Name: use of time-lapse microscopy and stage-specific nuclear depletion of proteins to study meiosis in s. cerevisiae
Uploaded: 2022-10-11T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae at JoVE.com

Vi takker Light Microscopy Imaging Center ved Indiana University. Dette arbeidet ble støttet av et tilskudd fra National Institutes of Health (GM105755).

1. Forberedelse av nødvendige materialer
<ol><li>Forbered reagenser for vekst og sporulering av gjærceller. MERK: Hvis spirende gjærstammer er ade2 - og trp1-, supplere alle medier i trinn 1.1.1-1.1.3 med en endelig konsentrasjon på 0,01% adenin og 0,01% tryptofan fra 1% aksjer. Hvis sterilisering av media ved autoklav, legg til disse aminosyrene først etter at reagensene er autoklavert og tillatt å avkjøles til romtemperatur.<ol><li>For vegetativ vekst, lag 2x syntetisk kom...

<ol>
	<li>Tsuchiya, D., Gonzalez, C., Lacefield, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+checkpoint+protein+Mad2+regulates+APC/C+activity+during+prometaphase+and+metaphase+of+meiosis+I+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The spindle checkpoint protein Mad2 regulates APC/C activity during prometaphase and metaphase of meiosis I in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (16), 2848-2861 (2011).</li><li>Cairo, G., MacKenzie, A. M., Lacefield, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+requirement+for+Bub1+and+Bub3+in+regulation+of+meiotic+versus+mitotic+chromosome+segregation.">Differential requirement for Bub1 and Bub3 in regulation of meiotic versus mitotic chromosome segregation.</a> Journal of Cell Biology. 219 (4), 201909136 (2020).</li><li>van Werven, F. J., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+entry+into+gametogenesis.">Regulation of entry into gametogenesis.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 366 (1584), 3521-3531 (2011).</li><li>Carlile, T. M., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+I+is+established+through+division-specific+translational+control+of+a+cyclin.">Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin.</a> Cell. 133 (2), 280-291 (2008).</li><li>Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+landmark+events+in+meiosis+by+the+CDK+Cdc28+and+the+meiosis-specific+kinase+Ime2.">Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2.</a> Genes and Development. 17 (12), 1524-1539 (2003).</li><li>Xu, L., Ajimura, M., Padmore, R., Klein, C., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NDT80,+a+meiosis-specific+gene+required+for+exit+from+pachytene+in+Saccharomyces+cerevisiae.">NDT80, a meiosis-specific gene required for exit from pachytene in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6572-6581 (1995).</li><li>Chu, S., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gametogenesis+in+yeast+is+regulated+by+a+transcriptional+cascade+dependent+on+Ndt80.">Gametogenesis in yeast is regulated by a transcriptional cascade dependent on Ndt80.</a> Molecular Cell. 1 (5), 685-696 (1998).</li><li>Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anchor-away+technique:+rapid,+conditional+establishment+of+yeast+mutant+phenotypes.">The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes.</a> Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).</li><li>Borek, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteomic+landscape+of+centromeric+chromatin+reveals+an+essential+role+for+the+Ctf19(CCAN)+complex+in+meiotic+kinetochore+assembly.">The proteomic landscape of centromeric chromatin reveals an essential role for the Ctf19(CCAN) complex in meiotic kinetochore assembly.</a> Current Biology. 31 (2), 283-296 (2021).</li><li>Mehta, G. D., Agarwal, M., Ghosh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+kinetochore+protein,+Ctf19+in+meiosis+I:+an+implication+of+differential+impact+of+Ctf19+on+the+assembly+of+mitotic+and+meiotic+kinetochores+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Functional characterization of kinetochore protein, Ctf19 in meiosis I: an implication of differential impact of Ctf19 on the assembly of mitotic and meiotic kinetochores in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Microbiology. 91 (6), 1179-1199 (2014).</li><li>Ortiz, J., Stemmann, O., Rank, S., Lechner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+protein+complex+consisting+of+Ctf19,+Mcm21,+and+Okp1+represents+a+missing+link+in+the+budding+yeast+kinetochore.">A putative protein complex consisting of Ctf19, Mcm21, and Okp1 represents a missing link in the budding yeast kinetochore.</a> Genes and Development. 13 (9), 1140-1155 (1999).</li><li>Hyland, K. M., Kingsbury, J., Koshland, D., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ctf19p:+A+novel+kinetochore+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae+and+a+potential+link+between+the+kinetochore+and+mitotic+spindle.">Ctf19p: A novel kinetochore protein in Saccharomyces cerevisiae and a potential link between the kinetochore and mitotic spindle.