Name: use of time-lapse microscopy and stage-specific nuclear depletion of proteins to study meiosis in s. cerevisiae
Uploaded: 2022-10-11T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae at JoVE.com

نشكر مركز التصوير المجهري الضوئي في جامعة إنديانا. تم دعم هذا العمل بمنحة من المعاهد الوطنية للصحة (GM105755).

1. إعداد المواد اللازمة
<ol><li>تحضير الكواشف لنمو وتبويض خلايا الخميرة. ملاحظة: إذا كانت سلالات الخميرة الناشئة هي ade2 - و trp1- ، استكمل جميع الوسائط في الخطوات 1.1.1-1.1.3 بتركيز نهائي قدره 0.01٪ أدينين و 0.01٪ تريبتوفان من مخزون 1٪. في حالة تعقيم الوسائط بواسطة الأوتوكلاف ، أضف هذه ?...

<ol>
	<li>Tsuchiya, D., Gonzalez, C., Lacefield, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+checkpoint+protein+Mad2+regulates+APC/C+activity+during+prometaphase+and+metaphase+of+meiosis+I+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The spindle checkpoint protein Mad2 regulates APC/C activity during prometaphase and metaphase of meiosis I in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (16), 2848-2861 (2011).</li><li>Cairo, G., MacKenzie, A. M., Lacefield, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+requirement+for+Bub1+and+Bub3+in+regulation+of+meiotic+versus+mitotic+chromosome+segregation.">Differential requirement for Bub1 and Bub3 in regulation of meiotic versus mitotic chromosome segregation.</a> Journal of Cell Biology. 219 (4), 201909136 (2020).</li><li>van Werven, F. J., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+entry+into+gametogenesis.">Regulation of entry into gametogenesis.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 366 (1584), 3521-3531 (2011).</li><li>Carlile, T. M., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+I+is+established+through+division-specific+translational+control+of+a+cyclin.">Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin.</a> Cell. 133 (2), 280-291 (2008).</li><li>Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+landmark+events+in+meiosis+by+the+CDK+Cdc28+and+the+meiosis-specific+kinase+Ime2.">Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2.</a> Genes and Development. 17 (12), 1524-1539 (2003).</li><li>Xu, L., Ajimura, M., Padmore, R., Klein, C., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NDT80,+a+meiosis-specific+gene+required+for+exit+from+pachytene+in+Saccharomyces+cerevisiae.">NDT80, a meiosis-specific gene required for exit from pachytene in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6572-6581 (1995).</li><li>Chu, S., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gametogenesis+in+yeast+is+regulated+by+a+transcriptional+cascade+dependent+on+Ndt80.">Gametogenesis in yeast is regulated by a transcriptional cascade dependent on Ndt80.</a> Molecular Cell. 1 (5), 685-696 (1998).</li><li>Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anchor-away+technique:+rapid,+conditional+establishment+of+yeast+mutant+phenotypes.">The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes.</a> Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).</li><li>Borek, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteomic+landscape+of+centromeric+chromatin+reveals+an+essential+role+for+the+Ctf19(CCAN)+complex+in+meiotic+kinetochore+assembly.">The proteomic landscape of centromeric chromatin reveals an essential role for the Ctf19(CCAN) complex in meiotic kinetochore assembly.</a> Current Biology. 31 (2), 283-296 (2021).</li><li>Mehta, G. D., Agarwal, M., Ghosh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+kinetochore+protein,+Ctf19+in+meiosis+I:+an+implication+of+differential+impact+of+Ctf19+on+the+assembly+of+mitotic+and+meiotic+kinetochores+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Functional characterization of kinetochore protein, Ctf19 in meiosis I: an implication of differential impact of Ctf19 on the assembly of mitotic and meiotic kinetochores in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Microbiology. 91 (6), 1179-1199 (2014).</li><li>Ortiz, J., Stemmann, O., Rank, S., Lechner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+protein+complex+consisting+of+Ctf19,+Mcm21,+and+Okp1+represents+a+missing+link+in+the+budding+yeast+kinetochore.">A putative protein complex consisting of Ctf19, Mcm21, and Okp1 represents a missing link in the budding yeast kinetochore.</a> Genes and Development. 13 (9), 1140-1155 (1999).</li><li>Hyland, K. M., Kingsbury, J., Koshland, D., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ctf19p:+A+novel+kinetochore+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae+and+a+potential+link+between+the+kinetochore+and+mitotic+spindle.">Ctf19p: A novel kinetochore protein in Saccharomyces cerevisiae and a potential link between the kinetochore and mitotic spindle.