Kartlegging av pattedyrs 3D-genominteraksjoner med Micro-C-XL

Denne protokollen er viktig da den viser kromosomløkker med høy oppløsning og andre interaksjonsfunksjoner med kort rekkevidde. Den største fordelen med denne teknikken er kartlegging av 3D-genomorganisasjonen med nukleosomoppløsning med høyt signal-støy-forhold. For å utføre MNase-titreringen, tine en pellet på en gang 10 til den sjette cellen på is i 10 minutter, og resuspendere cellene i 500 mikroliter DPBS, og inkuber cellesuspensjonen på is i 20 minutter.

Samle cellene ved sentrifugering ved 10.000 g i fem minutter ved romtemperatur og fjern supernatanten. Resuspender de pelleterte cellene i 500 mikroliter MB Nummer én buffer. Tine ett hetteglass med 20 enheter per mikroliter MNase, og fortynn det med 10 millimolar Tris for fordøyelsesforholdene som beskrevet i teksten.

Med passende tidsintervaller på 10 til 20 sekunder, tilsett en mikroliter av den første MNase fordøyelsesløsningen til en av de fire prøverørene, virvel og inkuber i en ThermoMixer ved 37 grader Celsius i 10 minutter ved 800 RPM. Fortsett å legge til en mikroliter fra de resterende MNase-fortynningene til de andre cellealikotene. Stopp MNase-fordøyelsen ved å tilsette 200 mikroliter nytilberedt stoppbuffer til hvert rør i samme rekkefølge og samme tidsintervall som MNase ble tilsatt.

Inkuber ved 65 grader Celsius i to timer. Tilsett 500 mikroliter PCI til hver prøve, og bland grundig ved vortexing. Sentrifuge ved 19.800 g i fem minutter ved romtemperatur for å skille fasene.

Og overfør den vandige fasen til nye rør. Rens DNA ved hjelp av et kommersielt DNA-rensingssett i henhold til produsentens instruksjoner, og eluer prøvene i 12 mikroliter elueringsbuffer. Tilsett to til fem mikroliter lastfargestoff til den rensede DNA-prøven.

Kjør prøvene på en 1,5% agarosegel, og velg den beste graden av fordøyelse for forsøket. En optimal fordøyelsesgrad viser lite eller ingen subnucleosomale fragmenter, og et 70 til 90% mono til dinukleosomforhold. I dette representative utvalget ble en middels fordøyelsesgrad mellom felt tre og fire valgt for oppfølgingsforsøk.

Basert på MNase-titreringen, fordøy kromatinet ved å tilsette riktig mengde MNase til hver prøvealikot. Bland godt og inkuber i ThermoMixer ved 37 grader Celsius, 800 o / min i 10 minutter. Stopp MNase-fordøyelsen ved å tilsette 1,6 mikroliter 0,5 molar EGTA til hver alikot, og inkuber i en ThermoMixer ved 65 grader Celsius i 10 minutter med 800 RPM risting.

Samle prøven ved sentrifugering ved 10.000 g i fem minutter ved romtemperatur, og kast supernatanten. Resuspender cellepelleten i 500 mikroliter 1X NEB-buffer 2.1. Bassengprøver tilsvarende en inngang på fem ganger 10 til den sjette cellen eller mindre for videre behandling.

Før du går videre til nærhetsligeringen, overfør 10% av prøven som en inngangskontroll for å overvåke MNase-fordøyelsesnivået. Tilsett 150 mikroliter 10 millimolar Tris, 25 mikroliter 10% SDS og 25 mikroliter 20 milligram per milliliter proteinase K til fordøyelseskontrollen, og inkuber over natten ved 65 grader Celsius. Samle den gjenværende prøven ved sentrifugering ved 10.000 G i fem minutter ved fire grader Celsius og kast supernatanten.

Bryt pelleten i 90 mikroliter nylaget Micro-C master mix en, og inkuber i en ThermoMixer ved 37 grader Celsius, 800 RPM i 15 minutter. Tilsett 10 mikroliter fem enheter per mikroliter Klenow-fragment og inkuber i en ThermoMixer. Deretter tilsettes 100 mikroliter nylaget Micro-C master mix to.

Inkuber i 45 minutter ved 25 grader Celsius, 800 RPM, og slukk den enzymatiske reaksjonen med EDTA som beskrevet i teksten. Inkuber i en termoblander i 20 minutter ved 65 grader Celsius, 800 RPM. Samle prøven ved sentrifugering ved 10.000 G i fem minutter ved fire grader Celsius, og kast supernatanten.

