Name: use of time-lapse microscopy and stage-specific nuclear depletion of proteins to study meiosis in s. cerevisiae
Uploaded: 2022-10-11T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae at JoVE.com

אנו מודים למרכז ההדמיה למיקרוסקופיית אור באוניברסיטת אינדיאנה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכונים הלאומיים לבריאות (GM105755).

1. הכנת החומרים הדרושים
<ol><li>הכן ריאגנטים לצמיחה ו sporulation של תאי שמרים. הערה: אם זני שמרים ניצנים הם ade2 - ו- trp1-, יש להשלים את כל המדיה בשלבים 1.1.1-1.1.3 עם ריכוז סופי של 0.01% אדנין ו-0.01% טריפטופן ממניות 1%. אם אתם מעקרים את המדיה על ידי אוטוקלב, הוסיפו את חומצות האמינו הללו רק לאחר ?...

<ol>
	<li>Tsuchiya, D., Gonzalez, C., Lacefield, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+checkpoint+protein+Mad2+regulates+APC/C+activity+during+prometaphase+and+metaphase+of+meiosis+I+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The spindle checkpoint protein Mad2 regulates APC/C activity during prometaphase and metaphase of meiosis I in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (16), 2848-2861 (2011).</li><li>Cairo, G., MacKenzie, A. M., Lacefield, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+requirement+for+Bub1+and+Bub3+in+regulation+of+meiotic+versus+mitotic+chromosome+segregation.">Differential requirement for Bub1 and Bub3 in regulation of meiotic versus mitotic chromosome segregation.</a> Journal of Cell Biology. 219 (4), 201909136 (2020).</li><li>van Werven, F. J., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+entry+into+gametogenesis.">Regulation of entry into gametogenesis.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 366 (1584), 3521-3531 (2011).</li><li>Carlile, T. M., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+I+is+established+through+division-specific+translational+control+of+a+cyclin.">Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin.</a> Cell. 133 (2), 280-291 (2008).</li><li>Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+landmark+events+in+meiosis+by+the+CDK+Cdc28+and+the+meiosis-specific+kinase+Ime2.">Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2.</a> Genes and Development. 17 (12), 1524-1539 (2003).</li><li>Xu, L., Ajimura, M., Padmore, R., Klein, C., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NDT80,+a+meiosis-specific+gene+required+for+exit+from+pachytene+in+Saccharomyces+cerevisiae.">NDT80, a meiosis-specific gene required for exit from pachytene in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6572-6581 (1995).</li><li>Chu, S., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gametogenesis+in+yeast+is+regulated+by+a+transcriptional+cascade+dependent+on+Ndt80.">Gametogenesis in yeast is regulated by a transcriptional cascade dependent on Ndt80.</a> Molecular Cell. 1 (5), 685-696 (1998).</li><li>Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anchor-away+technique:+rapid,+conditional+establishment+of+yeast+mutant+phenotypes.">The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes.</a> Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).</li><li>Borek, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteomic+landscape+of+centromeric+chromatin+reveals+an+essential+role+for+the+Ctf19(CCAN)+complex+in+meiotic+kinetochore+assembly.">The proteomic landscape of centromeric chromatin reveals an essential role for the Ctf19(CCAN) complex in meiotic kinetochore assembly.</a> Current Biology. 31 (2), 283-296 (2021).</li><li>Mehta, G. D., Agarwal, M., Ghosh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+kinetochore+protein,+Ctf19+in+meiosis+I:+an+implication+of+differential+impact+of+Ctf19+on+the+assembly+of+mitotic+and+meiotic+kinetochores+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Functional characterization of kinetochore protein, Ctf19 in meiosis I: an implication of differential impact of Ctf19 on the assembly of mitotic and meiotic kinetochores in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Microbiology. 91 (6), 1179-1199 (2014).</li><li>Ortiz, J., Stemmann, O., Rank, S., Lechner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+protein+complex+consisting+of+Ctf19,+Mcm21,+and+Okp1+represents+a+missing+link+in+the+budding+yeast+kinetochore.">A putative protein complex consisting of Ctf19, Mcm21, and Okp1 represents a missing link in the budding yeast kinetochore.</a> Genes and Development. 13 (9), 1140-1155 (1999).</li><li>Hyland, K. M., Kingsbury, J., Koshland, D., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ctf19p:+A+novel+kinetochore+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae+and+a+potential+link+between+the+kinetochore+and+mitotic+spindle.">Ctf19p: A novel kinetochore protein in Saccharomyces cerevisiae and a potential link between the kinetochore and mitotic spindle.