Name: expression of transgenes in native bladder urothelium using adenovirus-mediated transduction
Uploaded: 2022-10-06T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af en pilotprojektpris gennem P30DK079307 (til M.G.D.), NIH-bevilling R01DK119183 (til G.A. og MDC), NIH-tilskud R01DK129473 (til G.A.), en American Urology Association Career Development-pris og et Winters Foundation-tilskud (til N.M.) af Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores fra Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307), og af S10OD028596 (til G.A.), som finansierede købet af det konfokale system, der blev brugt til at fange nogle af de billeder, der præsenteres i dette manuskript.

Eksperimenter, der involverer generering af adenovirus, som kræver BSL2-certificering, blev udført under godkendelse fra University of Pittsburgh Environmental Health and Safety kontorer og Institutional Biosafety Committee. Alle udførte dyreforsøg, herunder adenoviral transduktion (som kræver ABSL2-certificering), blev udført i overensstemmelse med relevante retningslinjer/bestemmelser i Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals og Animal Welfare Act og under godkendelse af Universi...

<ol>
	<li>Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Urothelium:+Life+in+a+liquid+environment.">The Urothelium: Life in a liquid environment.</a> Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).</li><li>Truschel, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-regulated+exocytosis/endocytosis+in+bladder+umbrella+cells.">Stretch-regulated exocytosis/endocytosis in bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (3), 830-846 (2002).</li><li>Lewis, S. A., de Moura, J. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+cytoplasmic+vesicles+into+apical+membrane+of+mammalian+urinary+bladder+epthelium.">Incorporation of cytoplasmic vesicles into apical membrane of mammalian urinary bladder epthelium.</a> Nature (London). 297 (5868), 685-688 (1982).</li><li>Eaton, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+contraction+of+the+umbrella+cell+apical+junctional+ring+in+response+to+bladder+filling+and+voiding.">Expansion and contraction of the umbrella cell apical junctional ring in response to bladder filling and voiding.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (16), 2037-2052 (2019).</li><li>Yu, W., Khandelwal, P., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+apical+and+basolateral+membrane+requirements+for+stretch-induced+membrane+traffic+at+the+apical+surface+of+bladder+umbrella+cells.">Distinct apical and basolateral membrane requirements for stretch-induced membrane traffic at the apical surface of bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (1), 282-295 (2009).</li><li>Birder, L., Andersson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+signaling.">Urothelial signaling.</a> Physiological Reviews. 93 (2), 653-680 (2013).</li><li>Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+bladder,+cystitis+and+nerve/urothelial+interactions.">Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions.</a> Autonomic Neuroscience. 182, 89-94 (2014).</li><li>Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+uroepithelial-associated+sensory+web.">The uroepithelial-associated sensory web.</a> Kidney International. 72 (9), 1057-1064 (2007).</li><li>Dalghi, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+for+PIEZO1+and+PIEZO2+in+urothelial+mechanotransduction+and+lower+urinary+tract+interoception.">Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (19), 152984 (2021).</li><li>Montalbetti, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+urothelial+paracellular+transport+promotes+cystitis.">Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis.</a> American Journal of Physiology: Renal Physiology. 309 (12), 1070-1081 (2015).</li><li>Keay, S. K., Birder, L. A., Chai, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+bladder+urothelial+pathophysiology+in+functional+bladder+disorders.">Evidence for bladder urothelial pathophysiology in functional bladder disorders.</a> BioMed Research International. 2014, 865463 (2014).</li><li>Friedel, R. H., Wurst, W., Wefers, B., Kuhn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+conditional+knockout+mice.">Generating conditional knockout mice.</a> Methods in Molecular Biology. 693, 205-231 (2011).</li><li>Kashyap, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+nerve+growth+factor+expression+in+the+bladder+by+antisense+oligonucleotides+as+new+treatment+for+overactive+bladder.">Down-regulation of nerve growth factor expression in the bladder by antisense oligonucleotides as new treatment for overactive bladder.</a> Journal of Urology. 190 (2), 757-764 (2013).</li><li>Bolenz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+and+ex+vivo+urothelial+penetration+by+oligodeoxynucleotides+for+optimizing+treatment+of+transitional+cell+carcinoma.">Cellular uptake and ex vivo urothelial penetration by oligodeoxynucleotides for optimizing treatment of transitional cell carcinoma.