Name: use of time-lapse microscopy and stage-specific nuclear depletion of proteins to study meiosis in s. cerevisiae
Uploaded: 2022-10-11T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae at JoVE.com

Мы благодарим Центр визуализации световой микроскопии в Университете Индианы. Эта работа была поддержана грантом Национальных институтов здравоохранения (GM105755).

1. Подготовка необходимых материалов
<ol><li>Подготовьте реагенты для роста и споруляции дрожжевых клеток. ПРИМЕЧАНИЕ: Если начинающиеся штаммы дрожжей представляют собой аде2- и trp1-, дополните все среды на этапах 1.1.1-1.1.3 конечной концентрацией 0,01% аденина и 0,01% триптоф?...

<ol>
	<li>Tsuchiya, D., Gonzalez, C., Lacefield, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+checkpoint+protein+Mad2+regulates+APC/C+activity+during+prometaphase+and+metaphase+of+meiosis+I+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The spindle checkpoint protein Mad2 regulates APC/C activity during prometaphase and metaphase of meiosis I in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (16), 2848-2861 (2011).</li><li>Cairo, G., MacKenzie, A. M., Lacefield, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+requirement+for+Bub1+and+Bub3+in+regulation+of+meiotic+versus+mitotic+chromosome+segregation.">Differential requirement for Bub1 and Bub3 in regulation of meiotic versus mitotic chromosome segregation.</a> Journal of Cell Biology. 219 (4), 201909136 (2020).</li><li>van Werven, F. J., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+entry+into+gametogenesis.">Regulation of entry into gametogenesis.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 366 (1584), 3521-3531 (2011).</li><li>Carlile, T. M., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+I+is+established+through+division-specific+translational+control+of+a+cyclin.">Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin.</a> Cell. 133 (2), 280-291 (2008).</li><li>Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+landmark+events+in+meiosis+by+the+CDK+Cdc28+and+the+meiosis-specific+kinase+Ime2.">Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2.</a> Genes and Development. 17 (12), 1524-1539 (2003).</li><li>Xu, L., Ajimura, M., Padmore, R., Klein, C., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NDT80,+a+meiosis-specific+gene+required+for+exit+from+pachytene+in+Saccharomyces+cerevisiae.">NDT80, a meiosis-specific gene required for exit from pachytene in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6572-6581 (1995).</li><li>Chu, S., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gametogenesis+in+yeast+is+regulated+by+a+transcriptional+cascade+dependent+on+Ndt80.">Gametogenesis in yeast is regulated by a transcriptional cascade dependent on Ndt80.</a> Molecular Cell. 1 (5), 685-696 (1998).</li><li>Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anchor-away+technique:+rapid,+conditional+establishment+of+yeast+mutant+phenotypes.">The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes.</a> Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).</li><li>Borek, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteomic+landscape+of+centromeric+chromatin+reveals+an+essential+role+for+the+Ctf19(CCAN)+complex+in+meiotic+kinetochore+assembly.">The proteomic landscape of centromeric chromatin reveals an essential role for the Ctf19(CCAN) complex in meiotic kinetochore assembly.</a> Current Biology. 31 (2), 283-296 (2021).</li><li>Mehta, G. D., Agarwal, M., Ghosh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+kinetochore+protein,+Ctf19+in+meiosis+I:+an+implication+of+differential+impact+of+Ctf19+on+the+assembly+of+mitotic+and+meiotic+kinetochores+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Functional characterization of kinetochore protein, Ctf19 in meiosis I: an implication of differential impact of Ctf19 on the assembly of mitotic and meiotic kinetochores in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Microbiology. 91 (6), 1179-1199 (2014).</li><li>Ortiz, J., Stemmann, O., Rank, S., Lechner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+protein+complex+consisting+of+Ctf19,+Mcm21,+and+Okp1+represents+a+missing+link+in+the+budding+yeast+kinetochore.">A putative protein complex consisting of Ctf19, Mcm21, and Okp1 represents a missing link in the budding yeast kinetochore.</a> Genes and Development. 13 (9), 1140-1155 (1999).</li><li>Hyland, K. M., Kingsbury, J., Koshland, D., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ctf19p:+A+novel+kinetochore+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae+and+a+potential+link+between+the+kinetochore+and+mitotic+spindle.">Ctf19p: A novel kinetochore protein in Saccharomyces cerevisiae and a potential link between the kinetochore and mitotic spindle.