</a> Journal of Cell Biology. 145 (1), 15-28 (1999).</li><li>Fernius, J., Marston, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+cohesion+at+the+pericentromere+by+the+Ctf19+kinetochore+subcomplex+and+the+replication+fork-associated+factor,+Csm3.">Establishment of cohesion at the pericentromere by the Ctf19 kinetochore subcomplex and the replication fork-associated factor, Csm3.</a> PLoS Genetics. 5 (9), 1000629 (2009).</li><li>Meyer, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ipl1/Aurora-B+is+necessary+for+kinetochore+restructuring+in+meiosis+I+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Ipl1/Aurora-B is necessary for kinetochore restructuring in meiosis I in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (17), 2986-3000 (2015).</li><li>Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+sporulation+conditions+for+different+Saccharomyces+cerevisiae+strain+backgrounds.">Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds.</a> Methods in Molecular Biology. 557, 21-26 (2009).</li><li>Deutschbauer, A. M., Davis, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+trait+loci+mapped+to+single-nucleotide+resolution+in+yeast.">Quantitative trait loci mapped to single-nucleotide resolution in yeast.</a> Nature Genetics. 37 (12), 1333-1340 (2005).</li><li>Ben-Ari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+linked+genes+participate+in+controlling+sporulation+efficiency+in+budding+yeast.">Four linked genes participate in controlling sporulation efficiency in budding yeast.</a> PLoS Genetics. 2 (11), 195 (2006).</li><li>Primig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+core+meiotic+transcriptome+in+budding+yeasts.">The core meiotic transcriptome in budding yeasts.</a> Nature Genetics. 26 (4), 415-423 (2000).</li><li>Spencer, F., Gerring, S. L., Connelly, C., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+chromosome+transmission+fidelity+mutants+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Mitotic chromosome transmission fidelity mutants in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 124 (2), 237-249 (1990).</li><li>Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+source+dependent+promoters+in+yeasts.">Carbon source dependent promoters in yeasts.</a> Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).</li><li>Byers, B., Goetsch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+pachytene+arrest+of+Saccharomyces+cerevisiae+at+elevated+temperature.">Reversible pachytene arrest of Saccharomyces cerevisiae at elevated temperature.</a> Molecular and General Genetics. 187 (1), 47-53 (1982).</li><li>Winter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sum1/Ndt80+transcriptional+switch+and+commitment+to+meiosis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (1), 1-15 (2012).</li><li>Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporulation+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).</li><li>Robinett, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+al.+In+vivo+localization+of+DNA+sequences+and+visualization+of+large-scale+chromatin+organization+using+lac+operator/repressor+recognition.">C. al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition.</a> Journal of Cell Biology. 135, 1685-1700 (1996).</li><li>Straight, A. F., Belmont, A. S., Robinett, C. C., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP+tagging+of+budding+yeast+chromosomes+reveals+that+protein-protein+interactions+can+mediate+sister+chromatid+cohesion.">GFP tagging of budding yeast chromosomes reveals that protein-protein interactions can mediate sister chromatid cohesion.</a> Current Biology. 6 (12), 1599-1608 (1996).</li><li>Sym, M., Engebrecht, J. A., Roeder, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZIP1+is+a+synaptonemal+complex+protein+required+for+meiotic+chromosome+synapsis.">ZIP1 is a synaptonemal complex protein required for meiotic chromosome synapsis.</a> Cell. 72 (3), 365-378 (1993).</li><li>Scherthan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+mobility+during+meiotic+prophase+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Chromosome mobility during meiotic prophase in Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16934-16939 (2007).</li></ol>

يجمع هذا البروتوكول بين نظام NDT80-in لمزامنة الخلايا ، وتقنية المرساة بعيدا لاستنفاد البروتينات من النواة ، والفحص المجهري الفاصل الزمني الفلوري لتصوير خلايا الخميرة الناشئة أثناء الانقسام الاختزالي. نظام NDT80-in هو طريقة لمزامنة دورة الخلية الاختزالية التي تستخدم الطور الأولي للق...