</a> Journal of Cell Biology. 145 (1), 15-28 (1999).</li><li>Fernius, J., Marston, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+cohesion+at+the+pericentromere+by+the+Ctf19+kinetochore+subcomplex+and+the+replication+fork-associated+factor,+Csm3.">Establishment of cohesion at the pericentromere by the Ctf19 kinetochore subcomplex and the replication fork-associated factor, Csm3.</a> PLoS Genetics. 5 (9), 1000629 (2009).</li><li>Meyer, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ipl1/Aurora-B+is+necessary+for+kinetochore+restructuring+in+meiosis+I+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Ipl1/Aurora-B is necessary for kinetochore restructuring in meiosis I in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (17), 2986-3000 (2015).</li><li>Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+sporulation+conditions+for+different+Saccharomyces+cerevisiae+strain+backgrounds.">Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds.</a> Methods in Molecular Biology. 557, 21-26 (2009).</li><li>Deutschbauer, A. M., Davis, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+trait+loci+mapped+to+single-nucleotide+resolution+in+yeast.">Quantitative trait loci mapped to single-nucleotide resolution in yeast.</a> Nature Genetics. 37 (12), 1333-1340 (2005).</li><li>Ben-Ari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+linked+genes+participate+in+controlling+sporulation+efficiency+in+budding+yeast.">Four linked genes participate in controlling sporulation efficiency in budding yeast.</a> PLoS Genetics. 2 (11), 195 (2006).</li><li>Primig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+core+meiotic+transcriptome+in+budding+yeasts.">The core meiotic transcriptome in budding yeasts.</a> Nature Genetics. 26 (4), 415-423 (2000).</li><li>Spencer, F., Gerring, S. L., Connelly, C., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+chromosome+transmission+fidelity+mutants+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Mitotic chromosome transmission fidelity mutants in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 124 (2), 237-249 (1990).</li><li>Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+source+dependent+promoters+in+yeasts.">Carbon source dependent promoters in yeasts.</a> Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).</li><li>Byers, B., Goetsch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+pachytene+arrest+of+Saccharomyces+cerevisiae+at+elevated+temperature.">Reversible pachytene arrest of Saccharomyces cerevisiae at elevated temperature.</a> Molecular and General Genetics. 187 (1), 47-53 (1982).</li><li>Winter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sum1/Ndt80+transcriptional+switch+and+commitment+to+meiosis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (1), 1-15 (2012).</li><li>Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporulation+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).</li><li>Robinett, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+al.+In+vivo+localization+of+DNA+sequences+and+visualization+of+large-scale+chromatin+organization+using+lac+operator/repressor+recognition.">C. al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition.</a> Journal of Cell Biology. 135, 1685-1700 (1996).</li><li>Straight, A. F., Belmont, A. S., Robinett, C. C., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP+tagging+of+budding+yeast+chromosomes+reveals+that+protein-protein+interactions+can+mediate+sister+chromatid+cohesion.">GFP tagging of budding yeast chromosomes reveals that protein-protein interactions can mediate sister chromatid cohesion.</a> Current Biology. 6 (12), 1599-1608 (1996).</li><li>Sym, M., Engebrecht, J. A., Roeder, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZIP1+is+a+synaptonemal+complex+protein+required+for+meiotic+chromosome+synapsis.">ZIP1 is a synaptonemal complex protein required for meiotic chromosome synapsis.</a> Cell. 72 (3), 365-378 (1993).</li><li>Scherthan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+mobility+during+meiotic+prophase+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Chromosome mobility during meiotic prophase in Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16934-16939 (2007).</li></ol>

Denne protokollen kombinerer NDT80-in-systemet for å synkronisere celler, anker bort-teknikken for å tømme proteiner fra kjernen, og fluorescens time-lapse-mikroskopi for å avbilde spirende gjærceller under meiose. NDT80-in-systemet er en metode for synkronisering av meiotisk cellesyklus som benytter en profase I-arrestasjon og frigjøring 4,8. Selv om individuelle celler vil variere litt i mengden tid brukt i hvert av de påfølgende meiot...