</a> Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 30 (5), 265-273 (2008).</li><li>Tyagi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravesical+antisense+therapy+for+cystitis+using+TAT-peptide+nucleic+acid+conjugates.">Intravesical antisense therapy for cystitis using TAT-peptide nucleic acid conjugates.</a> Molecular Pharmaceutics. 3 (4), 398-406 (2006).</li><li>Sadoff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interim+results+of+a+phase+1-2a+trial+of+Ad26.COV2.S+Covid-19+vaccine.">Interim results of a phase 1-2a trial of Ad26.COV2.S Covid-19 vaccine.</a> New England Journal of Medicine. 384 (19), 1824-1835 (2021).</li><li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+delivery:+Potential+applications+for+gene+and+cell-Based+therapies+in+the+new+era+of+personalized+medicine.">Adenovirus-mediated gene delivery: Potential applications for gene and cell-Based therapies in the new era of personalized medicine.</a> Genes &amp; Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).</li><li>Ramesh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+pretreatment+agents+to+enhance+adenovirus+infection+of+bladder+epithelium.">Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium.</a> Molecular Therapy. 10 (4), 697-705 (2004).</li><li>Khandelwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab11a-dependent+exocytosis+of+discoidal/fusiform+vesicles+in+bladder+umbrella+cells.">Rab11a-dependent exocytosis of discoidal/fusiform vesicles in bladder umbrella cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15773-15778 (2008).</li><li>Khandelwal, P., Ruiz, W. G., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+endocytosis+in+bladder+umbrella+cells+occurs+through+an+integrin-regulated+and+RhoA-+and+dynamin-dependent+pathway.">Compensatory endocytosis in bladder umbrella cells occurs through an integrin-regulated and RhoA- and dynamin-dependent pathway.</a> The European Molecular Biology Organization journal. 29 (12), 1961-1975 (2010).</li><li>Khandelwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rab11a-Rab8a-Myo5B+network+promotes+stretch-regulated+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells.">A Rab11a-Rab8a-Myo5B network promotes stretch-regulated exocytosis in bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 24 (7), 1007-1019 (2013).</li><li>Prakasam, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A1+adenosine+receptor-stimulated+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells+requires+phosphorylation+of+ADAM17+Ser811+and+EGF+receptor+transactivation.">A1 adenosine receptor-stimulated exocytosis in bladder umbrella cells requires phosphorylation of ADAM17 Ser811 and EGF receptor transactivation.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3798-3812 (2014).</li><li>Gallo, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAB27B+requirement+for+stretch-induced+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells.">RAB27B requirement for stretch-induced exocytosis in bladder umbrella cells.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 314 (3), 349-365 (2018).</li><li>Amasheh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-2+expression+induces+cation-selective+channels+in+tight+junctions+of+epithelial+cells.">Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 115, 4969-4976 (2002).</li><li>Yu, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+cation+selectivity+in+claudin-2-based+paracellular+pores:+identification+of+an+electrostatic+interaction+site.">Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: identification of an electrostatic interaction site.</a> The Journal of General Physiology. 133 (1), 111-127 (2009).</li><li>Kasahara, H., Aoki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+using+adenoviral+RNAi+vector+in+vascular+smooth+muscle+cells+and+cardiomyocytes.">Gene silencing using adenoviral RNAi vector in vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes.</a> Methods in Molecular Medicine. 112, 155-172 (2005).</li><li>Bolognesi, B., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaching+the+limit.">Reaching the limit.</a> eLife. 7, 39804 (2018).</li><li>Atasheva, S., Shayakhmetov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+responses+to+adenovirus+and+adenovirus+vectors.">Cytokine responses to adenovirus and adenovirus vectors.</a> Viruses. 14 (5), 888 (2022).</li><li>Sanchez Freire, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+may+mediate+the+down-regulation+of+neurokinin-1+receptor+in+chronic+bladder+pain+syndrome.">MicroRNAs may mediate the down-regulation of neurokinin-1 receptor in chronic bladder pain syndrome.</a> American Journal of Pathology. 176 (1), 288-303 (2010).</li></ol>

Mens Ramesh et al. var fokuseret på at udvikle strategier til at anvende adenoviral transduktion til behandling af blærekræft 18, har nyere rapporter vist nytten af disse teknikker til at studere normal urothelial biologi / fysiologi og patofysiologi 10,18,19,20,21 . De vigtigste træk ved denne fremgangsmåde omfatter følgende: (i)...