تعد النسخة المجهرية الفلورية ذات الفاصل الزمني أداة قيمة لدراسة ديناميكيات فصل الكروموسوم الاختزالي في الخميرة الناشئة 1,2. يمكن حث خلايا الخميرة الناشئة على الخضوع للانقسام الميوزي من خلال تجويع العناصر الغذائية الرئيسية3. أثناء الانقسام الميوزي، تخضع الخلايا لجولة واحدة من فصل الكروموسومات يتبعها قسمان لتكوين أربعة نواتج اختزالية يتم تعبئتها في جراثيم (الشكل 1). يمكن تصور الخلايا الفردية خلال كل مرحلة من مراحل الانقسام الاختزالي ، والتي تولد بيانات مكانية وزمانية يمكن تفويتها بسهولة عن طريق التصوير بالخلايا الثابتة. يوضح هذا البروتوكول كيف يمكن استخدام الجمع بين الفحص المجهري الفلوري بفاصل زمني مع طريقتين تم تحديدهما مسبقا ، نظام NDT80 القابل للحث (NDT80-in) وتقنية المرساة بعيدا ، لدراسة وظيفة بروتينات معينة في مراحل اختزالية متميزة.
يعد نظام NDT80-in أداة قوية لمزامنة دورة الخلية الاختزالية التي تعتمد على التعبير المستحث لعامل نسخ الانقسام الاختزالي الأوسط NDT80 4,5. تعبير NDT80 مطلوب للخروجمن الطور الأول 6,7. مع نظام NDT80-in ، يكون NDT80 تحت سيطرة مروج GAL1-10 في الخلايا التي تعبر عن عامل النسخ Gal4 المنصهر في مستقبل هرمون الاستروجين (Gal4-ER) 4,5. نظرا لأن Gal4-ER يدخل النواة فقط عندما يرتبط ب β-استراديول ، فإن خلايا NDT80-in تتوقف في الطور التمهيدي الأول في غياب β-استراديول ، مما يسمح بمزامنة الخلايا في الطور التمهيدي الأول (الشكل 1). تعزز إضافة β-استراديول نقل عامل النسخ Gal4-ER إلى النواة ، حيث تربط GAL1-10 لدفع التعبير عن NDT80 ، مما يؤدي إلى الدخول المتزامن إلى الانقسامات الاختزالية. على الرغم من أنه يمكن إجراء الفحص المجهري بفاصل زمني دون تزامن ، إلا أن ميزة استخدام التزامن هي القدرة على إضافة مثبط أو دواء بينما تكون الخلايا في مرحلة معينة من الانقسام الاختزالي.
تقنية المرساة هي نظام قابل للتحريض يمكن من خلاله استنفاد البروتين من النواة مع إضافة رابامايسين8. هذه التقنية مثالية لدراسة البروتينات النووية أثناء الانقسام الخلوي في الخميرة الناشئة؛ لأن خلايا فطر الخميرة تخضع للانقسام الميتوزي المغلق والانقسام الميوزي، حيث لا يتفكك الغلاف النووي. علاوة على ذلك ، هذه التقنية مفيدة جدا للبروتينات التي لها وظائف متعددة خلال الانقسام الميوزي. على عكس عمليات الحذف أو الأليلات الطافرة أو الأليلات الفارغة الاختزالية ، فإن إزالة البروتين المستهدف من النواة في مرحلة معينة لا يضر بنشاط البروتين المستهدف في المراحل المبكرة ، مما يسمح بتفسير أكثر دقة للنتائج. يستخدم نظام المرساة بعيدا نقل الوحدات الفرعية الريبوسومية بين النواة والسيتوبلازم الذي يحدث عند نضوج الريبوسوم8. لاستنفاد البروتين المستهدف من النواة ، يتم تمييز البروتين المستهدف بمجال ربط FKBP12-rapamycin (FRB) في سلالة يتم فيها تمييز الوحدة الفرعية الريبوسومية Rpl13A ب FKBP12. بدون راباميسين ، لا يتفاعل FRB و FKBP12 ، ويبقى البروتين الموسوم ب FRB في النواة. عند إضافة rapamycin ، يشكل rapamycin مركبا مستقرا مع FKBP12 و FRB ، ويتم نقل المجمع خارج النواة بسبب التفاعل مع Rpl13A (الشكل 1). لمنع موت الخلايا عند إضافة رابامايسين ، تؤوي الخلايا طفرة TOR1-1 لجين TOR1 . بالإضافة إلى ذلك ، تحتوي هذه الخلايا على fpr1Δ ، وهو أليل فارغ من بروتين S. cerevisiae FKBP12 ، والذي يمنع Fpr1 الداخلي من التفوق على Rpl13A-FKBP12 لربط FRB و rapamycin. لا تؤثر طفرات الخلفية البعيدة ، tor1-1 و fpr1Δ ، على التوقيت الاختزالي أو فصل الكروموسوم2.
لإثبات فائدة هذه التقنية ، تم استنفاد بروتين كينيتوخور Ctf19 في نقاط زمنية مختلفة طوال الانقسام الاختزالي. Ctf19 هو أحد مكونات الحركية التي يمكن الاستغناء عنها في الانقسام الميتوزي ولكنها مطلوبة لفصل الكروموسومات بشكل صحيح في الانقسام الميوزي9،10،11،12،13. في الانقسام الاختزالي ، يتم إلقاء الحركية في الطور التمهيدي الأول ، و Ctf19 مهم لإعادة تجميع الحركية 9,14. بالنسبة لهذا البروتوكول ، تمت مزامنة الخلايا مع نظام NDT80-in ، وتم استخدام تقنية المرساة بعيدا لاستنفاد البروتين المستهدف Ctf19 من النواة قبل وبعد الإطلاق من الطور الأولي الأول ، وبعد فصل كروموسوم الانقسام الاختزالي الأول (الشكل 1). يمكن تكييف هذا البروتوكول لاستنفاد البروتينات الأخرى ذات الأهمية في أي مرحلة من مراحل الانقسام الميوزي والانقسام.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-estradiol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E8875</td>
			<td>Make 1mM stocks in 95% EtOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 uM Threaded Bottle-top Filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2GPT02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% EtOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-032-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399500</td>
			<td>Dilute 1:10 to use as solvent for ConA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm x 50 mm coverslip No. 1.5</td>
			<td>VWR North American</td>
			<td>48393241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm x 75 mm microscope slides</td>
			<td>VWR North American</td>
			<td>48300-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine hemisulfate salt</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9126</td>
			<td>To supplement SC, SCA, and 1% Kac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavialin A</td>
			<td>Mllipore Sigma</td>
			<td>C2010</td>
			<td>Make as 1mg/mL in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSNAP HQ2 CCD camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>Used in Section 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids</td>
			<td>BD</td>
			<td>291920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2 inverted-objective micrscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Used in Section 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Download from https://fiji.sc/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Personal DeltaVision Microscope</td>
			<td>Applied Precision</td>
			<td></td>
			<td>Used in Section 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophan&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T0254</td>
			<td>To supplement SC, SCA, and 1% Kac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling Clay</td>
			<td>Crayola</td>
			<td>&#160;2302880000</td>
			<td>To secure coverslip in slide holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 5.30.04 Imaging Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Used in Section 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Fustion BT Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C15440-20UP</td>
			<td>Used in Section 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette tip holder</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>LTS1000-HR</td>
			<td>Cut a 4 square x 4 square section of the rack portion of this product.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottassium Acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapamycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP29631</td>
			<td>Make 1mg/mL stocks in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Sealant</td>
			<td>Aqueon</td>
			<td>100165001</td>
			<td>Also known as aquarium glue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SoftWorx7.0.0&#160; Imaging Software</td>
			<td>Applied Precision</td>
			<td></td>
			<td>Used in Section 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic Complete Mixture (Kaiser)&#160;</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DSCK2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type N immersion oil&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MXA22166</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of time-lapse microscopy and stage-specific nuclear depletion of proteins to study meiosis in s. cerevisiae