Time-lapse fluorescensmikroskopi er et verdifullt verktøy for å studere dynamikken i meiotisk kromosomsegregering i spirende gjær 1,2. Spirende gjærceller kan induseres til å gjennomgå meiose gjennom sult av viktige næringsstoffer. Under meiose gjennomgår cellene en runde kromosomsegregering etterfulgt av to divisjoner for å lage fire meiotiske produkter som pakkes inn i sporer (figur 1). Individuelle celler kan visualiseres gjennom hvert stadium av meiose, noe som genererer romlige og tidsmessige data som lett kan gå glipp av fastcellebilder. Denne protokollen viser hvordan kombinasjon av time-lapse fluorescensmikroskopi med to tidligere etablerte metoder, det induserbare NDT80-systemet (NDT80-in) og anchor away-teknikken, kan brukes til å studere funksjonen til spesifikke proteiner i forskjellige meiotiske stadier.
NDT80-in-systemet er et kraftig verktøy for meiotisk cellesyklussynkronisering som er avhengig av det induserbare uttrykket til den midterste meiosetranskripsjonsfaktoren NDT80 4,5. NDT80-uttrykk kreves for profase I-utgang 6,7. Med NDT80-in-systemet er NDT80 under kontroll av GAL1-10-promotoren i celler som uttrykker Gal4-transkripsjonsfaktoren smeltet sammen med en østrogenreseptor (Gal4-ER)4,5. Fordi Gal4-ER bare kommer inn i kjernen når den er bundet til β-østradiol, arresterer NDT80-in-celler i profase I i fravær av β-østradiol, noe som tillater synkronisering av celler i profase I (figur 1). β-østradiol-addisjon fremmer translokasjonen av Gal4-ER-transkripsjonsfaktoren i kjernen, hvor den binder GAL1-10 for å drive uttrykk for NDT80, noe som fører til synkron inntreden i meiotiske divisjoner. Selv om time-lapse mikroskopi kan utføres uten synkronisering, er fordelen med å bruke synkronisering evnen til å legge til en inhibitor eller et stoff mens cellene er på et bestemt stadium av meiose.
Anker bort-teknikken er et induserbart system der et protein kan utarmes fra kjernen med tilsetning av rapamycin8. Denne teknikken er ideell for å studere nukleære proteiner under celledeling i spirende gjær fordi gjærceller gjennomgår lukket mitose og meiose, hvor kjernemuskulaturen ikke brytes ned. Videre er denne teknikken veldig nyttig for proteiner som har flere funksjoner gjennom meiose. I motsetning til for delesjoner, mutante alleler eller meiotiske nullalleler, kompromitterer ikke fjerning av et målprotein fra kjernen på et bestemt stadium målproteinaktiviteten i tidligere stadier, noe som muliggjør en mer nøyaktig tolkning av resultatene. Ankersystemet benytter shuttling av ribosomale underenheter mellom kjernen og cytoplasma som oppstår ved ribosomal modning8. For å tømme målproteinet fra kjernen, merkes målproteinet med FKBP12-rapamycinbindende domene (FRB) i en stamme der den ribosomale underenheten Rpl13A er merket med FKBP12. Uten rapamycin interagerer ikke FRB og FKBP12, og det FRB-merkede proteinet forblir i kjernen. Ved tilsetning av rapamycin danner rapamycin et stabilt kompleks med FKBP12 og FRB, og komplekset transporteres ut av kjernen på grunn av interaksjonen med Rpl13A (figur 1). For å forhindre celledød ved rapamycintilsetning, har celler tor1-1-mutasjonen av TOR1-genet . I tillegg inneholder disse cellene fpr1Δ , et nullallel av S. cerevisiae FKBP12-proteinet, som forhindrer endogen Fpr1 fra å utkonkurrere Rpl13A-FKBP12 for FRB- og rapamycinbinding. Ankeret bort bakgrunnsmutasjoner, tor1-1 og fpr1Δ, påvirker ikke meiotiske tidspunkter eller kromosomsegregering2.
For å demonstrere nytten av denne teknikken ble kinetochoreproteinet Ctf19 utarmet på forskjellige tidspunkter gjennom meiose. Ctf19 er en komponent i kinetochore som er dispenserbar i mitose, men kreves for riktig kromosomsegregering i meiose 9,10,11,12,13. I meiose kastes kinetochore i profase I, og Ctf19 er viktig for kinetochore re-montering 9,14. For denne protokollen ble celler med NDT80-in-systemet synkronisert, og anker bort-teknikken ble brukt til å tømme målproteinet Ctf19 fra kjernen før og etter frigjøringen fra profase I, og etter meiose I kromosomsegregering (figur 1). Denne protokollen kan tilpasses for å tømme andre proteiner av interesse i ethvert stadium av meiose og mitose.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-estradiol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E8875</td>
			<td>Make 1mM stocks in 95% EtOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 uM Threaded Bottle-top Filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2GPT02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% EtOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-032-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399500</td>
			<td>Dilute 1:10 to use as solvent for ConA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm x 50 mm coverslip No. 1.5</td>
			<td>VWR North American</td>
			<td>48393241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm x 75 mm microscope slides</td>
			<td>VWR North American</td>
			<td>48300-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine hemisulfate salt</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9126</td>
			<td>To supplement SC, SCA, and 1% Kac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavialin A</td>
			<td>Mllipore Sigma</td>
			<td>C2010</td>
			<td>Make as 1mg/mL in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSNAP HQ2 CCD camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>Used in Section 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids</td>
			<td>BD</td>
			<td>291920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2 inverted-objective micrscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Used in Section 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Download from https://fiji.sc/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Personal DeltaVision Microscope</td>
			<td>Applied Precision</td>
			<td></td>
			<td>Used in Section 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophan&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T0254</td>
			<td>To supplement SC, SCA, and 1% Kac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling Clay</td>
			<td>Crayola</td>
			<td>&#160;2302880000</td>
			<td>To secure coverslip in slide holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 5.30.04 Imaging Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Used in Section 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Fustion BT Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C15440-20UP</td>
			<td>Used in Section 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette tip holder</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>LTS1000-HR</td>
			<td>Cut a 4 square x 4 square section of the rack portion of this product.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottassium Acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapamycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP29631</td>
			<td>Make 1mg/mL stocks in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Sealant</td>
			<td>Aqueon</td>
			<td>100165001</td>
			<td>Also known as aquarium glue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SoftWorx7.0.0&#160; Imaging Software</td>
			<td>Applied Precision</td>
			<td></td>
			<td>Used in Section 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic Complete Mixture (Kaiser)&#160;</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DSCK2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type N immersion oil&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MXA22166</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of time-lapse microscopy and stage-specific nuclear depletion of proteins to study meiosis in s. cerevisiae