</a> Journal of Cell Biology. 145 (1), 15-28 (1999).</li><li>Fernius, J., Marston, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+cohesion+at+the+pericentromere+by+the+Ctf19+kinetochore+subcomplex+and+the+replication+fork-associated+factor,+Csm3.">Establishment of cohesion at the pericentromere by the Ctf19 kinetochore subcomplex and the replication fork-associated factor, Csm3.</a> PLoS Genetics. 5 (9), 1000629 (2009).</li><li>Meyer, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ipl1/Aurora-B+is+necessary+for+kinetochore+restructuring+in+meiosis+I+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Ipl1/Aurora-B is necessary for kinetochore restructuring in meiosis I in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (17), 2986-3000 (2015).</li><li>Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+sporulation+conditions+for+different+Saccharomyces+cerevisiae+strain+backgrounds.">Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds.</a> Methods in Molecular Biology. 557, 21-26 (2009).</li><li>Deutschbauer, A. M., Davis, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+trait+loci+mapped+to+single-nucleotide+resolution+in+yeast.">Quantitative trait loci mapped to single-nucleotide resolution in yeast.</a> Nature Genetics. 37 (12), 1333-1340 (2005).</li><li>Ben-Ari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+linked+genes+participate+in+controlling+sporulation+efficiency+in+budding+yeast.">Four linked genes participate in controlling sporulation efficiency in budding yeast.</a> PLoS Genetics. 2 (11), 195 (2006).</li><li>Primig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+core+meiotic+transcriptome+in+budding+yeasts.">The core meiotic transcriptome in budding yeasts.</a> Nature Genetics. 26 (4), 415-423 (2000).</li><li>Spencer, F., Gerring, S. L., Connelly, C., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+chromosome+transmission+fidelity+mutants+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Mitotic chromosome transmission fidelity mutants in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 124 (2), 237-249 (1990).</li><li>Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+source+dependent+promoters+in+yeasts.">Carbon source dependent promoters in yeasts.</a> Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).</li><li>Byers, B., Goetsch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+pachytene+arrest+of+Saccharomyces+cerevisiae+at+elevated+temperature.">Reversible pachytene arrest of Saccharomyces cerevisiae at elevated temperature.</a> Molecular and General Genetics. 187 (1), 47-53 (1982).</li><li>Winter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sum1/Ndt80+transcriptional+switch+and+commitment+to+meiosis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (1), 1-15 (2012).</li><li>Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporulation+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).</li><li>Robinett, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+al.+In+vivo+localization+of+DNA+sequences+and+visualization+of+large-scale+chromatin+organization+using+lac+operator/repressor+recognition.">C. al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition.</a> Journal of Cell Biology. 135, 1685-1700 (1996).</li><li>Straight, A. F., Belmont, A. S., Robinett, C. C., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP+tagging+of+budding+yeast+chromosomes+reveals+that+protein-protein+interactions+can+mediate+sister+chromatid+cohesion.">GFP tagging of budding yeast chromosomes reveals that protein-protein interactions can mediate sister chromatid cohesion.</a> Current Biology. 6 (12), 1599-1608 (1996).</li><li>Sym, M., Engebrecht, J. A., Roeder, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZIP1+is+a+synaptonemal+complex+protein+required+for+meiotic+chromosome+synapsis.">ZIP1 is a synaptonemal complex protein required for meiotic chromosome synapsis.</a> Cell. 72 (3), 365-378 (1993).</li><li>Scherthan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+mobility+during+meiotic+prophase+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Chromosome mobility during meiotic prophase in Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16934-16939 (2007).</li></ol>

פרוטוקול זה משלב את מערכת NDT80-in לסנכרון תאים, את טכניקת ה-anchor away לרוקן חלבונים מהגרעין, ואת המיקרוסקופיה הפלואורסצנטית בהילוך מהיר כדי לדמות תאי שמרים ניצנים במהלך מיוזה. מערכת NDT80-in היא שיטה לסנכרון מחזור תאים מיוטי המשתמשת בפרופאזה I לעצור ולשחרר 4,8.</...