</a> Journal of Cell Biology. 145 (1), 15-28 (1999).</li><li>Fernius, J., Marston, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+cohesion+at+the+pericentromere+by+the+Ctf19+kinetochore+subcomplex+and+the+replication+fork-associated+factor,+Csm3.">Establishment of cohesion at the pericentromere by the Ctf19 kinetochore subcomplex and the replication fork-associated factor, Csm3.</a> PLoS Genetics. 5 (9), 1000629 (2009).</li><li>Meyer, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ipl1/Aurora-B+is+necessary+for+kinetochore+restructuring+in+meiosis+I+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Ipl1/Aurora-B is necessary for kinetochore restructuring in meiosis I in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (17), 2986-3000 (2015).</li><li>Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+sporulation+conditions+for+different+Saccharomyces+cerevisiae+strain+backgrounds.">Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds.</a> Methods in Molecular Biology. 557, 21-26 (2009).</li><li>Deutschbauer, A. M., Davis, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+trait+loci+mapped+to+single-nucleotide+resolution+in+yeast.">Quantitative trait loci mapped to single-nucleotide resolution in yeast.</a> Nature Genetics. 37 (12), 1333-1340 (2005).</li><li>Ben-Ari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+linked+genes+participate+in+controlling+sporulation+efficiency+in+budding+yeast.">Four linked genes participate in controlling sporulation efficiency in budding yeast.</a> PLoS Genetics. 2 (11), 195 (2006).</li><li>Primig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+core+meiotic+transcriptome+in+budding+yeasts.">The core meiotic transcriptome in budding yeasts.</a> Nature Genetics. 26 (4), 415-423 (2000).</li><li>Spencer, F., Gerring, S. L., Connelly, C., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+chromosome+transmission+fidelity+mutants+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Mitotic chromosome transmission fidelity mutants in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 124 (2), 237-249 (1990).</li><li>Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+source+dependent+promoters+in+yeasts.">Carbon source dependent promoters in yeasts.</a> Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).</li><li>Byers, B., Goetsch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+pachytene+arrest+of+Saccharomyces+cerevisiae+at+elevated+temperature.">Reversible pachytene arrest of Saccharomyces cerevisiae at elevated temperature.</a> Molecular and General Genetics. 187 (1), 47-53 (1982).</li><li>Winter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sum1/Ndt80+transcriptional+switch+and+commitment+to+meiosis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (1), 1-15 (2012).</li><li>Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporulation+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).</li><li>Robinett, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+al.+In+vivo+localization+of+DNA+sequences+and+visualization+of+large-scale+chromatin+organization+using+lac+operator/repressor+recognition.">C. al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition.</a> Journal of Cell Biology. 135, 1685-1700 (1996).</li><li>Straight, A. F., Belmont, A. S., Robinett, C. C., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP+tagging+of+budding+yeast+chromosomes+reveals+that+protein-protein+interactions+can+mediate+sister+chromatid+cohesion.">GFP tagging of budding yeast chromosomes reveals that protein-protein interactions can mediate sister chromatid cohesion.</a> Current Biology. 6 (12), 1599-1608 (1996).</li><li>Sym, M., Engebrecht, J. A., Roeder, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZIP1+is+a+synaptonemal+complex+protein+required+for+meiotic+chromosome+synapsis.">ZIP1 is a synaptonemal complex protein required for meiotic chromosome synapsis.</a> Cell. 72 (3), 365-378 (1993).</li><li>Scherthan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+mobility+during+meiotic+prophase+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Chromosome mobility during meiotic prophase in Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16934-16939 (2007).</li></ol>

Этот протокол сочетает в себе систему NDT80-in для синхронизации клеток, технику якоря для истощения белков из ядра и флуоресцентную покадровую микроскопию для изображения появляющихся дрожжевых клеток во время мейоза. Система NDT80-in - это метод синхронизации мейотического клето?...