أحدث الفحص المجهري الفلوري ذو الفاصل الزمني ثورة في فهم أحداث دورة الخلية الاختزالية من خلال توفير بيانات زمنية ومكانية لا يمكن رؤيتها غالبا عن طريق تصوير الخلايا الثابتة. أثبتت الخميرة الناشئة أنها كائن نموذجي مهم لدراسة فصل الكروموسومات الميوزية لأن العديد من الجينات الاختزالية محفوظة بدرجة كبيرة. يسمح الفحص المجهري بفاصل زمني للانقسام الميوزي في الخميرة الناشئة بمراقبة الطفرات الاختزالية المختلفة لإظهار كيف تعطل الطفرة العمليات الاختزالية. ومع ذلك، تعمل العديد من البروتينات في نقاط متعددة في الانقسام الميوزي. وبالتالي ، فإن استخدام فقدان الوظيفة أو الطفرات الفارغة الاختزالية يمكن أن يعطل عملية مبكرة ، مما يعرقل أو يزعج العملية اللاحقة ويجعل من الصعب تحديد الأنماط الظاهرية المرتبطة بكل دور فردي. للتحايل على هذا التحدي ، يصف هذا البروتوكول كيف يمكن استنفاد البروتينات بشكل مشروط من النواة في مراحل محددة من الانقسام الاختزالي أثناء مراقبة الأحداث الاختزالية باستخدام الفحص المجهري بفاصل زمني. على وجه التحديد ، يصف هذا البروتوكول كيفية مزامنة الخلايا في الطور التمهيدي الأول ، وكيف يتم استخدام تقنية المرساة بعيدا لاستنفاد البروتينات من النواة في مراحل اختزالية محددة ، وكيف يتم استخدام التصوير بفاصل زمني لمراقبة فصل الكروموسوم الميوتي. كمثال على فائدة هذه التقنية ، تم استنفاد بروتين كينيتوكور Ctf19 من النواة في نقاط زمنية مختلفة أثناء الانقسام الاختزالي ، وتم تحليل عدد كتل الكروماتين في نهاية الانقسام الاختزالي الثاني. بشكل عام ، يمكن تكييف هذا البروتوكول لاستنفاد البروتينات النووية المختلفة من النواة أثناء مراقبة الانقسامات الاختزالية.