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בהילוך מהיר היא כלי רב ערך לחקר הדינמיקה של הפרדת כרומוזומים מיוטיים בשמרים ניצנים 1,2. ניתן לגרום לתאי שמרים ניצנים לעבור מיוזה באמצעות הרעבה של חומרים מזינים חיוניים3. במהלך מיוזה, תאים עוברים סבב אחד של הפרדת כרומוזומים ולאחר מכן שתי חטיבות כדי ליצור ארבעה תוצרים מיוטיים הארוזים בנבגים (איור 1). ניתן לדמיין תאים בודדים לאורך כל שלב של מיוזה, אשר מייצר נתונים מרחביים וזמניים שניתן לפספס בקלות על ידי הדמיה של תאים קבועים. פרוטוקול זה מראה כיצד ניתן להשתמש בשילוב של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בהילוך מהיר עם שתי שיטות שנקבעו בעבר, מערכת NDT80 (NDT80-in) וטכניקת ה-anchor away, כדי לחקור את תפקודם של חלבונים ספציפיים בשלבים מיוטיים שונים.
מערכת NDT80-in היא כלי רב עוצמה לסנכרון מחזור תא מיוטי המסתמך על הביטוי הבלתי ניתן להשראה של גורם שעתוק המיוזה האמצעי NDT80 4,5. ביטוי NDT80 נדרש עבור prophase I יציאה 6,7. עם מערכת NDT80-in, NDT80 נמצא תחת שליטתו של מקדם GAL1-10 בתאים המבטאים את גורם השעתוק Gal4 שהתמזג עם קולטן אסטרוגן (Gal4-ER)4,5. מאחר ש-Gal4-ER נכנס לגרעין רק כאשר הוא קשור ל-β-אסטרדיול, תאי NDT80-in נעצרים בפרופאזה I בהיעדר β-אסטרדיול, מה שמאפשר סנכרון של תאים בפרופאזה I (איור 1). תוספת β-אסטרדיול מקדמת את הטרנסלוקציה של גורם השעתוק Gal4-ER לתוך הגרעין, שם הוא קושר את GAL1-10 כדי להניע ביטוי של NDT80, מה שמוביל לכניסה סינכרונית לחטיבות המיוטיות. למרות שניתן לבצע מיקרוסקופיה בהילוך מהיר ללא סנכרון, היתרון בשימוש בסנכרון הוא היכולת להוסיף מעכב או תרופה בזמן שהתאים נמצאים בשלב מסוים של מיוזה.
טכניקת ה-anchor away היא מערכת אינדוקטיבית, שבאמצעותה ניתן לרוקן חלבון מהגרעין בתוספת של רפמיצין8. טכניקה זו אידיאלית לחקר חלבונים גרעיניים במהלך חלוקת התא בשמרים ניצנים מכיוון שתאי שמרים עוברים מיטוזה סגורה ומיוזה, שבה מעטפת הגרעין אינה מתפרקת. יתר על כן, טכניקה זו שימושית מאוד עבור חלבונים שיש להם פונקציות מרובות לאורך מיוזה. שלא כמו במחיקות, אללים מוטנטיים או אללים ריקים מיוטיים, הסרת חלבון מטרה מהגרעין בשלב מסוים אינה פוגעת בפעילות חלבון המטרה בשלבים מוקדמים יותר, ומאפשרת פרשנות מדויקת יותר של התוצאות. מערכת ה-anchor away משתמשת בסגירה של תת-יחידות ריבוזומליות בין הגרעין לציטופלסמה המתרחשת עם ההבשלה הריבוזומלית8. כדי לרוקן את חלבון המטרה מהגרעין, חלבון המטרה מתויג עם תחום הקישור FKBP12-rapamycin (FRB) בזן שבו תת-היחידה הריבוזומלית Rpl13A מתויגת עם FKBP12. ללא רפמיצין, FRB ו- FKBP12 אינם מתקשרים, והחלבון המתויג FRB נשאר בגרעין. עם הוספת רפמיצין, הרפאמיצין יוצר קומפלקס יציב עם FKBP12 ו-FRB, והקומפלקס מועבר אל מחוץ לגרעין עקב האינטראקציה עם Rpl13A (איור 1). כדי למנוע מוות של תאים עם תוספת רפמיצין, התאים מכילים את המוטציה tor1-1 של הגן TOR1 . בנוסף, תאים אלה מכילים fpr1Δ , אלל ריק של החלבון S. cerevisiae FKBP12, אשר מונע Fpr1 אנדוגני מ Rpl13A-FKBP12 מתחרה עבור FRB ו rapamycin קשירת. העוגן הרחק מוטציות רקע, tor1-1 ו- fpr1Δ, אינן משפיעות על תזמונים מיוטיים או על הפרדת כרומוזומים2.
כדי להדגים את התועלת של טכניקה זו, חלבון הקינטוצ'ור Ctf19 התרוקן בנקודות זמן שונות במהלך המיוזיס. Ctf19 הוא מרכיב של קינטוצ'ור הניתן לחלוקה במיטוזה אך נדרש להפרדה תקינה של כרומוזומים במיוזה 9,10,11,12,13. במיוזיס, הקינטוצ'ור נשפך בפרופאזה I, ו- Ctf19 חשוב להרכבה מחדש של קינטוצ'ור 9,14. עבור פרוטוקול זה, תאים עם מערכת NDT80-in היו מסונכרנים, וטכניקת ה-anchor away שימשה כדי לרוקן את חלבון המטרה Ctf19 מהגרעין לפני ואחרי השחרור מ-prophase I, ואחרי הפרדת כרומוזומים של meiosis I (איור 1). פרוטוקול זה יכול להיות מותאם כדי לרוקן חלבונים אחרים בעלי עניין בכל שלב של מיוזה ומיטוזה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-estradiol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E8875</td>
