Name: use of time-lapse microscopy and stage-specific nuclear depletion of proteins to study meiosis in s. cerevisiae
Uploaded: 2022-10-11T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae at JoVE.com

Indiana Üniversitesi Işık Mikroskobu Görüntüleme Merkezi'ne teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (GM105755) bir hibe ile desteklenmiştir.

1. Gerekli malzemelerin hazırlanması
<ol><li>Maya hücrelerinin büyümesi ve sporülasyonu için reaktifler hazırlayın. NOT: Tomurcuklanan maya suşları ade2 - ve trp1- ise, 1.1.1-1.1.3 adımlarındaki tüm ortamları, %1 stoklardan %0,01 adenin ve %0,01 triptofan nihai konsantrasyonu ile tamamlayın. Ortamları otoklav ile sterilize ediyorsanız, bu amino asitleri ancak reaktifler otoklavlandıktan ve oda sıcaklığına soğumaya bırakıldıktan sonra ekleyin.<ol><li>Vejet...

<ol>
	<li>Tsuchiya, D., Gonzalez, C., Lacefield, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+checkpoint+protein+Mad2+regulates+APC/C+activity+during+prometaphase+and+metaphase+of+meiosis+I+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The spindle checkpoint protein Mad2 regulates APC/C activity during prometaphase and metaphase of meiosis I in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (16), 2848-2861 (2011).</li><li>Cairo, G., MacKenzie, A. M., Lacefield, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+requirement+for+Bub1+and+Bub3+in+regulation+of+meiotic+versus+mitotic+chromosome+segregation.">Differential requirement for Bub1 and Bub3 in regulation of meiotic versus mitotic chromosome segregation.</a> Journal of Cell Biology. 219 (4), 201909136 (2020).</li><li>van Werven, F. J., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+entry+into+gametogenesis.">Regulation of entry into gametogenesis.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 366 (1584), 3521-3531 (2011).</li><li>Carlile, T. M., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+I+is+established+through+division-specific+translational+control+of+a+cyclin.">Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin.</a> Cell. 133 (2), 280-291 (2008).</li><li>Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+landmark+events+in+meiosis+by+the+CDK+Cdc28+and+the+meiosis-specific+kinase+Ime2.">Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2.</a> Genes and Development. 17 (12), 1524-1539 (2003).</li><li>Xu, L., Ajimura, M., Padmore, R., Klein, C., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NDT80,+a+meiosis-specific+gene+required+for+exit+from+pachytene+in+Saccharomyces+cerevisiae.">NDT80, a meiosis-specific gene required for exit from pachytene in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6572-6581 (1995).</li><li>Chu, S., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gametogenesis+in+yeast+is+regulated+by+a+transcriptional+cascade+dependent+on+Ndt80.">Gametogenesis in yeast is regulated by a transcriptional cascade dependent on Ndt80.</a> Molecular Cell. 1 (5), 685-696 (1998).</li><li>Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anchor-away+technique:+rapid,+conditional+establishment+of+yeast+mutant+phenotypes.">The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes.</a> Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).</li><li>Borek, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteomic+landscape+of+centromeric+chromatin+reveals+an+essential+role+for+the+Ctf19(CCAN)+complex+in+meiotic+kinetochore+assembly.">The proteomic landscape of centromeric chromatin reveals an essential role for the Ctf19(CCAN) complex in meiotic kinetochore assembly.</a> Current Biology. 31 (2), 283-296 (2021).</li><li>Mehta, G. D., Agarwal, M., Ghosh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+kinetochore+protein,+Ctf19+in+meiosis+I:+an+implication+of+differential+impact+of+Ctf19+on+the+assembly+of+mitotic+and+meiotic+kinetochores+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Functional characterization of kinetochore protein, Ctf19 in meiosis I: an implication of differential impact of Ctf19 on the assembly of mitotic and meiotic kinetochores in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Microbiology. 91 (6), 1179-1199 (2014).</li><li>Ortiz, J., Stemmann, O., Rank, S., Lechner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+protein+complex+consisting+of+Ctf19,+Mcm21,+and+Okp1+represents+a+missing+link+in+the+budding+yeast+kinetochore.">A putative protein complex consisting of Ctf19, Mcm21, and Okp1 represents a missing link in the budding yeast kinetochore.</a> Genes and Development. 13 (9), 1140-1155 (1999).</li><li>Hyland, K. M., Kingsbury, J., Koshland, D., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ctf19p:+A+novel+kinetochore+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae+and+a+potential+link+between+the+kinetochore+and+mitotic+spindle.">Ctf19p: A novel kinetochore protein in Saccharomyces cerevisiae and a potential link between the kinetochore and mitotic spindle.