।

एक सिनैप्टोसोम जिसमें सिनैप्टिक वेसिकल्स होते हैं, दोनों प्री और पोस्ट सिनैप्टिक घटक और एक माइटोकॉन्ड्रियन में सिनैप्टिक पुटिकाएं यहां दिखाई गई हैं। अंश शुद्धता के मार्करों का आकलन करने के लिए उपकोशिकीय अंशों का इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण किया गया था। जब प्रारंभिक पूरे मस्तिष्क होमोजेनेट की तुलना में, विश्लेषण ने सिनैप्टिक प्लाज्मा झिल्ली अंश में एन-कैडरिन, सिनैप्टिक साइटोसोल में अल्फा सिन्यूक्लिन, सिनैप्टिक पुटिका अंश में सिनैप्टोफिसिन और माइलिन अंश में माइलिन बेसिक प्रोटीन के संवर्धन का खुलासा किया।

एक बार अंश शुद्धता स्थापित हो जाने के बाद, मात्रात्मक इम्यूनोब्लोटिंग का उपयोग रुचि के प्रोटीन के स्थानीयकरण को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है, या जीनोटाइप या उपचार के बीच प्रोटीन वितरण में अंतर को क्वेरी किया जा सकता है। इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, डिटर्जेंट मुक्त ग्लासवेयर का उपयोग करना सुनिश्चित करें ताकि बरकरार सिनैप्टोसोम एकत्र किया जा सके। इसके अलावा, सुक्रोज ग्रेडिएंट तैयार करते समय सावधान रहें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि आप स्पष्ट इंटरफेस प्राप्त करते हैं।

यह आपको सिनैप्टिक प्लाज्मा झिल्ली अंश को सफलतापूर्वक अलग करने की अनुमति देगा। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, इम्यूनोब्लोटिंग, प्रोटिओमिक्स और अन्य आणविक तरीकों जैसे सिनैप्टिक अंशों की गुणवत्ता में सहायता के लिए विभिन्न संरचनात्मक और कार्यात्मक विश्लेषण किए जा सकते हैं। सिनैप्टोसोम की चयापचय व्यवहार्यता की सहायता के लिए न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज या एंजाइमेटिक परख भी किया जा सकता है।

सिनैप्टोसोम संरचनाओं का अलगाव सिनैप्स फ़ंक्शन और संरचना के विश्लेषण के लिए एक प्रतिमान स्थानांतरण तकनीक थी। जैसा कि हम न्यूरोडीजेनेरेशन में प्रारंभिक सिनैप्टिक डिसफंक्शन देखते हैं, सिनैप्स स्तर पर आणविक परिवर्तनों का सावधानीपूर्वक विच्छेदन हमें इन विकारों के आणविक तंत्र का पता लगाने में मदद करेगा।