			<td>Make 1mM stocks in 95% EtOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 uM Threaded Bottle-top Filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2GPT02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% EtOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-032-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399500</td>
			<td>Dilute 1:10 to use as solvent for ConA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm x 50 mm coverslip No. 1.5</td>
			<td>VWR North American</td>
			<td>48393241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm x 75 mm microscope slides</td>
			<td>VWR North American</td>
			<td>48300-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine hemisulfate salt</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9126</td>
			<td>To supplement SC, SCA, and 1% Kac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavialin A</td>
			<td>Mllipore Sigma</td>
			<td>C2010</td>
			<td>Make as 1mg/mL in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSNAP HQ2 CCD camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>Used in Section 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids</td>
			<td>BD</td>
			<td>291920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2 inverted-objective micrscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Used in Section 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Download from https://fiji.sc/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Personal DeltaVision Microscope</td>
			<td>Applied Precision</td>
			<td></td>
			<td>Used in Section 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophan&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T0254</td>
			<td>To supplement SC, SCA, and 1% Kac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling Clay</td>
			<td>Crayola</td>
			<td>&#160;2302880000</td>
			<td>To secure coverslip in slide holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 5.30.04 Imaging Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Used in Section 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Fustion BT Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C15440-20UP</td>
			<td>Used in Section 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette tip holder</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>LTS1000-HR</td>
			<td>Cut a 4 square x 4 square section of the rack portion of this product.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottassium Acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapamycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP29631</td>
			<td>Make 1mg/mL stocks in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Sealant</td>
			<td>Aqueon</td>
			<td>100165001</td>
			<td>Also known as aquarium glue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SoftWorx7.0.0&#160; Imaging Software</td>
			<td>Applied Precision</td>
			<td></td>
			<td>Used in Section 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic Complete Mixture (Kaiser)&#160;</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DSCK2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type N immersion oil&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MXA22166</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of time-lapse microscopy and stage-specific nuclear depletion of proteins to study meiosis in s. cerevisiae