</a> Journal of Cell Biology. 145 (1), 15-28 (1999).</li><li>Fernius, J., Marston, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+cohesion+at+the+pericentromere+by+the+Ctf19+kinetochore+subcomplex+and+the+replication+fork-associated+factor,+Csm3.">Establishment of cohesion at the pericentromere by the Ctf19 kinetochore subcomplex and the replication fork-associated factor, Csm3.</a> PLoS Genetics. 5 (9), 1000629 (2009).</li><li>Meyer, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ipl1/Aurora-B+is+necessary+for+kinetochore+restructuring+in+meiosis+I+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Ipl1/Aurora-B is necessary for kinetochore restructuring in meiosis I in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (17), 2986-3000 (2015).</li><li>Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+sporulation+conditions+for+different+Saccharomyces+cerevisiae+strain+backgrounds.">Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds.</a> Methods in Molecular Biology. 557, 21-26 (2009).</li><li>Deutschbauer, A. M., Davis, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+trait+loci+mapped+to+single-nucleotide+resolution+in+yeast.">Quantitative trait loci mapped to single-nucleotide resolution in yeast.</a> Nature Genetics. 37 (12), 1333-1340 (2005).</li><li>Ben-Ari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+linked+genes+participate+in+controlling+sporulation+efficiency+in+budding+yeast.">Four linked genes participate in controlling sporulation efficiency in budding yeast.</a> PLoS Genetics. 2 (11), 195 (2006).</li><li>Primig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+core+meiotic+transcriptome+in+budding+yeasts.">The core meiotic transcriptome in budding yeasts.</a> Nature Genetics. 26 (4), 415-423 (2000).</li><li>Spencer, F., Gerring, S. L., Connelly, C., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+chromosome+transmission+fidelity+mutants+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Mitotic chromosome transmission fidelity mutants in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 124 (2), 237-249 (1990).</li><li>Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+source+dependent+promoters+in+yeasts.">Carbon source dependent promoters in yeasts.</a> Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).</li><li>Byers, B., Goetsch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+pachytene+arrest+of+Saccharomyces+cerevisiae+at+elevated+temperature.">Reversible pachytene arrest of Saccharomyces cerevisiae at elevated temperature.</a> Molecular and General Genetics. 187 (1), 47-53 (1982).</li><li>Winter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sum1/Ndt80+transcriptional+switch+and+commitment+to+meiosis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (1), 1-15 (2012).</li><li>Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporulation+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).</li><li>Robinett, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+al.+In+vivo+localization+of+DNA+sequences+and+visualization+of+large-scale+chromatin+organization+using+lac+operator/repressor+recognition.">C. al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition.</a> Journal of Cell Biology. 135, 1685-1700 (1996).</li><li>Straight, A. F., Belmont, A. S., Robinett, C. C., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP+tagging+of+budding+yeast+chromosomes+reveals+that+protein-protein+interactions+can+mediate+sister+chromatid+cohesion.">GFP tagging of budding yeast chromosomes reveals that protein-protein interactions can mediate sister chromatid cohesion.</a> Current Biology. 6 (12), 1599-1608 (1996).</li><li>Sym, M., Engebrecht, J. A., Roeder, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZIP1+is+a+synaptonemal+complex+protein+required+for+meiotic+chromosome+synapsis.">ZIP1 is a synaptonemal complex protein required for meiotic chromosome synapsis.</a> Cell. 72 (3), 365-378 (1993).</li><li>Scherthan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+mobility+during+meiotic+prophase+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Chromosome mobility during meiotic prophase in Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16934-16939 (2007).</li></ol>

Bu protokol, hücreleri senkronize etmek için NDT80-in sistemini, çekirdekten proteinleri tüketmek için çapa uzaklaştırma tekniğini ve mayoz sırasında tomurcuklanan maya hücrelerini görüntülemek için floresan hızlandırılmış mikroskopiyi birleştirir. NDT80-in sistemi, bir faz I tutuklaması ve 4,8'i serbest bırakan mayotik hücre döngüsü senkronizasyonu için bir yöntemdir. Her ne kadar bireysel hücreler sonraki mayotik...