لمراقبة فصل الكروماتين ، تم وضع علامة على بروتين هيستون Htb2 باستخدام mCherry. في الطور التمهيدي الأول، يظهر الكروماتين في صورة كتلة Htb2 واحدة. بعد انفصال الكروموسومات المتماثلة في الانقسام الميوتي الأول، يظهر الكروماتين في صورة كتلتين متميزتين (الشكل 3 أ). بعد فصل الكروماتيدات ?...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae at JoVE.com

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

يعد الفحص المجهري بفاصل زمني أداة قيمة لدراسة الانقسام الاختزالي في الخميرة الناشئة. يصف هذا البروتوكول طريقة تجمع بين تزامن دورة الخلية ، والفحص المجهري بفاصل زمني ، والاستنفاد الشرطي للبروتين المستهدف لتوضيح كيفية دراسة وظيفة بروتين معين أثناء فصل الكروموسوم الاختزالي.

استخدام الفحص المجهري بفاصل زمني والاستنفاد النووي للبروتينات في مرحلة محددة لدراسة الانقسام الاختزالي في S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...

من خلال مزامنة الخلايا في الطور التمهيدي الأول ثم استنفاد البروتين المستهدف في مرحلة معينة، يمكن لهذه الطريقة تحديد وظائف مميزة مؤقتا لبروتينات معينة. يمنع استنفاد البروتينات المشروطة في مراحل محددة من العضل التأثيرات المتبقية التي يمكن أن يحدثها الطافر العضلي التقليدي في المراحل اللاحقة. يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة الانقسام الميتوزي الخميري الناشئ والكائنات الحية الأخرى التي لا تتعرض لانهيار الغلاف النووي.بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذه الطريقة في الكائنات الحية الأخرى لدراسة أحداث دورة الخلية قبل انهيار الغلاف النووي. للبدء ، اصنع وسادة أجار سيتم استخدامها لإنشاء طبقة أحادية من الخلايا للتصوير. قم بقطع وتجاهل الغطاء والثلث السفلي من أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 ملليلتر لإنشاء أسطوانة تعمل كقالب لوسادة أجار.ضع أسطوانة أنبوب الطرد المركزي الدقيقة المقطوعة على شريحة زجاجية نظيفة مع الجزء العلوي من الأنبوب رأسا على عقب ، جالسا على الشريحة. اصنع ستة ملليلتر من محلول أجار 5٪ في دورق سعة 50 ملليلتر. اقطع طرف الماصة لعمل فتحة أكبر وماصة حوالي 500 ميكرولتر من الآجار المذاب في أنبوب الطرد المركزي الدقيق.اتركه في درجة حرارة الغرفة حتى يصلب الآجار. لتحضير خلايا الخميرة ، قم بتدوير 200 ميكرولتر من ثقافة الأبواغ عند 800 جم لمدة دقيقتين في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة ملليلتر. تجاهل 180 ميكرولتر من المادة الطافية.أعد تعليق الحبيبات في المادة الطافية المتبقية عن طريق تحريك الأنبوب ونفضه. ماصة ستة ميكرولتر من الخلايا المركزة على الغطاء تنزلق في منتصف الغرفة على الفور مع ConA. امسك الأسطوانة بوسادة أجار وحركها بعناية عن الشريحة الزجاجية.تأكد من أن الآجار مسطح تماما في الأسفل وباستخدام الجزء السفلي من طرف الماصة ، ضع قدرا طفيفا من الضغط على قالب الطرد المركزي الدقيق بحيث يتم دفع وسادة الأجار للخارج قليلا فوق حدود الأنبوب. بعد ذلك ، اقلب القالب بحيث تكون وسادة أجار متجهة لأسفل نحو الغرفة. استخدم الملقط لوضع وسادة الآجار برفق فوق الخلايا وطرف الماصة لتحريك وسادة الأجار برفق حول الحجرة من 10 إلى 20 مرة لإنشاء طبقة أحادية من الخلايا على زلة الغطاء.احتفظ بوسادة أجار في الحجرة لمدة 12 إلى 15 دقيقة. بعد ذلك ، انقل مليلتر من ثقافة الأبواغ إلى أنبوبين للطرد المركزي الدقيق وتدور عند 15،700 جم لمدة دقيقتين. بعد نقل المادة الطافية إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة نظيفة ، قم بالدوران مرة أخرى في نفس الحالة واجمع المادة الطافية لتنظيف أنابيب الطرد المركزي الدقيقة.