Time-lapse fluorescensmikroskopi har revolusjonert forståelsen av meiotiske cellesyklushendelser ved å gi tidsmessige og romlige data som ofte ikke ses ved å avbilde faste celler. Spirende gjær har vist seg å være en viktig modellorganisme for å studere meiotisk kromosomsegregering fordi mange meiotiske gener er svært konserverte. Time-lapse mikroskopi av meiose i spirende gjær gjør det mulig å overvåke forskjellige meiotiske mutanter for å vise hvordan mutasjonen forstyrrer meiotiske prosesser. Imidlertid fungerer mange proteiner på flere punkter i meiose. Bruk av funksjonstap eller meiotiske nullmutanter kan derfor forstyrre en tidlig prosess, blokkere eller forstyrre den senere prosessen og gjøre det vanskelig å bestemme fenotypene knyttet til hver enkelt rolle. For å omgå denne utfordringen beskriver denne protokollen hvordan proteinene kan bli betinget utarmet fra kjernen i bestemte stadier av meiose mens de overvåker meiotiske hendelser ved hjelp av time-lapse mikroskopi. Spesielt beskriver denne protokollen hvordan cellene synkroniseres i profase I, hvordan anker bort-teknikken brukes til å tømme proteiner fra kjernen i bestemte meiotiske stadier, og hvordan time-lapse-avbildning brukes til å overvåke meiotisk kromosomsegregering. Som et eksempel på bruken av teknikken ble kinetochoreproteinet Ctf19 utarmet fra kjernen på forskjellige tidspunkter under meiose, og antall kromatinmasser ble analysert ved slutten av meiose II. Samlet sett kan denne protokollen tilpasses for å tømme forskjellige nukleære proteiner fra kjernen mens du overvåker de meiotiske divisjonene.