Hızlandırılmış floresan mikroskobu, tomurcuklanan maya 1,2'deki mayotik kromozom ayrışmasının dinamiklerini incelemek için değerli bir araçtır. Tomurcuklanan maya hücreleri, temel besin maddelerinin açlığı yoluyla mayoza uğramaya teşvik edilebilir3. Mayoz sırasında, hücreler bir tur kromozom ayrışmasına ve ardından sporlara paketlenmiş dört mayotik ürün oluşturmak için iki bölüme ayrılır (Şekil 1). Bireysel hücreler, mayozun her aşamasında görselleştirilebilir, bu da sabit hücreli görüntüleme ile kolayca kaçırılabilecek uzamsal ve zamansal veriler üretir. Bu protokol, hızlandırılmış floresan mikroskopisinin daha önce kurulmuş iki yöntemle, indüklenebilir NDT80 sistemi (NDT80-in) ve çapa uzaklaştırma tekniği ile birleştirilmesinin farklı mayotik aşamalardaki spesifik proteinlerin işlevini incelemek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.
NDT80-in sistemi, orta mayoz transkripsiyon faktörü NDT80 4,5'in indüklenebilir ekspresyonuna dayanan mayotik hücre döngüsü senkronizasyonu için güçlü bir araçtır. NDT80 ifadesi faz I çıkış 6,7 için gereklidir. NDT80-in sistemi ile NDT80, bir östrojen reseptörüne (Gal4-ER) kaynaşmış Gal4 transkripsiyon faktörünü eksprese eden hücrelerde GAL1-10 promotörünün kontrolü altındadır4,5. Gal4-ER çekirdeğe sadece β-östradiol'e bağlandığında girdiğinden, NDT80-in hücreleri β-östradiol yokluğunda faz I'de durur ve bu da faz I'deki hücrelerin senkronizasyonuna izin verir (Şekil 1). β-östradiol ilavesi, Gal4-ER transkripsiyon faktörünün çekirdeğe translokasyonunu teşvik eder, burada NDT80'in ekspresyonunu sürmek için GAL1-10'u bağlar ve mayotik bölünmelere senkron girişe yol açar. Hızlandırılmış mikroskopi senkronizasyon olmadan yapılabilmesine rağmen, senkronizasyon kullanmanın avantajı, hücreler mayozun belirli bir aşamasındayken bir inhibitör veya ilaç ekleme yeteneğidir.
Çapa atma tekniği, rapamisin8 ilavesiyle bir proteinin çekirdekten tükenebileceği indüklenebilir bir sistemdir. Bu teknik, tomurcuklanan mayadaki hücre bölünmesi sırasında nükleer proteinleri incelemek için idealdir, çünkü maya hücreleri, nükleer zarfın parçalanmadığı kapalı mitoz ve mayoza uğrar. Ayrıca, bu teknik mayozda birden fazla işlevi olan proteinler için çok yararlıdır. Delesyonlardan, mutant alellerden veya mayotik null alellerin aksine, bir hedef proteinin belirli bir aşamada çekirdekten uzaklaştırılması, daha erken aşamalarda hedef protein aktivitesinden ödün vermez ve sonuçların daha doğru bir şekilde yorumlanmasına izin verir. Ankraj uzaklaştırma sistemi, ribozomal olgunlaşma üzerine ortaya çıkan çekirdek ve sitoplazma arasındaki ribozomal alt birimlerin titremesini kullanır8. Hedef proteini çekirdekten tüketmek için, hedef protein, ribozomal alt birim Rpl13A'nın FKBP12 ile etiketlendiği bir suşta FKBP12-rapamisin bağlayıcı etki alanı (FRB) ile etiketlenir. Rapamisin olmadan, FRB ve FKBP12 etkileşime girmez ve FRB etiketli protein çekirdekte kalır. Rapamisin ilavesi üzerine, rapamisin FKBP12 ve FRB ile kararlı bir kompleks oluşturur ve kompleks Rpl13A ile etkileşim nedeniyle çekirdekten dışarı atılır (Şekil 1). Rapatisin ilavesi üzerine hücre ölümünü önlemek için, hücreler TOR1 geninin tor1-1 mutasyonunu barındırır. Ek olarak, bu hücreler, endojen Fpr1'in FRB ve rapamisin bağlanması için Rpl13A-FKBP12'nin rekabet etmesini önleyen S. cerevisiae FKBP12 proteininin boş bir aleli olan fpr1Δ'yu içerir. Arka plan mutasyonlarını (tor1-1 ve fpr1Δ) uzaklaştırmak, mayotik zamanlamaları veya kromozom ayrışması2'yi etkilemez.
Bu tekniğin yararlılığını göstermek için, kinetochore proteini Ctf19, mayozda farklı zaman noktalarında tükenmiştir. Ctf19, mitozda dağıtılabilen ancak mayoz9,10,11,12,13'te uygun kromozom ayrışması için gerekli olan kinetochore'un bir bileşenidir. Mayozda, kinetochore faz I'de dökülür ve Ctf19, kinetochore yeniden montajı 9,14 için önemlidir. Bu protokol için, NDT80-in sistemine sahip hücreler senkronize edildi ve çapa uzaklaştırma tekniği, faz I'den salınmadan önce ve sonra ve mayoz I kromozom ayrışmasından sonra çekirdekten hedef protein Ctf19'u tüketmek için kullanıldı (Şekil 1). Bu protokol, mayoz ve mitozun herhangi bir aşamasında ilgilenilen diğer proteinleri tüketmek için uyarlanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-estradiol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E8875</td>
			<td>Make 1mM stocks in 95% EtOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 uM Threaded Bottle-top Filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2GPT02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% EtOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-032-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399500</td>
			<td>Dilute 1:10 to use as solvent for ConA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm x 50 mm coverslip No. 1.5</td>
			<td>VWR North American</td>
			<td>48393241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm x 75 mm microscope slides</td>
			<td>VWR North American</td>
			<td>48300-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine hemisulfate salt</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9126</td>
			<td>To supplement SC, SCA, and 1% Kac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavialin A</td>
			<td>Mllipore Sigma</td>
			<td>C2010</td>
			<td>Make as 1mg/mL in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSNAP HQ2 CCD camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>Used in Section 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids</td>
			<td>BD</td>
			<td>291920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2 inverted-objective micrscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Used in Section 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Download from https://fiji.sc/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Personal DeltaVision Microscope</td>
			<td>Applied Precision</td>
			<td></td>
			<td>Used in Section 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophan&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T0254</td>
			<td>To supplement SC, SCA, and 1% Kac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling Clay</td>
			<td>Crayola</td>
			<td>&#160;2302880000</td>
			<td>To secure coverslip in slide holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 5.30.04 Imaging Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Used in Section 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Fustion BT Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C15440-20UP</td>
			<td>Used in Section 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette tip holder</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>LTS1000-HR</td>
			<td>Cut a 4 square x 4 square section of the rack portion of this product.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottassium Acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapamycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP29631</td>
			<td>Make 1mg/mL stocks in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Sealant</td>
			<td>Aqueon</td>
			<td>100165001</td>
			<td>Also known as aquarium glue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SoftWorx7.0.0&#160; Imaging Software</td>
			<td>Applied Precision</td>
			<td></td>
			<td>Used in Section 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic Complete Mixture (Kaiser)&#160;</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DSCK2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type N immersion oil&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MXA22166</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of time-lapse microscopy and stage-specific nuclear depletion of proteins to study meiosis in s. cerevisiae