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בהילוך מהיר חוללה מהפכה בהבנת אירועי מחזור תאים מיוטיים על ידי מתן נתונים טמפורליים ומרחביים שלעתים קרובות אינם נראים על ידי הדמיה של תאים קבועים. שמרים ניצנים הוכיחו את עצמם כאורגניזם מודל חשוב לחקר הפרדת כרומוזומים מיוטיים מאחר שגנים מיוטיים רבים נשמרים מאוד. מיקרוסקופיה בהילוך מהיר של מיוזה בשמרים ניצנים מאפשרת ניטור של מוטציות מיוטיות שונות כדי להראות כיצד המוטציה משבשת תהליכים מיוטיים. עם זאת, חלבונים רבים מתפקדים בנקודות מרובות במיוזיס. השימוש במוטנטים ריקים של אובדן תפקוד או מיוטי יכול אפוא לשבש תהליך מוקדם, לחסום או להפריע לתהליך המאוחר יותר ולהקשות על קביעת הפנוטיפים הקשורים לכל תפקיד בנפרד. כדי לעקוף את האתגר הזה, פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן לרוקן את החלבונים מהגרעין בשלבים ספציפיים של מיוזה תוך ניטור אירועים מיוטיים באמצעות מיקרוסקופיה בהילוך מהיר. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מתאר כיצד התאים מסונכרנים ב-prophase I, כיצד טכניקת ה-anchor away משמשת לדלדול חלבונים מהגרעין בשלבים מיוטיים ספציפיים, וכיצד נעשה שימוש בהדמיה בהילוך מהיר כדי לעקוב אחר הפרדת כרומוזומים מיוטיים. כדוגמה לתועלת הטכניקה, חלבון הקינטוצ'ור Ctf19 התרוקן מהגרעין בנקודות זמן שונות במהלך המיוזיס, ומספר מסות הכרומטין נותח בסוף המיוזה השנייה. באופן כללי, ניתן להתאים פרוטוקול זה כדי לרוקן חלבונים גרעיניים שונים מהגרעין תוך ניטור החטיבות המיוטיות.