Покадровая флуоресцентная микроскопия является ценным инструментом для изучения динамики сегрегации мейотических хромосом у почковыхдрожжей 1,2. Почкование дрожжевых клеток может быть индуцировано подвергаться мейозу путем голодания ключевых питательных веществ3. Во время мейоза клетки подвергаются одному раунду сегрегации хромосом с последующим двумя делениями для создания четырех мейотических продуктов, которые упакованы в споры (рисунок 1). Отдельные клетки могут быть визуализированы на каждой стадии мейоза, что генерирует пространственные и временные данные, которые могут быть легко пропущены с помощью визуализации фиксированных клеток. Этот протокол показывает, как сочетание покадровой флуоресцентной микроскопии с двумя ранее установленными методами, индуцируемой системой NDT80 (NDT80-in) и методом якоря, может быть использовано для изучения функции специфических белков на различных мейотических стадиях.
Система NDT80-in является мощным инструментом для синхронизации мейотического клеточного цикла, который опирается на индуцируемую экспрессию фактора транскрипции среднего мейоза NDT80 4,5. Выражение NDT80 требуется для профазы I выхода 6,7. В системе NDT80-in NDT80 находится под контролем промотора GAL1-10 в клетках, экспрессирующих фактор транскрипции Gal4, слитый с рецептором эстрогена (Gal4-ER)4,5. Поскольку Gal4-ER попадает в ядро только при связывании с β-эстрадиолом, клетки NDT80-in останавливаются в профазе I при отсутствии β-эстрадиола, что позволяет синхронизировать клетки в профазе I (рисунок 1). β-эстрадиола способствует транслокации фактора транскрипции Gal4-ER в ядро, где он связывает GAL1-10 для стимуляции экспрессии NDT80, что приводит к синхронному проникновению в мейотические деления. Хотя покадровая микроскопия может быть выполнена без синхронизации, преимуществом использования синхронизации является возможность добавления ингибитора или лекарственного средства, пока клетки находятся на определенной стадии мейоза.
Метод удаления якоря представляет собой индуцируемую систему, с помощью которой белок может быть истощен из ядра с добавлением рапамицина8. Этот метод идеально подходит для изучения ядерных белков во время деления клеток в почковых дрожжах, поскольку дрожжевые клетки подвергаются закрытому митозу и мейозу, при которых ядерная оболочка не разрушается. Кроме того, этот метод очень полезен для белков, которые имеют несколько функций на протяжении всего мейоза. В отличие от делеций, мутантных аллелей или мейотических нулевых аллелей, удаление белка-мишени из ядра на определенной стадии не ставит под угрозу активность целевого белка на более ранних стадиях, что позволяет более точно интерпретировать результаты. Система якоря использует перемещение рибосомных субъединиц между ядром и цитоплазмой, которое происходит при рибосомном созревании8. Чтобы истощить целевой белок из ядра, целевой белок помечается FKBP12-рапамицин-связывающим доменом (FRB) в штамме, в котором рибосомная субъединица Rpl13A помечена FKBP12. Без рапамицина FRB и FKBP12 не взаимодействуют, и помеченный FRB белок остается в ядре. При добавлении рапамицина рапамицин образует стабильный комплекс с FKBP12 и FRB, и комплекс выводится из ядра за счет взаимодействия с Rpl13A (рисунок 1). Чтобы предотвратить гибель клеток при добавлении рапамицина, клетки содержат мутацию tor1-1 гена TOR1. Кроме того, эти клетки содержат fpr1Δ, нулевой аллель белка S. cerevisiae FKBP12, который не позволяет эндогенному Fpr1 превзойти конкурирующий Rpl13A-FKBP12 для FRB и связывания рапамицина. Фоновые мутации, tor1-1 и fpr1Δ, не влияют на мейотические сроки или сегрегацию хромосом2.
Чтобы продемонстрировать полезность этого метода, кинетохорный белок Ctf19 был истощен в разные моменты времени на протяжении всего мейоза. Ctf19 является компонентом кинетохора, который не нужен при митозе, но необходим для правильной сегрегации хромосом при мейозе 9,10,11,12,13. При мейозе кинетохора выделяется в профазе I, а Ctf19 важен для повторной сборки кинетохора 9,14. Для этого протокола клетки с системой NDT80-in были синхронизированы, и метод удаления якоря был использован для истощения целевого белка Ctf19 из ядра до и после высвобождения из профазы I и после сегрегации хромосом мейоза I (рисунок 1). Этот протокол может быть адаптирован для истощения других белков, представляющих интерес на любой стадии мейоза и митоза.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-estradiol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E8875</td>
			<td>Make 1mM stocks in 95% EtOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 uM Threaded Bottle-top Filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2GPT02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% EtOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-032-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399500</td>
			<td>Dilute 1:10 to use as solvent for ConA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm x 50 mm coverslip No. 1.5</td>
			<td>VWR North American</td>
			<td>48393241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm x 75 mm microscope slides</td>
			<td>VWR North American</td>
			<td>48300-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine hemisulfate salt</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9126</td>
			<td>To supplement SC, SCA, and 1% Kac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavialin A</td>
			<td>Mllipore Sigma</td>
			<td>C2010</td>
			<td>Make as 1mg/mL in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSNAP HQ2 CCD camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>Used in Section 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids</td>
			<td>BD</td>
			<td>291920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2 inverted-objective micrscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Used in Section 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Download from https://fiji.sc/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Personal DeltaVision Microscope</td>
			<td>Applied Precision</td>
			<td></td>
			<td>Used in Section 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophan&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T0254</td>
			<td>To supplement SC, SCA, and 1% Kac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling Clay</td>
			<td>Crayola</td>
			<td>&#160;2302880000</td>
			<td>To secure coverslip in slide holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 5.30.04 Imaging Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Used in Section 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Fustion BT Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C15440-20UP</td>
			<td>Used in Section 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette tip holder</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>LTS1000-HR</td>
			<td>Cut a 4 square x 4 square section of the rack portion of this product.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottassium Acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapamycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP29631</td>
			<td>Make 1mg/mL stocks in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Sealant</td>
			<td>Aqueon</td>
			<td>100165001</td>
			<td>Also known as aquarium glue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SoftWorx7.0.0&#160; Imaging Software</td>
			<td>Applied Precision</td>
			<td></td>
			<td>Used in Section 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic Complete Mixture (Kaiser)&#160;</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DSCK2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type N immersion oil&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MXA22166</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of time-lapse microscopy and stage-specific nuclear depletion of proteins to study meiosis in s. cerevisiae