For å overvåke kromatinsegregering ble histonprotein Htb2 merket med mCherry. I profase I vises kromatinet som en enkelt Htb2-masse. Etter at homologe kromosomer segregerer i den første meiotiske delingen, fremstår kromatinet som to distinkte masser (figur 3A). Etter at søsterkromatidene segregerer, vises kromatinet som fire masser. Hvis noen kromosomer ikke fester seg til spindelmikrotubuli, kan ytterligere masser ses etter meiose I eller meiose II.
Metoden ...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae at JoVE.com

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse mikroskopi er et verdifullt verktøy for å studere meiose i spirende gjær. Denne protokollen beskriver en metode som kombinerer cellesyklussynkronisering, time-lapse-mikroskopi og betinget uttømming av et målprotein for å demonstrere hvordan man studerer funksjonen til et bestemt protein under meiotisk kromosomsegregering.

Bruk av time-lapse mikroskopi og trinnspesifikk nukleær uttømming av proteiner for å studere meiose i S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...

Ved å synkronisere celler i profase en og deretter tømme målproteinet på et bestemt stadium, kan denne metoden identifisere midlertidig distinkte funksjoner av bestemte proteiner. Betinget nedbrytende proteiner i bestemte stadier av myose forhindrer de resterende effektene en tradisjonell myotisk mutant kan ha på senere stadier. Denne metoden kan brukes til å studere spirende gjærmitose og andre organismer som ikke gjennomgår kjernefysisk konvoluttbrudd.I tillegg kan denne metoden brukes i andre organismer for å studere cellesyklushendelser før kjernefysisk konvoluttbrudd. For å begynne, lag en agarpute som skal brukes til å lage et monolag av celler for avbildning. Klipp av og kast hetten og bunnen en tredjedel av et 1, 5 milliliter mikrocentrifugerør for å lage en sylinder som vil tjene som en form for agarputen.Plasser den kuttede mikrosentrifugerørsylinderen på et rent glassglass med toppen av røret opp ned, sittende på lysbildet. Lag seks milliliter av en 5% agar løsning i en 50 milliliter beger. Klipp av spissen av pipetten for å lage en større åpning og pipette ca 500 mikroliter smeltet agar inn i mikrosentrifugerøret.La den sitte ved romtemperatur til agar stivner. For å forberede gjærceller, spinn ned 200 mikroliter av sporuleringskulturen ved 800 G i to minutter i en milliliter mikrocentrifugerør. Kast bort 180 mikroliter av supernatanten.Resuspend pelleten i den gjenværende supernatanten ved å virvle og flikke på røret. Pipette seks mikroliter av de konsentrerte cellene på dekselet glir midt i kammeret på stedet med ConA. Hold sylinderen med agarputen og skyv den forsiktig av glassglasset.Forsikre deg om at agar er helt flatt i bunnen og bruk bunnen av pipettespissen, bruk en liten mengde trykk på mikrosentrifugeformen slik at agarputen skyves ut litt over rørets grense. Deretter inverterer du formen slik at agarputen vender ned mot kammeret. Bruk tang til å forsiktig plassere agarputen på toppen av cellene og pipettespissen for å forsiktig skyve agarputen rundt kammeret 10 til 20 ganger for å skape et monolag av celler på dekselet.Hold agarputen i kammeret i 12 til 15 minutter. Deretter overfører du to milliliter sporuleringskultur til to mikrocentrifugerør og spinner ved 15.700 G i to minutter. Etter å ha overført supernatanten til rene mikrocentrifugerør, spinn igjen i samme tilstand og samle supernatanten for å rengjøre mikrocentrifugerør.Tilsett to milliliter av supernatanten dråpevis til kammeret som inneholder agarputen. Når væsken har nådd toppen av kammeret, vil agarputen mest sannsynlig flyte. Fjern agarputen forsiktig med tang og kast den.Plasser en 24 x 50 millimeter dekselglid på toppen av kammeret for å forhindre fordampning under avbildning. Hvis du vil sette opp filmen på mikroskopet, setter du dekselet inn i lysbildeholderen. Fest støpeleiren til siden av dekselet for å holde den fast i glidebryteren.