Name: use of time-lapse microscopy and stage-specific nuclear depletion of proteins to study meiosis in s. cerevisiae
Uploaded: 2022-10-11T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae at JoVE.com

Agradecemos ao Centro de Imagem de Microscopia de Luz da Universidade de Indiana. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa dos Institutos Nacionais de Saúde (GM105755).

1. Preparação dos materiais necessários
<ol><li>Preparar reagentes para o crescimento e esporulação de células de levedura. NOTA: Se as cepas de levedura em brotamento forem ade2 - e trp1-, complemente todos os meios nas etapas 1.1.1-1.1.3 com uma concentração final de 0,01% de adenina e 0,01% de triptofano de 1% de estoques. Se o meio esterilizante por autoclave, adicione estes aminoácidos somente depois que os reagentes tiverem sido autoclavados e deixados esfriar até a...

<ol>
	<li>Tsuchiya, D., Gonzalez, C., Lacefield, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+checkpoint+protein+Mad2+regulates+APC/C+activity+during+prometaphase+and+metaphase+of+meiosis+I+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The spindle checkpoint protein Mad2 regulates APC/C activity during prometaphase and metaphase of meiosis I in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (16), 2848-2861 (2011).</li><li>Cairo, G., MacKenzie, A. M., Lacefield, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+requirement+for+Bub1+and+Bub3+in+regulation+of+meiotic+versus+mitotic+chromosome+segregation.">Differential requirement for Bub1 and Bub3 in regulation of meiotic versus mitotic chromosome segregation.</a> Journal of Cell Biology. 219 (4), 201909136 (2020).</li><li>van Werven, F. J., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+entry+into+gametogenesis.">Regulation of entry into gametogenesis.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 366 (1584), 3521-3531 (2011).</li><li>Carlile, T. M., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+I+is+established+through+division-specific+translational+control+of+a+cyclin.">Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin.</a> Cell. 133 (2), 280-291 (2008).</li><li>Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+landmark+events+in+meiosis+by+the+CDK+Cdc28+and+the+meiosis-specific+kinase+Ime2.">Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2.</a> Genes and Development. 17 (12), 1524-1539 (2003).</li><li>Xu, L., Ajimura, M., Padmore, R., Klein, C., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NDT80,+a+meiosis-specific+gene+required+for+exit+from+pachytene+in+Saccharomyces+cerevisiae.">NDT80, a meiosis-specific gene required for exit from pachytene in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6572-6581 (1995).</li><li>Chu, S., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gametogenesis+in+yeast+is+regulated+by+a+transcriptional+cascade+dependent+on+Ndt80.">Gametogenesis in yeast is regulated by a transcriptional cascade dependent on Ndt80.</a> Molecular Cell. 1 (5), 685-696 (1998).</li><li>Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anchor-away+technique:+rapid,+conditional+establishment+of+yeast+mutant+phenotypes.">The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes.</a> Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).</li><li>Borek, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteomic+landscape+of+centromeric+chromatin+reveals+an+essential+role+for+the+Ctf19(CCAN)+complex+in+meiotic+kinetochore+assembly.">The proteomic landscape of centromeric chromatin reveals an essential role for the Ctf19(CCAN) complex in meiotic kinetochore assembly.</a> Current Biology. 31 (2), 283-296 (2021).</li><li>Mehta, G. D., Agarwal, M., Ghosh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+kinetochore+protein,+Ctf19+in+meiosis+I:+an+implication+of+differential+impact+of+Ctf19+on+the+assembly+of+mitotic+and+meiotic+kinetochores+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Functional characterization of kinetochore protein, Ctf19 in meiosis I: an implication of differential impact of Ctf19 on the assembly of mitotic and meiotic kinetochores in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Microbiology. 91 (6), 1179-1199 (2014).</li><li>Ortiz, J., Stemmann, O., Rank, S., Lechner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+protein+complex+consisting+of+Ctf19,+Mcm21,+and+Okp1+represents+a+missing+link+in+the+budding+yeast+kinetochore.">A putative protein complex consisting of Ctf19, Mcm21, and Okp1 represents a missing link in the budding yeast kinetochore.</a> Genes and Development. 13 (9), 1140-1155 (1999).</li><li>Hyland, K. M., Kingsbury, J., Koshland, D., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ctf19p:+A+novel+kinetochore+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae+and+a+potential+link+between+the+kinetochore+and+mitotic+spindle.">Ctf19p: A novel kinetochore protein in Saccharomyces cerevisiae and a potential link between the kinetochore and mitotic spindle.