Urothelium er det specialiserede epitel, der linjer nyrebækkenet, urinlederne, blæren og proksimal urinrør1. Det består af tre lag: et lag af stærkt differentierede og polariserede ofte bi-nucleate paraplyceller, hvis apikale overflader er badet i urin; et mellemliggende cellelag med en population af bi-nukleattransitforstærkende celler, der kan give anledning til overfladiske paraplyceller som reaktion på deres akutte tab og et enkelt lag af basalceller, hvoraf en delmængde fungerer som stamceller, der kan regenerere hele urothelium som reaktion på kronisk skade. Paraplyceller er hovedsageligt ansvarlige for dannelsen af urothelialbarrieren med høj modstand, hvis komponenter inkluderer en apikal membran (rig på kolesterol og cerebrosider) med lav permeabilitet for vand og opløste stoffer og et apikalt forbindelseskompleks med høj modstand (bestående af tætte kryds, klæbende kryds, desmosomer og en tilhørende actomyosinring)1 . Både paraplycellens apikale overflade og dens forbindelsesring udvider sig under blærefyldning og vender hurtigt tilbage til deres fyldte tilstand efter tømning af 1,2,3,4,5. Ud over sin rolle i barrierefunktionen antages urothelium også at have sensoriske og transducerfunktioner, der gør det muligt at mærke ændringer i det ekstracellulære miljø (fx stretch) og overføre denne information via frigivelse af mediatorer (herunder ATP, adenosin og acetylcholin) til underliggende væv, herunder suburothelial afferente nerveprocesser 6,7,8 . Nylige beviser for denne rolle findes hos mus, der mangler urothelial ekspression af både Piezo1 og Piezo2, hvilket resulterer i ændret ugyldiggørelsesfunktion9. Derudover udvikler rotter, der overudtrykker det poredannende protein CLDN2 i paraplycellelaget, betændelse og smerte svarende til det, der ses hos patienter med interstitiel blærebetændelse10. Det antages, at forstyrrelse af urothelial sensorisk / transducer eller barrierefunktion kan bidrage til flere blæreforstyrrelser 6,11.
En bedre forståelse af urotheliums biologi i normale og sygdomstilstande afhænger af tilgængeligheden af værktøjer, der gør det muligt for efterforskere let at nedregulere endogen genekspression eller muliggøre ekspression af transgener i det indfødte væv. Mens en tilgang til nedregulering af genekspression er at generere betingede urotheliale knockout-mus, afhænger denne tilgang af tilgængeligheden af mus med floxede alleler, er arbejdskrævende og kan tage måneder til år at gennemføre12. Ikke overraskende har forskere udviklet teknikker til at transfektere eller transducere urothelium, hvilket kan føre til resultater på en kortere tidsskala. Offentliggjorte metoder til transfektion inkluderer anvendelse af kationiske lipider13, anti-sense phosphorothioated oligodeoxynucleotider 14 eller antisensenukleinsyrer bundet til HIV TAT-proteinet, der trænger ind i 11-mer peptid15. Denne protokols fokus er imidlertid på brugen af adenoviralmedieret transduktion, en velundersøgt metode, der er effektiv til genlevering til en bred vifte af celler, er blevet testet i adskillige kliniske forsøg og blev senest brugt til at levere cDNA'et, der koder for COVID-19-kapsidproteinet, til modtagere af en variant af COVID-19-vaccinen16, 17. For en mere grundig beskrivelse af adenoviruslivscyklussen, adenovirale vektorer og kliniske anvendelser af adenovirus henvises læseren til reference17.
En vigtig milepæl i brugen af adenovirus til transducere urothelium var en rapport fra Ramesh et al., der viste korte forbehandlinger med vaskemidler, herunder N-dodecyl-β-D-maltosid (DDM) dramatisk forbedret transduktion af urothelium af en adenovirus, der koder for β-galactosidase18. Ved hjælp af denne proof-of-principle-undersøgelse som vejledning er adenoviral-medieret transduktion af urothelium nu blevet brugt til at udtrykke en række proteiner, herunder Rab-familie GTPaser, guanin-nukleotidudvekslingsfaktorer, myosinmotoriske fragmenter, poredannende tætte forbindelsesassocierede claudiner og ADAM17 10,19,20,21,22 . Den samme tilgang blev tilpasset til at udtrykke små interfererende RNA'er (siRNA), hvis virkninger blev reddet af co-ekspressive siRNA-resistente varianter af transgenet22. Protokollen beskrevet her indeholder generelle metoder til at generere store mængder stærkt koncentreret adenovirus, et krav til disse teknikker, samt tilpasninger af metoderne fra Ramesh et al.18 til at udtrykke transgener i urothelium med høj effektivitet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL pipette</td>
			<td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td>
			<td>CLS4488</td>
			<td>sterile, serological pipette, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mL ultracentrifuge tube</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>06-752</td>
			<td>PET thinwall ultracentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352097</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G needle</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>305196</td>