Hızlandırılmış floresan mikroskopi, genellikle sabit hücreleri görüntüleyerek görülmeyen zamansal ve mekansal veriler sağlayarak mayotik hücre döngüsü olaylarının anlaşılmasında devrim yaratmıştır. Tomurcuklanan maya, mayotik kromozom ayrışmasını incelemek için önemli bir model organizma olduğunu kanıtlamıştır, çünkü birçok mayotik gen oldukça korunmuştur. Tomurcuklanan mayadaki mayozun hızlandırılmış mikroskopisi, mutasyonun mayotik süreçleri nasıl bozduğunu göstermek için farklı mayotik mutantların izlenmesine izin verir. Bununla birlikte, birçok protein mayozda birden fazla noktada işlev görür. Bu nedenle, fonksiyon kaybı veya mayotik null mutantların kullanımı, erken bir süreci bozabilir, daha sonraki süreci bloke edebilir veya rahatsız edebilir ve her bir bireysel rolle ilişkili fenotipleri belirlemeyi zorlaştırabilir. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, bu protokol, proteinlerin mayozun belirli aşamalarında çekirdekten şartlı olarak nasıl tükenebileceğini açıklarken, hızlandırılmış mikroskopi kullanarak mayotik olayları izler. Spesifik olarak, bu protokol, hücrelerin faz I'de nasıl senkronize edildiğini, çapa atma tekniğinin belirli mayotik aşamalarda çekirdekten proteinleri tüketmek için nasıl kullanıldığını ve mayotik kromozom ayrışmasını izlemek için hızlandırılmış görüntülemenin nasıl kullanıldığını açıklar. Tekniğin yararlılığına bir örnek olarak, kinetochore proteini Ctf19, mayozis sırasında farklı zaman noktalarında çekirdekten tükenmiş ve mayoz II'nin sonunda kromatin kütlelerinin sayısı analiz edilmiştir. Genel olarak, bu protokol mayotik bölünmeleri izlerken çekirdekten farklı nükleer proteinleri tüketmek için uyarlanabilir.