Покадровая флуоресцентная микроскопия произвела революцию в понимании событий мейотического клеточного цикла, предоставив временные и пространственные данные, которые часто не видны при визуализации фиксированных клеток. Почкование дрожжей оказалось важным модельным организмом для изучения сегрегации мейотических хромосом, потому что многие мейотические гены сильно сохраняются. Покадровая микроскопия мейоза у почковых дрожжей позволяет контролировать различные мейотические мутанты, чтобы показать, как мутация нарушает мейотические процессы. Тем не менее, многие белки функционируют в нескольких точках мейоза. Поэтому использование мутантов с потерей функции или мейотических нулевых мутантов может нарушить ранний процесс, блокируя или нарушая более поздний процесс и затрудняя определение фенотипов, связанных с каждой отдельной ролью. Чтобы обойти эту проблему, этот протокол описывает, как белки могут быть условно истощены из ядра на определенных стадиях мейоза при мониторинге мейотических событий с использованием покадровой микроскопии. В частности, этот протокол описывает, как клетки синхронизируются в профазе I, как метод удаления якоря используется для истощения белков из ядра на определенных мейотических стадиях и как покадровая визуализация используется для мониторинга сегрегации мейотических хромосом. В качестве примера полезности методики можно привести кинетохорный белок Ctf19 из ядра в разные моменты времени во время мейоза, а количество хроматиновых масс проанализировали в конце мейоза II. В целом, этот протокол может быть адаптирован для истощения различных ядерных белков из ядра при мониторинге мейотических делений.