</a> Journal of Cell Biology. 145 (1), 15-28 (1999).</li><li>Fernius, J., Marston, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+cohesion+at+the+pericentromere+by+the+Ctf19+kinetochore+subcomplex+and+the+replication+fork-associated+factor,+Csm3.">Establishment of cohesion at the pericentromere by the Ctf19 kinetochore subcomplex and the replication fork-associated factor, Csm3.</a> PLoS Genetics. 5 (9), 1000629 (2009).</li><li>Meyer, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ipl1/Aurora-B+is+necessary+for+kinetochore+restructuring+in+meiosis+I+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Ipl1/Aurora-B is necessary for kinetochore restructuring in meiosis I in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (17), 2986-3000 (2015).</li><li>Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+sporulation+conditions+for+different+Saccharomyces+cerevisiae+strain+backgrounds.">Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds.</a> Methods in Molecular Biology. 557, 21-26 (2009).</li><li>Deutschbauer, A. M., Davis, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+trait+loci+mapped+to+single-nucleotide+resolution+in+yeast.">Quantitative trait loci mapped to single-nucleotide resolution in yeast.</a> Nature Genetics. 37 (12), 1333-1340 (2005).</li><li>Ben-Ari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+linked+genes+participate+in+controlling+sporulation+efficiency+in+budding+yeast.">Four linked genes participate in controlling sporulation efficiency in budding yeast.</a> PLoS Genetics. 2 (11), 195 (2006).</li><li>Primig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+core+meiotic+transcriptome+in+budding+yeasts.">The core meiotic transcriptome in budding yeasts.</a> Nature Genetics. 26 (4), 415-423 (2000).</li><li>Spencer, F., Gerring, S. L., Connelly, C., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+chromosome+transmission+fidelity+mutants+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Mitotic chromosome transmission fidelity mutants in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 124 (2), 237-249 (1990).</li><li>Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+source+dependent+promoters+in+yeasts.">Carbon source dependent promoters in yeasts.</a> Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).</li><li>Byers, B., Goetsch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+pachytene+arrest+of+Saccharomyces+cerevisiae+at+elevated+temperature.">Reversible pachytene arrest of Saccharomyces cerevisiae at elevated temperature.</a> Molecular and General Genetics. 187 (1), 47-53 (1982).</li><li>Winter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sum1/Ndt80+transcriptional+switch+and+commitment+to+meiosis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (1), 1-15 (2012).</li><li>Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporulation+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).</li><li>Robinett, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+al.+In+vivo+localization+of+DNA+sequences+and+visualization+of+large-scale+chromatin+organization+using+lac+operator/repressor+recognition.">C. al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition.</a> Journal of Cell Biology. 135, 1685-1700 (1996).</li><li>Straight, A. F., Belmont, A. S., Robinett, C. C., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP+tagging+of+budding+yeast+chromosomes+reveals+that+protein-protein+interactions+can+mediate+sister+chromatid+cohesion.">GFP tagging of budding yeast chromosomes reveals that protein-protein interactions can mediate sister chromatid cohesion.</a> Current Biology. 6 (12), 1599-1608 (1996).</li><li>Sym, M., Engebrecht, J. A., Roeder, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZIP1+is+a+synaptonemal+complex+protein+required+for+meiotic+chromosome+synapsis.">ZIP1 is a synaptonemal complex protein required for meiotic chromosome synapsis.</a> Cell. 72 (3), 365-378 (1993).</li><li>Scherthan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+mobility+during+meiotic+prophase+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Chromosome mobility during meiotic prophase in Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16934-16939 (2007).</li></ol>

Este protocolo combina o sistema NDT80-in para sincronizar células, a técnica de ancoragem para esgotar proteínas do núcleo e a microscopia de lapso de tempo de fluorescência para visualizar células de levedura em brotamento durante a meiose. O sistema NDT80-in é um método de sincronização do ciclo celular meiótico que utiliza uma prófase I de parada e liberação 4,8. Embora as células individuais variem ligeiramente na quantidade ...