Kromatin ayrışmasını izlemek için, histon proteini Htb2 mCherry ile etiketlendi. Faz I'de, kromatin tek bir Htb2 kütlesi olarak görünür. Homolog kromozomlar ilk mayotik bölünmede ayrıldıktan sonra, kromatin iki ayrı kütle olarak ortaya çıkar (Şekil 3A). Kardeş kromatitler ayrıldıktan sonra, kromatin dört kütle olarak görünür. Bazı kromozomlar iğ mikrotübüllerine tutunamazsa, mayoz I veya mayoz II'den sonra ek kitleler görülebilir.
Y...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae at JoVE.com

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Hızlandırılmış mikroskopi, tomurcuklanan mayadaki mayozu incelemek için değerli bir araçtır. Bu protokol, mayotik kromozom ayrışması sırasında belirli bir proteinin işlevinin nasıl çalışılacağını göstermek için hücre döngüsü senkronizasyonunu, hızlandırılmış mikroskopiyi ve bir hedef proteinin koşullu tükenmesini birleştiren bir yöntemi açıklar.

S. cerevisiae'de Mayozu İncelemek için Hızlandırılmış Mikroskopi ve Proteinlerin Aşamaya Özgü Nükleer Tükenmesinin Kullanılması

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...

Profaz birdeki hücreleri senkronize ederek ve daha sonra hedef proteini belirli bir aşamada tüketerek, bu yöntem spesifik proteinlerin geçici olarak farklı işlevlerini tanımlayabilir. Miyozun belirli aşamalarında proteinleri şartlı olarak tüketmek, geleneksel bir miyotik mutantın daha sonraki aşamalarda sahip olabileceği artık etkileri önler. Bu yöntem, tomurcuklanan maya mitozunu ve nükleer zarf parçalanmasına maruz kalmayan diğer organizmaları incelemek için kullanılabilir.Ek olarak, bu yöntem nükleer zarf parçalanmasından önce hücre döngüsü olaylarını incelemek için diğer organizmalarda kullanılabilir. Başlamak için, görüntüleme için tek katmanlı bir hücre oluşturmak için kullanılacak bir agar pedi yapın. Agar pedi için bir kalıp görevi görecek bir silindir oluşturmak için 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünün kapağını ve tabanını kesin ve alttan atın.Kesilen mikrosantrifüj tüp silindirini, tüpün üst kısmı baş aşağı olacak şekilde temiz bir cam sürgü üzerine yerleştirin ve kızağın üzerine oturtun. 50 mililitrelik bir beherde altı mililitre% 5'lik bir agar çözeltisi yapın. Daha büyük bir açıklık yapmak için pipetin ucunu kesin ve mikrosantrifüj tüpüne yaklaşık 500 mikrolitre erimiş agar pipetin.Agar katılaşana kadar oda sıcaklığında bekletin. Maya hücrelerini hazırlamak için, bir mililitrelik mikrosantrifüj tüplerinde iki dakika boyunca 800 G'de sporülasyon kültürünün 200 mikrolitresini döndürün. Süpernatanın 180 mikrolitresini atın.Pelet, tüpü döndürerek ve hafifçe vurarak kalan süpernatantta yeniden askıya alın. Konsantre hücrelerin altı mikrolitresini kapağın üzerine pipet, ConA ile yerinde haznenin ortasında kayar. Silindiri agar pedi ile tutun ve dikkatlice cam slayttan kaydırın.Agarın altta tamamen düz olduğundan ve pipet ucunun tabanını kullandığından emin olun, mikrosantrifüj kalıbına hafif miktarda basınç uygulayın, böylece agar pedi tüpün sınırının biraz üzerine itilir. Daha sonra, kalıbı, agar pedi odaya doğru bakacak şekilde ters çevirin. Agar pedini hücrelerin üzerine nazikçe yerleştirmek için forseps kullanın ve pipet ucunu kullanarak agar pedini odanın etrafında 10 ila 20 kez yavaşça kaydırarak kapak kayması üzerinde tek katmanlı bir hücre tabakası oluşturun.Agar pedini odada 12 ila 15 dakika tutun. Daha sonra, iki mililitre sporülasyon kültürünü iki mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve iki dakika boyunca 15.700 G'de döndürün. Süpernatantı temiz mikrosantrifüj tüplerine aktardıktan sonra, aynı durumda tekrar döndürün ve mikrosantrifüj tüplerini temizlemek için süpernatantı toplayın.Agar pedini içeren odaya iki mililitre süpernatant damla damla ekleyin. Sıvı