			<td>18 G x 1.5 in needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL pipette</td>
			<td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td>
			<td>CLS4489</td>
			<td>sterile, serological pipette, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352098</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipette</td>
			<td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td>
			<td>CLS4487</td>
			<td>sterile, serological pipette, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cavicide</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>6400012</td>
			<td>Anti-viral solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish - 15 cm</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>353025</td>
			<td>sterile, tissue-culture treated&#160; (150 mm x 25 mm dish)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>893.1832</td>
			<td>handle length 24 cm, blade length 1.7 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C-4306</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM culture medium (high glucose)</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11965092</td>
			<td>with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>EDS</td>
			<td>Bioiultra grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Hyclone (Cytiva)</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td>defined serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td>5.75 in glass pipette, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G-5516</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV catheter - mouse</td>
			<td>Smith Medical Jelco</td>
			<td>3063</td>
			<td>24 G x 3/4 in Safety IV catheter&#160; radiopaque</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV catheter - rat</td>
			<td>Smith Medical Jelco</td>
			<td>3060</td>
			<td>22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P-9541</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>Cell culture grade&#160; &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#8226;7 H2O</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>431478</td>
			<td>&#160;&#8805; 99.99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-dodecyl-&#946;-D-maltoside&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4641</td>
			<td>&#160;&#8805; 98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nose cone for multiple animals</td>
			<td>custom designed</td>
			<td></td>
			<td>commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-10 column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-085-01</td>
			<td>Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin antibiotic (100x)</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>15070063</td>
			<td>100x concentrated solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>BioPhotometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stand and clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-679Q and 05-769-8FQ</td>
			<td>available from numerous suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter unit</td>
			<td>Fisher Scientific (Nalgene)</td>
			<td>09-740-65B</td>
			<td>0.2 &#181;m rapid-flow filter unit (150 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter unit 0.2 &#181;m (syringe)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td>Millipore Sigma Milex 0.22 &#181;m filter unit that attaches to syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super speed centrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5810R</td>
			<td>with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1 mL)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>309628</td>
			<td>1-mL syringe Luer-lok tip - sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (3 mL)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>309656</td>
			<td>3-mL syringe slip tip - sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table-top centrifuge (low speed)</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5702</td>
			<td>with swinging bucket rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td>polyethylene 3.4 mL transfer pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>648310-M</td>
			<td>Molecular Biology grade&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE select protease solution</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>12604013</td>
			<td>TrypLE express enzyme (1x), no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-80 XP</td>
			<td>with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporizer&#160;</td>
			<td>General Anesthetic Services, Inc.</td>
			<td>Tec 3</td>
			<td>Isoflurane vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td>analog vortex mixer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of transgenes in native bladder urothelium using adenovirus-mediated transduction