Чтобы контролировать сегрегацию хроматина, гистоновый белок Htb2 был помечен mCherry. В профазе I хроматин появляется в виде одной массы Htb2. После сегрегации гомологичных хромосом в первом мейотическом делении хроматин появляется в виде двух различных масс (рисунок 3А). После...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae at JoVE.com

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Покадровая микроскопия является ценным инструментом для изучения мейоза у почковых дрожжей. Этот протокол описывает метод, который сочетает в себе синхронизацию клеточного цикла, покадровую микроскопию и условное истощение целевого белка, чтобы продемонстрировать, как изучать функцию конкретного белка во время сегрегации мейотических хромосом.

Использование покадровой микроскопии и стадийного ядерного истощения белков для изучения мейоза у S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...

Синхронизируя клетки в профазной и затем истощая белок-мишень на определенной стадии, этот метод может идентифицировать временно различные функции специфических белков. Условное истощение белков на определенных стадиях миоза предотвращает остаточные эффекты, которые традиционный миотический мутант может иметь на более поздних стадиях. Этот метод может быть использован для изучения начинающегося дрожжевого митоза и других организмов, которые не подвергаются разрушению ядерной оболочки.Кроме того, этот метод может быть использован в других организмах для изучения событий клеточного цикла до разрушения ядерной оболочки. Для начала сделайте агаровую прокладку, которая будет использоваться для создания монослоя клеток для визуализации. Отрежьте и выбросьте крышку и нижнюю треть 1,5-миллилитровой микроцентрифужной трубки, чтобы создать цилиндр, который будет служить формой для агаровой прокладки.Поместите цилиндр с вырезанной микроцентрифужной трубкой на чистую стеклянную горку с верхней частью трубки вверх ногами, сидя на слайде. Сделайте шесть миллилитров 5% раствора агара в 50-миллилитровом стакане. Отрежьте кончик пипетки, чтобы сделать более крупное отверстие, и пипетку примерно 500 микролитров расплавленного агара в микроцентрифужную трубку.Дайте ему постоять при комнатной температуре, пока агар не затвердеет. Чтобы подготовить дрожжевые клетки, открутите 200 микролитров культуры споруляции при 800 г в течение двух минут в одномиллилитрных микроцентрифужных трубках. Выбросьте 180 микролитров супернатанта.Повторно суспендируйте гранулу в оставшемся супернатанте, закручивая и щелкая трубкой. Пипетка шесть микролитров концентрированных ячеек на крышке скользит в середине камеры на месте с ConA. Удерживайте цилиндр с помощью агаровой прокладки и осторожно соскользните его со стеклянной горки.Убедитесь, что агар полностью плоский на дне и, используя нижнюю часть наконечника пипетки, приложите небольшое давление к форме микроцентрифуги, чтобы агаровая прокладка была немного вытолкнута над границей трубки. Затем переверните форму таким образом, чтобы агаровая прокладка была обращена вниз к камере. Используйте щипцы, чтобы аккуратно поместить агаровую прокладку поверх клеток, а кончик пипетки осторожно скользить подушечке агара вокруг камеры от 10 до 20 раз, чтобы создать монослой клеток на крышке.Держите агаровую прокладку в камере в течение 12-15 минут. Далее перекладывают два миллилитра культуры споруляции в две микроцентрифужные трубки и вращают при 15 700 г в течение двух минут. После переноса супернатанта в чистые микроцентрифужные трубки снова вращаются в том же состоянии и собирают супернатант в чистые микроцентрифужные трубки.Добавьте два миллилитра супернатанта по каплям в камеру, содержащую агаровую прокладку. Как только жидкость достигнет верхней части камеры, агаровая подушка, скорее всего, будет плавать. Аккуратно снимите подушечку агара щипцами и выбросьте.Поместите крышку размером 24 на 50 миллиметров в верхнюю часть камеры, чтобы предотвратить испарение во время визуализации. Чтобы настроить фильм на микроскопе, поместите крышку внутрь держателя слайда. Прикрепите формовочную глину к боковой части крышки, чтобы она была надежно закреплена в держателе слайда.Откройте программное обеспечение для получения изображений. Используйте грубые и тонкие ручки регулировки, чтобы сфокусировать ячейки с помощью DIC или яркого поля. В главном меню программного обеспечения для получения изображений нажмите «Файл», выберите «Получить», и появятся четыре окна.В окне с именем Resolve 3D нажмите на значок колбы Erlenmeyer. Откроется окно под названием Design Run Experiment, содержащее элементы управления для настройки эксперимента по настройке покадрового фильма. На вкладке Конструктор перейдите на вкладку Секционирование.Установите флажок рядом с пунктом Z-секционирование и установите расстояние между оптическими секциями в один микрометр, а число оптических секций — в пять. Далее под вкладкой Каналы нажмите на значок плюса и выберите соответствующий канал. Затем установите флажок Рядом с эталонным изображением и установите положение Z в середину образца в раскрывающемся меню.Выберите значение коэффициента пропускания и времени экспозиции в раскрывающемся меню. На вкладке Покадровая съемка установите флажок Замедленная съемка и введите значения для минут и часов, чтобы определить временной интервал получения изображения. Установите флажок Поддерживать фокус с конечным фокусом, чтобы предотвратить дрейф сцены во время фильма.А на вкладке Точки установите флажок Рядом со Списком точек посещения. В главном меню нажмите Вид и выберите Список точек. Переместите сцену в область камеры, которая показывает монослой клеток.Нажмите «Пометить точку» в окне «Список точек». Переместите рабочую область, чтобы выбрать от 25 до 30 точек без какого-либо перекрытия, чтобы избежать переэкспонирования ячеек и изображения каждого поля во время каждого временного курса. В окне Список точек выберите Откалибровать все, чтобы задать конечную направленность для каждой точки.На вкладке Выполнить сохраните файл в соответствующем месте назначения на компьютере. В окне Запуск эксперимента нажмите кнопку Воспроизвести, чтобы запустить фильм. Откройте программное обеспечение Fiji.Откройте каналы DIC и mCherry. Получите одну проекцию максимальной интенсивности канала mCherry, щелкнув Изображение, а затем Стеки и Z Project и выберите Максимальная интенсивность в раскрывающемся меню. Чтобы объединить каналы DIC и mCherry в одном изображении, нажмите «Изображение», «Цвет» и выберите «Объединить каналы».Следуйте за одной клеткой через мейоз. После завершения мейоза II регистрируют количество масс ДНК. В клетках дикого типа с фоном якоря обычно есть четыре массы ДНК в конце мейоза II, представляющие четыре продукта мейоза.В небольшой части клеток видны только три массы после мейоза II.Когда Ctf19-FRB закрепляется во время высвобождения профазы I, примерно 47% клеток проявляют более четырех масс ДНК по завершении мейоза, что свидетельствует о дефекте прикрепления кинетохоров и микротрубочек. При закреплении Ctf19-FRB, либо после сборки кинетохора, но до мейоза I, либо после мейоза II, примерно 16% клеток демонстрируют дополнительные массы ДНК. Одной из наиболее важных частей этого протокола является добавление супернатанта по каплям в вашу камеру, чтобы избежать нарушения вашего монослоя.Кроме того, обратите внимание на время, необходимое для подготовки к визуализации, чтобы учесть ее в анализе. Изменяя флуоресцентно упакованные белки, эта процедура может быть использована для ответа на вопросы, касающиеся продолжительности клеточного цикла, сегрегации хромосом, обилия белка и локализации белка.