A microscopia de fluorescência time-lapse é uma ferramenta valiosa para o estudo da dinâmica da segregação cromossômica meiótica em leveduras em brotamento 1,2. As células de levedura em brotamento podem ser induzidas a sofrer meiose através da fome de nutrientes essenciais3. Durante a meiose, as células passam por uma rodada de segregação cromossômica seguida de duas divisões para criar quatro produtos meióticos que são embalados em esporos (Figura 1). Células individuais podem ser visualizadas ao longo de cada estágio da meiose, o que gera dados espaciais e temporais que podem ser facilmente perdidos por imagens de células fixas. Este protocolo mostra como a combinação da microscopia de fluorescência de lapso de tempo com dois métodos previamente estabelecidos, o sistema induzível NDT80 (NDT80-in) e a técnica de anchor away, pode ser usada para estudar a função de proteínas específicas em estágios meióticos distintos.
O sistema NDT80-in é uma poderosa ferramenta para sincronização do ciclo celular meiótico que se baseia na expressão induzível do fator de transcrição da meiose média NDT80 4,5. A expressão NDT80 é necessária para a saída 6,7 da prófase I. Com o sistema NDT80-in, o NDT80 está sob o controle do promotor GAL1-10 em células que expressam o fator de transcrição Gal4 fundido a um receptor de estrogênio (Gal4-ER)4,5. Como a Gal4-ER só entra no núcleo quando ligada ao β-estradiol, as células NDT80-in param na prófase I na ausência de β-estradiol, o que permite a sincronização das células na prófase I (Figura 1). β adição de estradiol promove a translocação do fator de transcrição Gal4-ER para o núcleo, onde se liga à GAL1-10 para impulsionar a expressão de NDT80, levando à entrada síncrona nas divisões meióticas. Embora a microscopia de lapso de tempo possa ser realizada sem sincronização, a vantagem de usar a sincronização é a capacidade de adicionar um inibidor ou uma droga enquanto as células estão em um estágio específico da meiose.
A técnica de anchor away é um sistema induzível pelo qual uma proteína pode ser esgotada do núcleo com a adição de rapamicina8. Esta técnica é ideal para estudar proteínas nucleares durante a divisão celular em leveduras em brotamento, porque as células de levedura sofrem mitose e meiose fechadas, nas quais o envelope nuclear não se decompõe. Além disso, esta técnica é muito útil para proteínas que têm múltiplas funções ao longo da meiose. Ao contrário de deleções, alelos mutantes ou alelos nulos meióticos, a remoção de uma proteína-alvo do núcleo em um estágio específico não compromete a atividade da proteína-alvo em estágios anteriores, permitindo uma interpretação mais precisa dos resultados. O sistema de ancoragem afastada utiliza o deslocamento de subunidades ribossomais entre o núcleo e o citoplasma que ocorre na maturação ribossômica8. Para esgotar a proteína-alvo do núcleo, a proteína-alvo é marcada com o domínio de ligação à rapamicina FKBP12 (FRB) em uma cepa na qual a subunidade ribossomal Rpl13A é marcada com FKBP12. Sem rapamicina, FRB e FKBP12 não interagem, e a proteína marcada com FRB permanece no núcleo. Após a adição de rapamicina, a rapamicina forma um complexo estável com FKBP12 e FRB, e o complexo é transportado para fora do núcleo devido à interação com Rpl13A (Figura 1). Para evitar a morte celular após a adição de rapamicina, as células abrigam a mutação tor1-1 do gene TOR1 . Além disso, essas células contêm fpr1Δ , um alelo nulo da proteína S. cerevisiae FKBP12, que impede que a Fpr1 endógena supere a Rpl13A-FKBP12 para FRB e ligação à rapamicina. As mutações de fundo ancoradas afastadas, tor1-1 e fpr1Δ, não afetam os tempos meióticos ou a segregação cromossômica2.
Para demonstrar a utilidade desta técnica, a proteína cinetócora Ctf19 foi esgotada em diferentes momentos ao longo da meiose. Ctf19 é um componente do cinetócoro que é dispensável na mitose, mas necessário para a segregação cromossômica adequada na meiose 9,10,11,12,13. Na meiose, o cinetócoro é eliminado na prófase I, e o Ctf19 é importante para a remontagem do cinetócoro 9,14. Para este protocolo, as células com o sistema NDT80-in foram sincronizadas, e a técnica de anchor away foi utilizada para esgotar a proteína-alvo Ctf19 do núcleo antes e após a liberação da prófase I e após a segregação cromossômica da meiose I (Figura 1). Este protocolo pode ser adaptado para esgotar outras proteínas de interesse em qualquer estágio da meiose e mitose.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-estradiol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E8875</td>
			<td>Make 1mM stocks in 95% EtOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 uM Threaded Bottle-top Filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2GPT02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% EtOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-032-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399500</td>
			<td>Dilute 1:10 to use as solvent for ConA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm x 50 mm coverslip No. 1.5</td>
			<td>VWR North American</td>
			<td>48393241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm x 75 mm microscope slides</td>
			<td>VWR North American</td>
			<td>48300-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine hemisulfate salt</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9126</td>
			<td>To supplement SC, SCA, and 1% Kac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavialin A</td>
			<td>Mllipore Sigma</td>
			<td>C2010</td>
			<td>Make as 1mg/mL in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSNAP HQ2 CCD camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>Used in Section 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids</td>
			<td>BD</td>
			<td>291920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2 inverted-objective micrscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Used in Section 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Download from https://fiji.sc/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Personal DeltaVision Microscope</td>
			<td>Applied Precision</td>
			<td></td>
			<td>Used in Section 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophan&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T0254</td>
			<td>To supplement SC, SCA, and 1% Kac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling Clay</td>
			<td>Crayola</td>
			<td>&#160;2302880000</td>
			<td>To secure coverslip in slide holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 5.30.04 Imaging Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Used in Section 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Fustion BT Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C15440-20UP</td>
			<td>Used in Section 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette tip holder</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>LTS1000-HR</td>
			<td>Cut a 4 square x 4 square section of the rack portion of this product.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottassium Acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapamycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP29631</td>
			<td>Make 1mg/mL stocks in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Sealant</td>
			<td>Aqueon</td>
			<td>100165001</td>
			<td>Also known as aquarium glue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SoftWorx7.0.0&#160; Imaging Software</td>
			<td>Applied Precision</td>
			<td></td>
			<td>Used in Section 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic Complete Mixture (Kaiser)&#160;</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DSCK2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type N immersion oil&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MXA22166</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of time-lapse microscopy and stage-specific nuclear depletion of proteins to study meiosis in s. cerevisiae