כדי לעקוב אחר הפרדת הכרומטין, חלבון היסטון Htb2 תויג עם mCherry. בפרופאזה I, הכרומטין מופיע כמסת Htb2 יחידה. לאחר שהכרומוזומים ההומולוגיים מופרדים בחלוקה המיוטית הראשונה, הכרומטין מופיע כשתי מסות נפרדות (איור 3A). לאחר שהכרומטידים האחים נפרדים, הכרומטין מופיע כארבע מסות. אם כרומוזו?...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae at JoVE.com

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

מיקרוסקופיה בהילוך מהיר היא כלי רב ערך לחקר מיוזה בשמרים ניצנים. פרוטוקול זה מתאר שיטה המשלבת סנכרון מחזור התא, מיקרוסקופיה בהילוך מהיר ודלדול מותנה של חלבון מטרה כדי להדגים כיצד לחקור את תפקודו של חלבון מסוים במהלך הפרדת כרומוזומים מיוטיים.

שימוש במיקרוסקופיה של קיטועי זמן ודלדול גרעיני ספציפי לשלב של חלבונים כדי לחקור מיוזה ב- S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...

על ידי סנכרון תאים בפרופאזה 1 ולאחר מכן דלדול חלבון המטרה בשלב מסוים, שיטה זו יכולה לזהות פונקציות נפרדות באופן זמני של חלבונים ספציפיים. דלדול חלבונים בשלבים מסוימים של מיוזה מונע את ההשפעות השיוריות שיכולות להיות למוטציה מיוטית מסורתית בשלבים מאוחרים יותר. שיטה זו יכולה לשמש לחקר מיטוזה של שמרים ניצנים ואורגניזמים אחרים שאינם עוברים פירוק מעטפת גרעינית.בנוסף, ניתן להשתמש בשיטה זו באורגניזמים אחרים כדי לחקור אירועי מחזור תאים לפני פירוק מעטפת הגרעין. כדי להתחיל, לעשות כרית אגר שישמש ליצירת monolayer של תאים להדמיה. חותכים ומשליכים את המכסה והתחתון שליש מצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר כדי ליצור צילינדר שישמש כתבנית לכרית האגר.הניחו את גליל צינור המיקרוצנטריפוגה החתוך על מגלשת זכוכית נקייה כשהחלק העליון של הצינור הפוך, כשהוא יושב על המגלשה. הכינו שישה מיליליטר מתמיסת 5% אגר בכוס של 50 מיליליטר. חותכים את קצה הפיפטה כדי ליצור פתח גדול יותר ומפטים כ-500 מיקרוליטרים של אגר מומס לתוך צינור המיקרוצנטריפוגה.תנו לו לשבת בטמפרטורת החדר עד שהאגר יתמצק. כדי להכין תאי שמרים, סובבו 200 מיקרוליטרים של תרבית הספורולציה ב-800 גרם למשך שתי דקות בצינורות מיקרוצנטריפוגה של מיליליטר אחד. השליכו 180 מיקרוליטרים של הסופר-נטנט.החזירו את הכדור לנוזל הנותר על ידי מערבולת והבהוב הצינור. פיפטה שישה מיקרוליטרים של התאים המרוכזים על הכיסוי מחליקים באמצע התא במקום עם ConA. החזיקו את הצילינדר עם כרית האגר והחליקו אותו בזהירות ממגלשת הזכוכית.וודאו שהאגר שטוח לחלוטין בתחתית ובעזרת החלק התחתון של קצה הפיפטה, הפעילו לחץ קל על תבנית המיקרוצנטריפוגה כך שמשטח האגר נדחף מעט מעל גבול הצינור. לאחר מכן, הפוך את התבנית כך כרית אגר פונה כלפי מטה לכיוון החדר. השתמש במלקחיים כדי להניח בעדינות את כרית האגר על גבי התאים ואת קצה הפיפטה כדי להחליק בעדינות את כרית האגר סביב התא 10 עד 20 פעמים כדי ליצור מונו-שכבה של תאים על החלקת הכיסוי.שמור את כרית האגר בתא למשך 12 עד 15 דקות. לאחר מכן, להעביר שני מיליליטר של תרבית sporulation לשני צינורות microcentrifuge ולהסתובב ב 15, 700 G במשך שתי דקות. לאחר העברת הסופרנטנט לצינורות מיקרוצנטריפוגה נקיים, הסתובבו שוב באותו מצב ואספו את הסופרנטנט לניקוי צינורות מיקרוצנטריפוגה.הוסיפו שני מיליליטר של הסופר-נטנט טיפה לתא המכיל את כרית האגר. לאחר שהנוזל הגיע לחלק העליון של התא, כרית האגר ככל הנראה תצוף. יש להסיר את כרית האגר בעדינות בעזרת מלקחיים ולהשליך אותה.הניחו כיסוי בגודל 24 על 50 מילימטר בחלק העליון של התא כדי למנוע אידוי במהלך ההדמיה. כדי למקם את הסרט במיקרוסקופ, הכנס את תלוש הכיסוי לתוך מחזיק השקופיות. הדביקו את חימר היציקה לצד הכיסוי כדי לשמור עליו מאובטח במחזיק ההחלקה.פתח את התוכנה לרכישת תמונות. השתמש בידיות כוונון גסות ועדינות כדי למקד את התאים באמצעות DIC או שדה בהיר. בתפריט הראשי של תוכנת רכישת התמונות, לחץ על קובץ, בחר רכוש, וארבעה חלונות יופיעו.