أضف ملليلتر من المادة الطافية بالتنقيط إلى الغرفة التي تحتوي على وسادة أجار. بمجرد وصول السائل إلى الجزء العلوي من الغرفة ، من المرجح أن تطفو وسادة أجار. قم بإزالة وسادة أجار برفق بالملقط وتخلص منها.ضع زلة غطاء مقاس 24 × 50 ملم على الجزء العلوي من الحجرة لمنع التبخر أثناء التصوير. لإعداد الفيلم على المجهر، قم بتركيب زلة الغطاء داخل حامل الشريحة. قم بلصق طين التشكيل على جانب زلة الغطاء لإبقائه آمنا في حامل الانزلاق.افتح برنامج الحصول على الصور. استخدم مقابض ضبط خشنة ودقيقة لتركيز الخلايا باستخدام DIC أو المجال الساطع. في القائمة الرئيسية لبرنامج الحصول على الصور ، انقر فوق ملف ، وحدد اكتساب ، وستظهر أربع نوافذ.في النافذة المسماة Resolve 3D ، انقر فوق رمز قارورة Erlenmeyer. سيؤدي هذا إلى فتح نافذة بعنوان Design Run Experiment ، والتي تحتوي على عناصر التحكم لإعداد تجربة لإعداد فيلم بفاصل زمني. ضمن علامة التبويب تصميم ، انتقل إلى علامة التبويب المسماة تقسيم.حدد المربع بجوار التقسيم Z واضبط تباعد المقطع البصري على ميكرومتر واحد وعدد الأقسام البصرية على خمسة. بعد ذلك ، ضمن علامة التبويب القنوات ، انقر فوق رمز علامة الجمع وحدد القناة المناسبة. ثم حدد المربع بجوار الصورة المرجعية واضبط الموضع Z على منتصف العينة من القائمة المنسدلة.حدد قيمة النفاذية ووقت التعرض من القائمة المنسدلة. ضمن علامة التبويب الفاصل الزمني ، حدد المربع بجوار الفاصل الزمني وأدخل قيما للدقائق والساعات لتحديد الفاصل الزمني للحصول على الصورة. حدد المربع بجوار الحفاظ على التركيز مع التركيز البؤري النهائي لمنع انحراف المسرح أثناء الفيلم.وتحت علامة التبويب النقاط ، حدد المربع بجوار قائمة نقاط الزيارة. في القائمة الرئيسية ، انقر فوق عرض وحدد قائمة النقاط. انقل المسرح إلى منطقة من الحجرة تظهر طبقة أحادية من الخلايا.انقر فوق علامة النقطة في نافذة قائمة النقاط. حرك المسرح لتحديد 25 إلى 30 نقطة دون أي تداخل لتجنب الإفراط في تعريض الخلايا وتصوير كل حقل خلال كل دورة زمنية. في نافذة قائمة النقاط، حدد معايرة الكل لتعيين التركيز البؤري النهائي لكل نقطة.ضمن علامة التبويب "تشغيل" ، احفظ الملف إلى الوجهة المناسبة على الكمبيوتر. في نافذة تشغيل التجربة، حدد الزر تشغيل لبدء تشغيل الفيلم. افتح برنامج فيجي.افتح قنوات DIC و mChery. احصل على إسقاط واحد بحد أقصى للكثافة لقناة mCherry بالنقر فوق صورة ، متبوعا ب Stacks و Z Project وحدد Max Intensity من القائمة المنسدلة. لدمج قنوات DIC و mCherry في صورة واحدة ، انقر فوق الصورة واللون وحدد دمج القنوات.اتبع خلية واحدة من خلال الانقسام الاختزالي. بعد اكتمال الانقسام الميوزي الثاني، سجل عدد كتل الحمض النووي (DNA). في خلايا النوع البري ذات الخلفية المرساة البعيدة، توجد عادة أربع كتل من الحمض النووي (DNA) في نهاية الانقسام الميوزي الثاني، تمثل النواتج الأربعة للانقسام الميوزي.في جزء صغير من الخلايا ، تظهر ثلاث كتل فقط بعد الانقسام الاختزالي الثاني.عندما يتم تثبيت Ctf19-FRB بعيدا في وقت إطلاق الطور الأولي ، فإن ما يقرب من 47٪ من الخلايا تعرض أكثر من أربع كتل من الحمض النووي عند الانتهاء من الانقسام الاختزالي ، مما يشير إلى وجود خلل في ارتباط الحركية والأنابيب الدقيقة. مع تثبيت Ctf19-FRB ، إما بعد تجميع كينيتوكور ولكن قبل الانقسام الاختزالي الأول ، أو بعد الانقسام الاختزالي الثاني ، ما يقرب من 16 ٪ من الخلايا تظهر كتل الحمض النووي إضافية. أحد أهم أجزاء هذا البروتوكول هو إضافة الطافت قطرة قطرة إلى غرفتك لتجنب تعطيل الطبقة الأحادية.بالإضافة إلى ذلك ، لاحظ الوقت اللازم للتحضير للتصوير للنظر فيه في تحليلك. عن طريق تغيير البروتينات المعبأة بالفلورسنت ، يمكن استخدام هذا الإجراء للإجابة على الأسئلة المتعلقة بمدة دورة الخلية ، وفصل الكروموسومات ، ووفرة البروتين ، وتوطين البروتين.