A microscopia de fluorescência de lapso de tempo revolucionou a compreensão dos eventos do ciclo celular meiótico, fornecendo dados temporais e espaciais que muitas vezes não são vistos por imagens de células fixas. A levedura em brotamento provou ser um importante organismo modelo para estudar a segregação cromossômica meiótica, porque muitos genes meióticos são altamente conservados. A microscopia de lapso de tempo da meiose em levedura em brotamento permite o monitoramento de diferentes mutantes meióticos para mostrar como a mutação interrompe os processos meióticos. No entanto, muitas proteínas funcionam em vários pontos da meiose. O uso de mutantes nulos meióticos ou meióticos pode, portanto, interromper um processo precoce, bloqueando ou perturbando o processo posterior e dificultando a determinação dos fenótipos associados a cada papel individual. Para contornar esse desafio, este protocolo descreve como as proteínas podem ser condicionalmente esgotadas do núcleo em estágios específicos da meiose enquanto monitoram eventos meióticos usando microscopia de lapso de tempo. Especificamente, este protocolo descreve como as células são sincronizadas na prófase I, como a técnica de ancoragem é usada para esgotar proteínas do núcleo em estágios meióticos específicos e como a imagem de lapso de tempo é usada para monitorar a segregação cromossômica meiótica. Como exemplo da utilidade da técnica, a proteína cinetócora Ctf19 foi esgotada do núcleo em diferentes momentos durante a meiose, e o número de massas de cromatina foi analisado no final da meiose II. No geral, este protocolo pode ser adaptado para esgotar diferentes proteínas nucleares do núcleo enquanto monitora as divisões meióticas.