use-time-lapse-microscopy-stage-specific-nuclear-depletion-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, biofilms can reduce industrial productivity, destroy structures, and threaten human life. 1-3 On the other hand, harnessing the power of biofilms can help clean the environment and generate sustainable energy. 4-8
The ability of S. cerevisiae to colonize surfaces and participate in complex biofilms was mostly ignored until the rediscovery of the differentiation programs triggered by various signaling pathways and environmental cues in this organism. 9, 10 The continuing interest in using S. cerevisiae as a model organism to understand the interaction and convergence of signaling pathways, such as the Ras-PKA, Kss1 MAPK, and Hog1 osmolarity pathways, quickly placed S. cerevisiae in the junction of biofilm biology and signal transduction research. 11-20 To this end, differentiation of yeast cells into long, adhesive, pseudohyphal filaments became a convenient readout for the activation of signal transduction pathways upon various environmental changes. However, filamentation is a complex collection of phenotypes, which makes assaying for it as if it were a simple phenotype misleading. In the past decade, several assays were successfully adopted from bacterial biofilm studies to yeast research, such as MAT formation assays to measure colony spread on soft agar and crystal violet staining to quantitatively measure cell-surface adherence. 12, 21 However, there has been some confusion in assays developed to qualitatively assess the adhesive and invasive phenotypes of yeast in agar.
Here, we present a simple and reliable method for assessing the adhesive and invasive quality of yeast strains with easy-to-understand steps to isolate the adhesion assessment from invasion assessment. Our method, adopted from previous studies, 10, 16 involves growing cells in liquid media and plating on differential nutrient conditions for growth of large spots, which we then wash with water to assess adhesion and rub cells completely off the agar surface to assess invasion into the agar. We eliminate the need for streaking cells onto agar, which affects the invasion of cells into the agar. In general, we observed that haploid strains that invade agar are always adhesive, yet not all adhesive strains can invade agar medium. Our approach can be used in conjunction with other assays to carefully dissect the differentiation steps and requirements of yeast signal transduction, differentiation, quorum sensing, and biofilm formation.