use-time-lapse-microscopy-stage-specific-nuclear-depletion-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, biofilms can reduce industrial productivity, destroy structures, and threaten human life. 1-3 On the other hand, harnessing the power of biofilms can help clean the environment and generate sustainable energy. 4-8
The ability of S. cerevisiae to colonize surfaces and participate in complex biofilms was mostly ignored until the rediscovery of the differentiation programs triggered by various signaling pathways and environmental cues in this organism. 9, 10 The continuing interest in using S. cerevisiae as a model organism to understand the interaction and convergence of signaling pathways, such as the Ras-PKA, Kss1 MAPK, and Hog1 osmolarity pathways, quickly placed S. cerevisiae in the junction of biofilm biology and signal transduction research. 11-20 To this end, differentiation of yeast cells into long, adhesive, pseudohyphal filaments became a convenient readout for the activation of signal transduction pathways upon various environmental changes. However, filamentation is a complex collection of phenotypes, which makes assaying for it as if it were a simple phenotype misleading. In the past decade, several assays were successfully adopted from bacterial biofilm studies to yeast research, such as MAT formation assays to measure colony spread on soft agar and crystal violet staining to quantitatively measure cell-surface adherence. 12, 21 However, there has been some confusion in assays developed to qualitatively assess the adhesive and invasive phenotypes of yeast in agar.
Here, we present a simple and reliable method for assessing the adhesive and invasive quality of yeast strains with easy-to-understand steps to isolate the adhesion assessment from invasion assessment. Our method, adopted from previous studies, 10, 16 involves growing cells in liquid media and plating on differential nutrient conditions for growth of large spots, which we then wash with water to assess adhesion and rub cells completely off the agar surface to assess invasion into the agar. We eliminate the need for streaking cells onto agar, which affects the invasion of cells into the agar. In general, we observed that haploid strains that invade agar are always adhesive, yet not all adhesive strains can invade agar medium. Our approach can be used in conjunction with other assays to carefully dissect the differentiation steps and requirements of yeast signal transduction, differentiation, quorum sensing, and biofilm formation.