odanın tepesine ulaştığında, agar pedi büyük olasılıkla yüzecektir. Agar pedini forseps ile nazikçe çıkarın ve atın.Görüntüleme sırasında buharlaşmayı önlemek için odanın üstüne 24 x 50 milimetrelik bir kapak kayması yerleştirin. Filmi mikroskopta ayarlamak için, kapak kaymasını slayt tutucunun içine takın. Kalıplama kilini, sürgü tutucuda güvende tutmak için kapak kaymasının yan tarafına yapıştırın.Görüntü alma yazılımını açın. DIC veya parlak alan kullanarak hücreleri odaklamak için kaba ve ince ayar düğmeleri kullanın. Görüntü alma yazılımının ana menüsünde, Dosya'ya tıklayın, Al'ı seçin ve dört pencere açılacaktır.Resolve 3D adlı pencerede, Erlenmeyer şişesi simgesine tıklayın. Bu, hızlandırılmış bir film ayarlamak için deneme oluşturmaya yönelik denetimleri içeren Tasarım Çalıştırma Denemesi başlıklı bir pencere açar. Tasarım sekmesinin altında, Bölümleme etiketli sekmeye gidin.Z kesitinin yanındaki kutuyu seçin ve optik bölüm aralığını bir mikrometreye, optik bölüm sayısını ise beş olarak ayarlayın. Ardından, Kanallar sekmesinin altında, artı simgesine tıklayın ve uygun kanalı seçin. Ardından, Referans Görüntü'nün yanındaki kutuyu seçin ve açılır menüden Z konumunu numunenin ortasına ayarlayın.Açılır menüden bir geçirgenlik ve pozlama süresi değeri seçin. Hızlandırılmış çekim sekmesinin altında, Zaman atlaması'nın yanındaki kutuyu seçin ve görüntü alma zaman aralığını tanımlamak için dakika ve saat değerlerini girin. Film sırasında sahne alanının kaymasını önlemek için Odağı Ultimate Focus ile Koru'nun yanındaki kutuyu seçin.Ve Noktalar sekmesinin altında, Ziyaret Noktası Listesi'nin yanındaki kutuyu seçin. Ana menüde, Görünüm'e tıklayın ve Nokta Listesi'ni seçin. Sahne alanını, odanın tek katmanlı bir hücre gösteren bir alanına taşıyın.Nokta Listesi penceresinde Noktayı İşaretle'ye tıklayın. Hücreleri aşırı pozlamayı önlemek ve her zaman kursu sırasında her alanı görüntülemek için herhangi bir çakışma olmadan 25 ila 30 nokta seçmek için sahne alanını hareket ettirin. Nokta Listesi penceresinde, her nokta için nihai odağı ayarlamak üzere Tümünü Kalibre Et'i seçin.Çalıştır sekmesi altında, dosyayı bilgisayardaki uygun hedefe kaydedin. Denemeyi Çalıştır penceresinde, filmi başlatmak için Oynat düğmesini seçin. Fiji yazılımını açın.DIC ve mCherry kanallarını açın. Görüntü'ye, ardından Yığınlar ve Z Projesi'ne tıklayarak mCherry kanalının tek bir maksimum yoğunluk projeksiyonunu elde edin ve açılır menüden Maksimum Yoğunluk'u seçin. DIC ve mCherry kanallarını tek bir görüntüde birleştirmek için Resim, Renk'e tıklayın ve Kanalları Birleştir'i seçin.Mayoz yoluyla tek bir hücreyi takip edin. Mayoz II tamamlandıktan sonra, DNA kütlelerinin sayısını kaydedin. Çapa uzakta arka plana sahip vahşi tip hücrelerde, mayozun dört ürününü temsil eden mayoz II'nin sonunda tipik olarak dört DNA kütlesi vardır.Hücrelerin küçük bir kısmında, mayoz II'den sonra sadece üç kütle görülebilir.Ctf19-FRB, faz I'in serbest bırakılması sırasında demirlendiğinde, hücrelerin yaklaşık% 47'si mayozun tamamlanmasından sonra dörtten fazla DNA kütlesi gösterir, bu da kinetochores ve mikrotübüllerin bağlanmasında bir kusur olduğunu düşündürür. Ctf19-FRB'nin demirlenmesiyle, kinetochore montajından sonra, ancak mayoz I'den önce veya mayoz II'den sonra, hücrelerin yaklaşık% 16'sı ek DNA kütleleri gösterir. Bu protokolün en önemli parçalarından biri, tek katmanınızı bozmamak için süpernatantı odanıza damla damla eklemektir.Ek olarak, analizinizde dikkate almak için görüntülemeye hazırlanmak için gereken süreyi not edin. Floresan olarak paketlenmiş proteinleri değiştirerek, bu prosedür hücre döngüsü süresi, kromozom ayrışması, protein bolluğu ve protein lokalizasyonu ile ilgili soruları cevaplamak için kullanılabilir.