Para monitorar a segregação da cromatina, a proteína histona Htb2 foi marcada com mCherry. Na prófase I, a cromatina aparece como uma única massa de Htb2. Após os cromossomos homólogos se segregarem na primeira divisão meiótica, a cromatina aparece como duas massas distintas (Figura 3A). Depois que as cromátides irmãs se segregam, a cromatina aparece como quatro massas. Se alguns cromossomos não se ligarem aos microtúbulos fusiformes, massas adicionais podem ser vistas após a m...

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Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

A microscopia de lapso de tempo é uma ferramenta valiosa para estudar a meiose em leveduras em brotamento. Este protocolo descreve um método que combina sincronização do ciclo celular, microscopia de lapso de tempo e depleção condicional de uma proteína-alvo para demonstrar como estudar a função de uma proteína específica durante a segregação cromossômica meiótica.

Uso de microscopia Time-Lapse e Depleção Nuclear Específica de Estágio de Proteínas para Estudo da Meiose em S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...

Ao sincronizar as células na prófase um e, em seguida, esgotar a proteína-alvo em um estágio específico, esse método pode identificar funções temporariamente distintas de proteínas específicas. Proteínas condicionalmente esgotantes em estágios específicos da miose impedem os efeitos residuais que um mutante miotótico tradicional pode ter em estágios posteriores. Este método poderia ser usado para estudar a mitose de levedura em brotamento e outros organismos que não sofrem quebra do envelope nuclear.Além disso, este método pode ser usado em outros organismos para estudar eventos do ciclo celular antes da quebra do envelope nuclear. Para começar, faça uma almofada de ágar que será usada para criar uma monocamada de células para imagens. Corte e descarte a tampa e o fundo de um terço de um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro para criar um cilindro que servirá como um molde para a almofada de ágar.Coloque o cilindro do tubo de microcentrífuga cortado em uma lâmina de vidro limpa com a parte superior do tubo de cabeça para baixo, sentada no slide. Faça seis mililitros de uma solução de ágar a 5% em um copo de 50 mililitros. Corte a ponta da pipeta para fazer uma abertura maior e pipete aproximadamente 500 microlitros de ágar derretido no tubo de microcentrífuga.Deixe descansar à temperatura ambiente até que o ágar se solidifique. Para preparar as células de levedura, gire 200 microlitros da cultura de esporulação a 800 G por dois minutos em tubos de microcentrífuga de um mililitro. Descarte 180 microlitros do sobrenadante.Ressuspeite a pastilha no sobrenadante restante girando e agitando o tubo. Pipetar seis microlitros das células concentradas para a tampa deslizar no meio da câmara no local com. Segure o cilindro com a almofada de ágar e deslize-o cuidadosamente para fora da lâmina de vidro.Certifique-se de que o ágar esteja completamente plano na parte inferior e, usando a parte inferior da ponta da pipeta, aplique uma pequena quantidade de pressão no molde da microcentrífuga, de modo que a almofada de ágar seja empurrada ligeiramente acima do limite do tubo. Em seguida, inverta o molde de tal forma que a almofada de ágar esteja voltada para baixo em direção à câmara. Use fórceps para colocar suavemente a almofada de ágar no topo das células e a ponta da pipeta para deslizar suavemente a almofada de ágar ao redor da câmara 10 a 20 vezes para criar uma monocamada de células no deslizamento da tampa.Mantenha a almofada de ágar na câmara por 12 a 15 minutos. Em seguida, transfira dois mililitros de cultura de esporulação para dois tubos de microcentrífuga e gire a 15.700 G por dois minutos. Depois de transferir o sobrenadante para tubos de microcentrífuga limpos, gire novamente na mesma condição e colete o sobrenadante para limpar os tubos de microcentrífuga.Adicione dois mililitros do sobrenadante gota a gota à câmara que contém a almofada de ágar. Uma vez que o líquido tenha atingido o topo da câmara, a almofada de ágar provavelmente flutuará. Remova a almofada de ágar suavemente com pinça e descarte-a.Coloque uma tampa de 24 por 50 milímetros na parte superior da câmara para evitar a evaporação durante a imagem. Para configurar o filme no microscópio, encaixe