We describe a qualitative assay for yeast adhesion and agar invasion as a measure of invasive and pseudohyphal differentiation. This simple assay can be used to assess the invasive phenotype of various mutants as well as the effects environmental cues and signaling pathways on yeast differentiation.

مقايسة للالتصاق وغزو آجار في البيرة س.

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

رصد أكتين التفكيك مع مرور الزمن الميكروسكوب

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

ثنائي الفوتون axotomy والوقت الفاصل بين التصوير مبائر يعيش في الأجنة الزرد

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

أسلوب الإنتاجية العالية عالميا لدراسة مورفولوجية عضية في البيرة س.

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

تحديد بروتين المجمعات مع كمية البروتينات في البيرة س.

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

الوقت الفاصل بين التصوير من الانقسام الميتوزي بعد ترنسفكأيشن سيرنا

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

الوقت الفاصل بين مرحلة التطور الجنيني المبكر من الميكروسكوب في انواع معينة ايليجانس

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

التحليل الكمي للهجرة عشوائية من الخلايا باستخدام الوقت الفاصل بين الميكروسكوب فيديو

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes result from the fusion of haploid cells of distinct mating type (MATa, MATalpha) and give rise to corresponding stable diploids that successively generate as many as 20 diploid progeny as a result of their strikingly asymmetric mitotic divisions 2. Zygote formation is orchestrated by a complex sequence of events: In this process, soluble mating factors bind to cognate receptors, triggering receptor-mediated signaling cascades that facilitate interruption of the cell cycle and culminate in cell-cell fusion. Zygotes may be considered a model for progenitor or stem cell function.
Although much has been learned about the formation of zygotes and although zygotes have been used to investigate cell-molecular questions of general significance, almost all studies have made use of mating mixtures in which zygotes are intermixed with a majority population of haploid cells 3-8. Many aspects of the biochemistry of zygote formation and the continuing life of the zygote therefore remain uninvestigated.
Reports of purification of yeast zygotes describe protocols based on their sedimentation properties 9; however, this sedimentation-based procedure did not yield nearly 90% purity in our hands. Moreover, it has the disadvantage that cells are exposed to hypertonic sorbitol. We therefore have developed a versatile purification procedure. For this purpose, pairs of haploid cells expressing red or green fluorescent proteins were co-incubated to allow zygote formation, harvested at various times, and the resulting zygotes were purified using a flow cytometry-based sorting protocol. This technique provides a convenient visual assessment of purity and maturation. The average purity of the fraction is approximately 90%. According to the timing of harvest, zygotes of varying degrees of maturity can be recovered. The purified samples provide a convenient point of departure for "-omic" studies, for recovery of initial progeny, and for systematic investigation of this progenitor cell.

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

To purify zygotes of S. cerevisiae, haploid cells of opposite mating type were engineered to express red or green fluorescent proteins, co-incubated to allow zygote formation, and fractionated using a flow cytometry-based protocol. The highly-enriched fraction enables subsequent "-omic" studies, recovery of initial progeny, and systematic investigation of zygote morphogenesis.

تدفق الخلوي على أساس تنقية<em&gt; S. خميرة</em&gt; بيضات ملقحة

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

استخدام الميكروسكوب الفاصل الزمني لتصور نقص الأكسجين الناجم عن تعطل الحركة في<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; الأجنة

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...