Resuspend prøven i 500 mikroliter nylaget Micro-C master mix tre, og inkuber i 2,5 timer ved romtemperatur ved 15 til 20 RPM. Gjenta sentrifugeringen og fjern supernatanten. Deretter resuspenderer prøven i 200 mikroliter nylaget Micro-C master mix fire, og inkuber i et ThermoMixer-sett ved 37 grader Celsius i 15 minutter ved 800 RPM.

For omvendt tverrbinding og deproteinering, tilsett 25 mikroliter 20 milligram per mikroliter proteinase K og 25 mikroliter 10% SDS til prøven, og inkuber ved 65 grader Celsius over natten med intermitterende blanding. Tilsett 500 mikroliter PCI til prøvene og inngangskontroll, og bland deretter med vortexing. Separer fasene ved sentrifugering ved 19.800 g i fem minutter, og overfør den øvre vandige fase til et nytt rør.

Konsentrer DNA og eluer prøvene i 30 mikroliter, og inngangskontrollene i 15 mikroliter. Kjør en 1,5% agarosegel for å skille mononukleosomene og dinukleosomene. Excise DNA-fragmentene som har en dinukleosomal størrelse, og trekk ut DNA som beskrevet i teksten.

Tilsett 150 mikroliter ferdigbehandlede perler til 150 mikroliter av prøven, og inkuber ved romtemperatur. Plasser rørene i en passende magnet og vent til oppløsningen er klar. Fjern supernatanten og resuspender perlene i 300 mikroliter på 1X TBW, og gjenta dette trinnet.

Gjenta den magnetiske separasjonen, og etter at løsningen er klar, fjern supernatanten og resuspender perlene i 100 mikroliter 0,1X TE. Gjenta og resuspender i 50 mikroliter 0,1X TE. Overfør løsningen til PCR-rør og utfør DNA-manipulasjonen som beskrevet i teksten. Etter at adapterligering er fullført, vask prøven i 1X TBW, kast supernatanten og resuspender perlene i 20 mikroliter 0,1X TE. Optimaliser antall PCR-sykluser og forsterk sekvensbibliotekene som beskrevet i teksten. Kromatin fra 250 000 celler per reaksjon ble fordøyd med en firefold fortynning av MNase.

Den høyeste konsentrasjonen, 10 enheter, viste overfordøyd kromatin nesten utelukkende bestående av mononukleosomalt DNA. Fordøyelsen av 250 000 muse-ES-celler med 0,625 enheter MNase ga det mest lovende utgangspunktet for preparative fordøyelser i Micro-C-eksperimenter. Imidlertid bør en mellomliggende MNase-konsentrasjon mellom forholdene vist i bane tre og fire, tilsvarende fem enheter per 1 million celler, vurderes.

Nærhetsligert mononukleosombånd hadde en omtrentlig størrelse på 300 basepar, lik den for dinukleosomer. Derfor skiftet signalforholdet mono til dinukleosomalt bånd fra overveiende mononukleosomer mot dinukleosomer. Kvaliteten og kvantiteten på det preparerte sekvenseringsbiblioteket ble vurdert ved hjelp av minimal PCR.

Visualisering viste ett distinkt bånd ved 420 basepar, og ingen bånd for adapterdimerer. Mens begge prøvene i denne studien viste høye kartfrekvenser, hadde det gode utvalget en høyere andel cis-avlesninger. En høy grad av transkromosomale interaksjoner indikerer tilfeldige ligeringshendelser, selv om noen transkromosomale interaksjoner kan være viktige.

I tillegg hadde det gode utvalget en moderat frekvens av forover-omvendt kartlegging av lesepar, med avstander mindre enn 500 basepar. Dette indikerte en lav frekvens av dinukleosomer som ikke ble spaltet av MNase som har en tilsvarende størrelse som to nærhetsligerte nukleosomer. En riktig MNase fordøyelse grad er avgjørende for dette eksperimentet.

Overfordøyde nukleosomer er ineffektivt ligert, og underfordøyd kromatin har en stor brøkdel av ufordøyd dinukleosomer som kan forurense sekvenseringsbiblioteket. Micro-C kan kombineres med en fangsttilnærming for å kartlegge locus-spesifikk genomorganisasjon med enormt høy oppløsning.