use-time-lapse-microscopy-stage-specific-nuclear-depletion-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, biofilms can reduce industrial productivity, destroy structures, and threaten human life. 1-3 On the other hand, harnessing the power of biofilms can help clean the environment and generate sustainable energy. 4-8
The ability of S. cerevisiae to colonize surfaces and participate in complex biofilms was mostly ignored until the rediscovery of the differentiation programs triggered by various signaling pathways and environmental cues in this organism. 9, 10 The continuing interest in using S. cerevisiae as a model organism to understand the interaction and convergence of signaling pathways, such as the Ras-PKA, Kss1 MAPK, and Hog1 osmolarity pathways, quickly placed S. cerevisiae in the junction of biofilm biology and signal transduction research. 11-20 To this end, differentiation of yeast cells into long, adhesive, pseudohyphal filaments became a convenient readout for the activation of signal transduction pathways upon various environmental changes. However, filamentation is a complex collection of phenotypes, which makes assaying for it as if it were a simple phenotype misleading. In the past decade, several assays were successfully adopted from bacterial biofilm studies to yeast research, such as MAT formation assays to measure colony spread on soft agar and crystal violet staining to quantitatively measure cell-surface adherence. 12, 21 However, there has been some confusion in assays developed to qualitatively assess the adhesive and invasive phenotypes of yeast in agar.
Here, we present a simple and reliable method for assessing the adhesive and invasive quality of yeast strains with easy-to-understand steps to isolate the adhesion assessment from invasion assessment. Our method, adopted from previous studies, 10, 16 involves growing cells in liquid media and plating on differential nutrient conditions for growth of large spots, which we then wash with water to assess adhesion and rub cells completely off the agar surface to assess invasion into the agar. We eliminate the need for streaking cells onto agar, which affects the invasion of cells into the agar. In general, we observed that haploid strains that invade agar are always adhesive, yet not all adhesive strains can invade agar medium. Our approach can be used in conjunction with other assays to carefully dissect the differentiation steps and requirements of yeast signal transduction, differentiation, quorum sensing, and biofilm formation.