a tampa dentro do suporte da lâmina. Cole a argila de moldagem ao lado da tampa para mantê-la segura no suporte da corrediça.Abra o software de aquisição de imagens. Use botões de ajuste grossos e finos para focar as células usando DIC ou campo brilhante. No menu principal do software de aquisição de imagens, clique em Arquivo, selecione Adquirir e quatro janelas aparecerão.Na janela denominada Resolve 3D, clique no ícone do frasco de Erlenmeyer. Isso abrirá uma janela intitulada Design Run Experiment, que contém os controles para configurar um experimento para configurar um filme de lapso de tempo. Na guia Design, navegue até a guia Seccionamento.Selecione a caixa ao lado de Seção Z e defina o espaçamento de seção óptica para um micrômetro e o número de seções ópticas para cinco. Em seguida, na guia Canais, clique no ícone de adição e selecione o canal apropriado. Em seguida, selecione a caixa ao lado de Imagem de referência e defina a posição Z para o meio da amostra no menu suspenso.Selecione um valor de transmitância e tempo de exposição no menu suspenso. Na guia Time-lapse, marque a caixa ao lado de Time-lapse e insira valores para minutos e horas para identificar o intervalo de tempo de aquisição de imagem. Marque a caixa ao lado de Manter o foco com foco final para evitar desvios de palco durante o filme.E na guia Pontos, marque a caixa ao lado de Visitar Lista de Pontos. No menu principal, clique em Exibir e selecione Lista de pontos. Mova o palco para uma área da câmara que mostre uma monocamada de células.Clique em Marcar ponto na janela Lista de pontos. Mova o estágio para selecionar de 25 a 30 pontos sem qualquer sobreposição para evitar a superexposição das células e da imagem de cada campo durante cada curso de tempo. Na janela Lista de pontos, selecione Calibrar tudo para definir o foco final para cada ponto.Na guia Executar, salve o arquivo no destino apropriado no computador. Na janela Executar experimento, selecione o botão Reproduzir para iniciar o filme. Abra o software Fiji.Abra os canais DIC e mCherry. Obtenha uma única projeção de intensidade máxima do canal mCherry clicando em Imagem, seguido por Pilhas e Projeto Z e selecione Intensidade Máxima no menu suspenso. Para mesclar os canais DIC e mCherry em uma imagem, clique em Imagem, Cor e selecione Mesclar canais.Siga uma única célula através da meiose. Após a conclusão da meiose II, registre o número de massas de DNA. Em células do tipo selvagem com o fundo de âncora afastada, há tipicamente quatro massas de DNA no final da meiose II, representando os quatro produtos da meiose.Em uma pequena fração das células, apenas três massas são visíveis após a meiose II.Quando o Ctf19-FRB é ancorado no momento da liberação da prófase I, aproximadamente 47% das células exibem mais de quatro massas de DNA após a conclusão da meiose, sugerindo um defeito na fixação de cinetocoros e microtúbulos. Com a ancoragem de Ctf19-FRB, após a montagem do cinetócoro, mas antes da meiose I, ou após a meiose II, aproximadamente 16% das células exibem massas de DNA adicionais. Uma das partes mais importantes deste protocolo é adicionar o sobrenadante dropwise à sua câmara para evitar interromper sua monocamada.Além disso, observe o tempo necessário para se preparar para a geração de imagens para considerá-la em sua análise. Ao alterar proteínas fluorescentes, este procedimento pode ser usado para responder às perguntas sobre a duração do ciclo celular, segregação cromossômica, abundância de proteínas e localização de proteínas.

Research

JoVE Journal

Biology

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Ensaio para a Adesão e Invasão Agar em S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Biologia

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

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Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Dois fótons axotomia e lapso de tempo de imagem confocal em embriões de peixe-zebra ao vivo

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Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

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Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

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Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

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