בחלון בשם Resolve 3D, לחץ על סמל הבקבוקון של Erlenmeyer. פעולה זו תפתח חלון בשם Design Run Experiment, המכיל את הפקדים להגדרת ניסוי להגדרת סרט עם קיטועי זמן. תחת הכרטיסיה עיצוב, נווט אל הכרטיסיה שכותרתה מקטע.בחר את התיבה לצד מקטעי Z והגדר את המרווח בין המקטעים האופטיים למיקרומטר אחד ואת מספר המקטעים האופטיים לחמישה. לאחר מכן, תחת הכרטיסייה ערוצים, לחץ על סמל הפלוס ובחר את הערוץ המתאים. לאחר מכן, בחר את התיבה שליד הפניה לתמונה והגדר את מיקום Z לאמצע הדגימה מהתפריט הנפתח.בחר ערך של שידור וזמן חשיפה מהתפריט הנפתח. תחת הכרטיסיה קיטועי זמן, בחר את התיבה לצד קיטועי זמן והזן ערכים עבור דקות ושעות כדי לזהות את מרווח הזמן של רכישת תמונה. בחר את התיבה לצד שמור על מיקוד עם מיקוד אולטימטיבי כדי למנוע סחף שלב במהלך הסרט.ותחת הכרטיסיה נקודות, בחר את התיבה לצד בקר ברשימת נקודות. בתפריט הראשי, לחץ על תצוגה ובחר רשימת נקודות. הזז את הבמה לאזור של החדר המציג מונולאייר של תאים.לחץ על סמן פוינט בחלון רשימת נקודות. הזז את השלב כדי לבחור 25 עד 30 נקודות ללא כל חפיפה כדי למנוע חשיפת יתר של התאים והתמונה של כל שדה במהלך כל קורס זמן. בחלון רשימת נקודות, בחר כייל הכל כדי להגדיר את המיקוד האולטימטיבי עבור כל נקודה.תחת הכרטיסיה הפעלה, שמור את הקובץ ביעד המתאים במחשב. בחלון הפעל ניסוי, בחר בלחצן הפעל כדי להתחיל את הסרט. פתח את תוכנת פיג'י.פתח את ערוצי DIC ו- mCherry. השג הקרנה אחת בעוצמה מקסימלית של ערוץ mCherry על ידי לחיצה על תמונה, ואחריה Stacks ו- Z Project ובחר עוצמה מקסימלית מהתפריט הנפתח. כדי למזג את ערוצי DIC ו- mCherry בתמונה אחת, לחץ על תמונה, צבע ובחר מיזוג ערוצים.עקוב אחר תא בודד באמצעות מיוזה. לאחר השלמת מיוזה II, רשום את מספר מסות הדנ"א. בתאים מסוג בר עם רקע העוגן, יש בדרך כלל ארבע מסות דנ"א בסוף המיוזה II, המייצגות את ארבעת התוצרים של מיוזה.בחלק קטן מהתאים, רק שלוש מסות נראות לאחר מיוזה II.כאשר Ctf19-FRB מעוגן בזמן שחרור הפרופאזה I, כ-47% מהתאים מציגים יותר מארבע מסות דנ"א עם השלמת המיוזה, מה שמרמז על פגם בחיבור של קינטוכורס ומיקרוטובולים. עם עיגון של Ctf19-FRB, או לאחר הרכבת קינטוצ'ור אך לפני מיוזה I, או לאחר מיוזה II, כ -16% מהתאים מציגים מסות DNA נוספות. אחד החלקים החשובים ביותר בפרוטוקול זה הוא להוסיף את ה-supernatant dropwise לתא שלך כדי למנוע הפרעה למונולייר שלך.בנוסף, שים לב לזמן הדרוש להכנה להדמיה כדי לשקול זאת בניתוח שלך. על ידי שינוי חלבונים ארוזים פלואורסצנטיים, ניתן להשתמש בהליך זה כדי לענות על השאלות הנוגעות למשך מחזור התא, הפרדת כרומוזומים, שפע חלבונים ולוקליזציה של חלבונים.

Research

JoVE Journal

Biology

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Assay עבור הידבקות ואת הפלישה אגר ב cerevisiae ס

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

ניטור אקטין פירוק עם מיקרוסקופיה זמן לשגות

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

שני הפוטונים axotomy ואת זמן לשגות הדמיה confocal עוברי דג הזברה לחיות

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

שיטת תפוקה גבוהה ברחבי העולם כדי ללמוד את המורפולוגיה של אברון cerevisiae ס

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

זיהוי של קומפלקסים חלבונים עם proteomics כמותיים cerevisiae ס

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

זמן לשגות מיקרוסקופית של העובר בשלב מוקדם Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

ניתוח כמותי של הגירה אקראית של תאים באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופית וידאו

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

טיהור הזרימה Cytometry מבוסס<em&gt; ס cerevisiae</em&gt; זיגוטות

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

השתמש של מיקרוסקופיה מעבר זמן לדמיין אנימצית מושעה anoxia מושרה ב<em&gt; ג elegans</em&gt; עוברים

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...