We describe a qualitative assay for yeast adhesion and agar invasion as a measure of invasive and pseudohyphal differentiation. This simple assay can be used to assess the invasive phenotype of various mutants as well as the effects environmental cues and signaling pathways on yeast differentiation.

S. cerevisiae yapışma ve Agar Invasion için Testi

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Biyoloji

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Zaman atlamalı Mikroskopi Sökme Aktin İzlenmesi

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

İki foton axotomy ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme canlı zebrafish embriyolar

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

S. cerevisiae &quot;adlı organel morfolojisi küresel çalışma yüksek verimli bir yöntem

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

S. cerevisiae, kantitatif proteomik protein kompleksleri tanımlanması

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Erken Embriyo Oluşumu Zaman atlamalı Mikroskopi Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

Time-lapse video Mikroskop ile Hücrelerinin Rastgele Göç Kantitatif Analiz

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes result from the fusion of haploid cells of distinct mating type (MATa, MATalpha) and give rise to corresponding stable diploids that successively generate as many as 20 diploid progeny as a result of their strikingly asymmetric mitotic divisions 2. Zygote formation is orchestrated by a complex sequence of events: In this process, soluble mating factors bind to cognate receptors, triggering receptor-mediated signaling cascades that facilitate interruption of the cell cycle and culminate in cell-cell fusion. Zygotes may be considered a model for progenitor or stem cell function.
Although much has been learned about the formation of zygotes and although zygotes have been used to investigate cell-molecular questions of general significance, almost all studies have made use of mating mixtures in which zygotes are intermixed with a majority population of haploid cells 3-8. Many aspects of the biochemistry of zygote formation and the continuing life of the zygote therefore remain uninvestigated.
Reports of purification of yeast zygotes describe protocols based on their sedimentation properties 9; however, this sedimentation-based procedure did not yield nearly 90% purity in our hands. Moreover, it has the disadvantage that cells are exposed to hypertonic sorbitol. We therefore have developed a versatile purification procedure. For this purpose, pairs of haploid cells expressing red or green fluorescent proteins were co-incubated to allow zygote formation, harvested at various times, and the resulting zygotes were purified using a flow cytometry-based sorting protocol. This technique provides a convenient visual assessment of purity and maturation. The average purity of the fraction is approximately 90%. According to the timing of harvest, zygotes of varying degrees of maturity can be recovered. The purified samples provide a convenient point of departure for "-omic" studies, for recovery of initial progeny, and for systematic investigation of this progenitor cell.

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

To purify zygotes of S. cerevisiae, haploid cells of opposite mating type were engineered to express red or green fluorescent proteins, co-incubated to allow zygote formation, and fractionated using a flow cytometry-based protocol. The highly-enriched fraction enables subsequent "-omic" studies, recovery of initial progeny, and systematic investigation of zygote morphogenesis.

Akış Sitometri tabanlı Arıtma<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zigot

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

In Oksijen yetersizliği kaynaklı Asma Animasyon Visualize&#39;a Time Lapse Mikroskopi kullanın<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriyolar

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...