Åpne programvaren for bildeinnhenting. Bruk grove og finjusteringsknapper for å fokusere cellene ved hjelp av DIC eller lyst felt. På hovedmenyen til bildeoppkjøpsprogramvaren klikker du på Fil, velger Skaff, og fire vinduer dukker opp.I vinduet som heter Resolve 3D, klikk på Erlenmeyer kolbeikon. Dette åpner et vindu med tittelen Utformingskjøringseksperiment, som inneholder kontrollene for å konfigurere et eksperiment for å konfigurere en intervallfilm. Under Utforming-fanen navigerer du til fanen merket Seksjonering.Merk av i boksen ved siden av Z-inndelingen, og sett den optiske inndelingsavstanden til én mikrometer og antall optiske inndelinger til fem. Deretter, under kategorien Kanaler, klikker du på plussikonet og velger riktig kanal. Velg deretter boksen ved siden av Referansebilde og sett Z-posisjonen til midten av prøven fra rullegardinmenyen.Velg en verdi for transmittans og eksponeringstid fra rullegardinmenyen. Under Time-lapse-fanen merker du av i boksen ved siden av Time-lapse og angir verdier for minutter og timer for å identifisere tidsintervallet for bildeopptak. Merk av i boksen ved siden av Behold fokus med Ultimate Focus for å forhindre scenedrift under filmen.Og under Poeng-fanen velger du boksen ved siden av Besøk punktliste. I hovedmenyen klikker du på Vis og velger Punktliste. Flytt scenen til et område av kammeret som viser et monolag av celler.Klikk på Point i Point List-vinduet. Flytt scenen for å velge 25 til 30 punkter uten overlapping for å unngå å overeksponere cellene og bildet hvert felt i løpet av hvert kurs. I vinduet Punktliste velger du Kalibrer alle for å angi det endelige fokuset for hvert punkt.Under Kjør-fanen lagrer du filen til riktig destinasjon på datamaskinen. I vinduet Kjør eksperiment velger du Spill av-knappen for å starte filmen. Åpne Fiji-programvaren.Åpne DIC- og mCherry-kanalene. Få en enkelt maksimal intensitetsprojeksjon av mCherry-kanalen ved å klikke på Bilde, etterfulgt av Stabler og Z-prosjekt og velg Maks intensitet fra rullegardinmenyen. For å slå sammen DIC- og mCherry-kanalene i ett bilde, klikk på Bilde, Farge og velg Slå sammen kanaler.Følg en enkelt celle gjennom meiose. Etter fullført meiosis II, registrer antall DNA-masser. I villtypeceller med ankerbakgrunnen er det vanligvis fire DNA-masser på slutten av meiose II, som representerer de fire produktene av meiose.I en liten brøkdel av cellene er bare tre masser synlige etter meiose II.Når Ctf19-FRB er forankret bort på tidspunktet for frigjøring av profase I, viser omtrent 47% av cellene mer enn fire DNA-masser ved fullføring av meiose, noe som tyder på en defekt i vedlegget av kinetochores og mikrotubuli. Med forankring bort av Ctf19-FRB, enten etter kinetochore-montering, men før meiose I, eller etter meiose II, viser omtrent 16% av cellene ytterligere DNA-masser. En av de viktigste delene av denne protokollen er å legge supernatanten dråpevis til kammeret ditt for å unngå å forstyrre monolaget ditt.I tillegg må du legge merke til tiden som kreves for å forberede seg på bildebehandling for å vurdere det i analysen. Ved å endre fluorescerende pakket proteiner, kan denne prosedyren brukes til å svare på spørsmålene om cellesyklusvarighet, kromosomsegregering, protein overflod og proteinlokalisering.

Research

JoVE Journal

Biology

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Kvantitativ analyse av Random migrasjon av celler ved hjelp av Time-lapse video Mikroskopi

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Flowcytometri-basert Rensing av<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zygoter

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Bruk av Time Lapse Mikroskopi å visualisere anoxia-indusert suspendert animasjon i<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryoer

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...