이 프로토콜은 고분해능 염색체 루프 및 기타 단거리 상호 작용 기능을 보여주기 때문에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 높은 신호 대 잡음비로 뉴클레오솜 분해능을 사용하여 3D 게놈 조직을 매핑하는 것입니다. MNase 적정을 수행하려면, 1 x 10의 펠릿 1을 얼음 위에서 10분 동안 6번째 세포로 해동하고, 세포를 500 마이크로리터의 DPBS에 재현탁시키고, 세포 현탁액을 얼음 위에서 20분 동안 배양한다.
10, 실온에 5 분 동안 000 G에 원심분리기에 의하여 세포를 모으고 상층액을 제거하십시오. 펠릿화된 세포를 500마이크로리터의 MB 넘버 원 완충액에 재현탁시킵니다. 마이크로리터 MNase당 20단위의 바이알 1개를 해동하고 본문에 설명된 대로 소화 조건을 위해 10밀리몰 트리스로 희석합니다.
10-20초의 적절한 시간 간격으로 첫 번째 MNase 분해 용액 1마이크로리터를 4개의 샘플의 튜브 중 하나에 넣고 와류한 다음 섭씨 37도의 ThermoMixer에서 800RPM으로 10분 동안 배양합니다. 나머지 MNase 희석액에서 1마이크로리터를 다른 세포 부분 표본에 계속 추가합니다. 200 마이크로리터의 갓 준비된 정지 완충액을 MNase가 첨가된 동일한 순서와 동일한 시간 간격으로 각 튜브에 첨가하여 MNase 분해를 중지합니다.
섭씨 65도에서 2시간 동안 배양합니다. 각 샘플에 500마이크로리터의 PCI를 추가하고 볼텍싱으로 완전히 혼합합니다. 19, 800 G에서 상(異)을 분리하기 위해 실온에서 5분 동안 원심분리기.
그리고 수성 상을 새 튜브로 옮깁니다. 제조업체의 지침에 따라 상용 DNA 정제 키트를 사용하여 DNA를 정제하고 12마이크로리터의 용출 버퍼에서 샘플을 용리합니다. 정제된 DNA 샘플에 2-5 마이크로리터의 로딩 염료를 첨가합니다.
1.5% 아가로스 겔에서 샘플을 실행하고 실험에 가장 적합한 분해 정도를 선택합니다. 최적의 소화도는 핵하 분절이 거의 또는 전혀 나타나지 않으며, 70 내지 90%모노 대 디뉴클레오솜 비율을 나타낸다. 이 대표 샘플에서는 후속 실험을 위해 3번 레인과 4번 레인 사이의 중간 소화도가 선택되었습니다.
MNase 적정에 따라 각 샘플 부분 표본에 적절한 양의 MNase를 첨가하여 크로마틴을 분해합니다. 잘 섞고 섭씨 37도, 800RPM의 ThermoMixer에서 10분 동안 배양합니다. 각 부분 표본에 1.6 마이크로 리터의 0.5 몰 EGTA를 첨가하여 MNase 분해를 중지하고 섭씨 65도의 ThermoMixer에서 800 RPM으로 10 분 동안 배양합니다.
10, 실온에 5 분 동안 000 G에 원심분리에 의하여 표본을 모으고, 상층액을 폐기하십시오. 세포 펠릿을 500 마이크로리터의 1X NEB 완충액 2.1에 재현탁시킵니다. 추가 처리를 위해 5 곱하기 10의 입력에 해당하는 샘플을 6번째 셀에 풀링합니다.
근접 결찰을 진행하기 전에 샘플의 10%를 입력 대조군으로 전송하여 MNase 분해 수준을 모니터링합니다. 150 마이크로 리터의 10 밀리 몰 트리스, 25 마이크로 리터의 10 % SDS, 25 마이크로 리터의 20 밀리리터 단백질 분해 효소 K를 소화 조절에 첨가하고 섭씨 65도에서 밤새 배양합니다. 10, 4 섭씨 온도에 5 분 동안 000 G에 원심분리에 의하여 잔여 표본을 모으고 상층액을 폐기하십시오.
펠릿을 90 마이크로 리터의 갓 준비한 Micro-C 마스터 믹스 1에 재현탁시키고 섭씨 37도, 800 RPM의 ThermoMixer에서 15 분 동안 배양합니다. 마이크로리터 Klenow 단편당 5단위의 10마이크로리터를 추가하고 ThermoMixer에서 배양합니다. 그런 다음 갓 준비한 Micro-C 마스터 믹스 2개 100마이크로리터를 추가합니다.
섭씨 25도, 800RPM에서 45분 동안 배양하고 본문에 설명된 대로 EDTA로 효소 반응을 소멸시킵니다. 섭씨 65도, 800RPM에서 20분 동안 열 믹서에서 배양합니다. 10, 4 섭씨 온도에 5 분 동안 000 G에 원심분리에 의하여 표본을 모으고, 상층액을 폐기하십시오.