We describe a qualitative assay for yeast adhesion and agar invasion as a measure of invasive and pseudohyphal differentiation. This simple assay can be used to assess the invasive phenotype of various mutants as well as the effects environmental cues and signaling pathways on yeast differentiation.

Анализ для адгезии и агар Вторжение в CEREVISIAE С.

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Мониторинг актина Разборка с покадровой микроскопии

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Двухфотонное axotomy и покадровой конфокальной микроскопии в живых эмбрионов данио рерио

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

Высокой пропускной метод глобально исследования морфологии органелл в CEREVISIAE С.

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

Идентификация белковых комплексов с количественной протеомики в CEREVISIAE С.

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Покадровый Визуализация Митоз После трансфекции миРНК

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Покадровый Микроскопия раннего эмбриогенеза в Caenorhabditis Элеганс

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

Количественный анализ случайных миграции клеток помощью замедленной видео микроскопии

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes result from the fusion of haploid cells of distinct mating type (MATa, MATalpha) and give rise to corresponding stable diploids that successively generate as many as 20 diploid progeny as a result of their strikingly asymmetric mitotic divisions 2. Zygote formation is orchestrated by a complex sequence of events: In this process, soluble mating factors bind to cognate receptors, triggering receptor-mediated signaling cascades that facilitate interruption of the cell cycle and culminate in cell-cell fusion. Zygotes may be considered a model for progenitor or stem cell function.
Although much has been learned about the formation of zygotes and although zygotes have been used to investigate cell-molecular questions of general significance, almost all studies have made use of mating mixtures in which zygotes are intermixed with a majority population of haploid cells 3-8. Many aspects of the biochemistry of zygote formation and the continuing life of the zygote therefore remain uninvestigated.
Reports of purification of yeast zygotes describe protocols based on their sedimentation properties 9; however, this sedimentation-based procedure did not yield nearly 90% purity in our hands. Moreover, it has the disadvantage that cells are exposed to hypertonic sorbitol. We therefore have developed a versatile purification procedure. For this purpose, pairs of haploid cells expressing red or green fluorescent proteins were co-incubated to allow zygote formation, harvested at various times, and the resulting zygotes were purified using a flow cytometry-based sorting protocol. This technique provides a convenient visual assessment of purity and maturation. The average purity of the fraction is approximately 90%. According to the timing of harvest, zygotes of varying degrees of maturity can be recovered. The purified samples provide a convenient point of departure for "-omic" studies, for recovery of initial progeny, and for systematic investigation of this progenitor cell.

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

To purify zygotes of S. cerevisiae, haploid cells of opposite mating type were engineered to express red or green fluorescent proteins, co-incubated to allow zygote formation, and fractionated using a flow cytometry-based protocol. The highly-enriched fraction enables subsequent "-omic" studies, recovery of initial progeny, and systematic investigation of zygote morphogenesis.

Проточной цитометрии на основе очистки<em&gt; S. CEREVISIAE</em&gt; Зиготы

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

Использование времени Lapse микроскопии для визуализации Anoxia вызванных Подвесные анимации в<em&gt; C. Элеганс</em&gt; Эмбрионы

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...