샘플을 500 마이크로리터의 갓 준비한 Micro-C 마스터 믹스 3에 재현탁시키고 15-20 RPM의 실온에서 2.5시간 동안 배양합니다. 원심분리를 반복하고 상층액을 제거합니다. 그런 다음 200 마이크로리터의 갓 준비한 Micro-C 마스터 믹스 4에 샘플을 재현탁시키고 섭씨 37도로 설정된 ThermoMixer에서 800RPM에서 15분 동안 배양합니다.
역 가교 및 탈단백질화를 위해 25 마이크로리터의 마이크로리터당 20 밀리그램의 proteinase K와 25 마이크로리터의 10%SDS를 샘플에 첨가하고 간헐적 혼합으로 섭씨 65도에서 밤새 배양합니다. 500 마이크로리터의 PCI를 샘플과 입력 컨트롤에 추가한 다음 소용돌이로 혼합합니다. 19, 800G에서 5분 동안 원심분리하여 상을 분리하고, 상부 수성상을 새 튜브로 옮긴다.
DNA를 농축하고 샘플을 30마이크로리터로 용리하고 입력 대조군은 15마이크로리터로 용리합니다. 1.5% 아가로스 겔을 실행하여 단핵구체와 디뉴클레오솜을 분리합니다. 디뉴클레오솜 크기의 DNA 단편을 절제하고 본문에 설명된 대로 DNA를 추출합니다.
150 마이크로리터의 사전 준비된 비드를 150 마이크로리터의 샘플에 첨가하고 실온에서 배양합니다. 튜브를 적절한 자석에 놓고 용액이 맑아질 때까지 기다립니다. 상층액을 제거하고 비드를 300마이크로리터의 1X TBW에 재현탁하고 이 단계를 반복합니다.
자기 분리를 반복하고 용액이 제거된 후 상층액을 제거하고 비드를 100마이크로리터의 0.1X TE에 재현탁시킵니다. 50 마이크로리터의 0.1X TE에서 반복하고 재현탁합니다. 용액을 PCR 튜브로 옮기고 텍스트에 설명된 대로 DNA 조작을 수행합니다. 어댑터 결찰이 완료된 후 샘플을 1X TBW로 세척하고 상층액을 버리고 비드를 20마이크로리터의 0.1X TE에 재현탁시킵니다. PCR 주기의 수를 낙관하고 원본에서 기술된 대로 순서 도서관을 증폭하십시오. 250에서 Chromatin, 반응 당 000의 세포는 MNase의 4배 희석으로 소화되었다.
가장 높은 농도인 10단위는 거의 독점적으로 단핵체 DNA로 구성된 과소화된 염색질을 보여주었습니다. 250의 MNase의 0.625 단위를 가진 000의 쥐 ES 세포의 소화는 Micro-C 실험에 있는 준비적인 소화를 위한 가장 유망한 출발점을 제안했다. 그러나, 100만 세포당 5단위에 해당하는 레인 3과 4에 표시된 조건 사이의 중간 MNase 농도를 고려해야 합니다.
근접 결찰된 모노뉴클레오솜 밴드는 디뉴클레오솜과 유사한 300 염기쌍의 대략적인 크기를 가졌다. 따라서 모노 대 디뉴클레오솜 밴드 신호 비율은 주로 모노뉴클레오솜에서 디뉴클레오솜으로 이동했습니다. 준비된 염기서열분석 라이브러리의 품질 및 수량은 최소 PCR을 통해 평가하였다.
시각화 결과 420개의 염기쌍에서 하나의 뚜렷한 밴드가 나타났으며, 어댑터 이량체에 대한 밴드는 없었습니다. 이 연구의 두 샘플 모두 높은 맵 비율을 보였지만 좋은 샘플은 시스 판독 비율이 더 높았습니다. transchromosomal 상호 작용의 높은 비율은 무작위 결찰 사건을 나타내지만 일부 transchromosomal 상호 작용이 중요할 수 있습니다.
또한 양호한 샘플은 500 염기쌍 미만의 거리에서 적당한 비율의 정방향-역방향 매핑 읽기 쌍을 가졌습니다. 이는 2개의 근접 결찰된 뉴클레오솜과 유사한 크기를 갖는 MNase에 의해 절단되지 않은 디뉴클레오솜의 낮은 비율을 나타냈다. 적절한 MNase 분해도는 이 실험에 매우 중요합니다.
과소화된 뉴클레오솜은 비효율적으로 연결되며, 소화 부족 염색질은 염기서열분석 라이브러리를 오염시킬 수 있는 소화되지 않은 디뉴클레오솜의 상당 부분을 가지고 있습니다. Micro-C는 매우 높은 해상도로 유전자좌 특이적 게놈 조직을 매핑하기 위한 캡처 접근 방식과 결합할 수 있습니다.