Ud over at danne en højmodstandsbarriere antages urothelium, der forer nyrebækkenet, urinlederne, blæren og proksimal urinrøret at mærke og transmittere information om dets miljø til de underliggende væv, hvilket fremmer ugyldiggørelsesfunktion og adfærd. Forstyrrelse af urothelialbarrieren eller dens sensoriske / transducerfunktion kan føre til sygdom. At studere disse komplekse begivenheder hæmmes af manglen på enkle strategier til at ændre gen- og proteinekspression i urothelium. Metoder er beskrevet her, der gør det muligt for efterforskere at generere store mængder high-titer adenovirus, som derefter kan bruges til at transducere gnaverurothelium med høj effektivitet og på en relativt ligetil måde. Både cDNA'er og små interfererende RNA'er kan udtrykkes ved hjælp af adenoviral transduktion, og virkningen af transgenekspression på urothelial funktion kan vurderes 12 timer til flere dage senere. Disse metoder har bred anvendelighed til studier af normal og abnorm urothelial biologi ved hjælp af muse- eller rottedyremodeller.

Virus forberedelse Et eksempel på virusrensning ved densitetsgradientcentrifugering er vist i figur 1A. Det lyserøde bånd, der findes ved grænsefladen mellem det indlæste cellulære materiale og 1,25 g / ml CsCl-laget, består primært af forstyrrede celler og deres affald (se magenta pil i figur 1A). Det stammer sin lyserøde farve fra den lille mængde kulturmedium, der overføres fra trin 1.5 i protokollen. De pågældende viruspartik...

Watch this Scientific Journal Video about Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction at JoVE.com

Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction

Metoder er beskrevet til generering af store mængder rekombinante adenovirus, som derefter kan bruges til at transducere det indfødte gnaverurothelium, hvilket muliggør ekspression af transgener eller nedregulering af endogene genprodukter.

Ekspression af transgener i naturligt blæreurothelium ved hjælp af adenovirusmedieret transduktion

In addition to forming a high-resistance barrier, the urothelium lining the renal pelvis, ureters, bladder, and proximal urethra is hypothesized to sense ...

Denne protokol beskriver metoder, der gør det muligt for efterforskere at udtrykke CDNA'er eller SIRNAs i det oprindelige blæreurothelium. De vigtigste fordele ved denne teknik er dens relative enkelhed, evnen til at udtrykke cDNA'er, siRNA'er i urothelium med høj effektivitet og inden for en relativt kort periode. Den sværeste del af denne teknik er kateteriseringen.Den overordnede teknik er dog relativt let at mestre, når den først er lært. Demonstration af proceduren vil være Giovanni Ruiz, en forskningsspecialist IV i mit laboratorium. Til at begynde med skal du placere den bedøvede mus på en varmepude ved siden af næsekeglerne.Oprethold dyret under anæstesi i protokollens varighed. Bekræft, at musen er fuldstændig bedøvet med en tåklemme. For at forhindre, at der indføres luft i blæren, fyldes plastkateterdelen af et IV-kateter og tilhørende hub med sterilt PBS ved hjælp af en steril overførselspipette eller sprøjte.Med dyret i liggende stilling vatpind den ydre urethral meatus med 70%alkohol. Tag derefter forsigtigt fat i vævet, der danner den ydre urinrørskød, og stræk det lodret væk fra dyret ved hjælp af fine tang. Indsæt det sterile kateter i det ydre meatus.Brug den anden hånd forsigtigt til at indsætte kateteret lodret omkring tre til fire millimeter i urinrøret. Sænk derefter kateteret indsat i den ydre meatus mod dyrets hale, hvilket letter dets indtræden i den del af urinrøret, der passerer under skambenet og i sidste ende ind i blæren. Lad urinen i blæren lække ud.Fjern eventuel resterende urin ved at udføre Credes manøvre ved at massere og forsigtigt trykke ned på blærebumpen i det nedre abdominalområde. For at gøre urothelet modtageligt for transduktion skal du vaske musen eller rotteblæren ved at fastgøre en steril en milliliter sprøjte fyldt med PBS til kateternavet. Injicer 100 mikroliter steril PBS i museblæren.Når sprøjten er taget ud af kateterbeslaget, skal PBS have lov til at løbe ud. Indsæt 100 mikroliter 0,1% N-dodecyl-beta-D-maltosid opløst i PBS og 0,2 mikrometer filter steriliseret i museblæren ved hjælp af en steril milliliter sprøjte. Opbevar N-dodecyl-beta-D-maltosid i blæren i 10 minutter ved at lade sprøjten blive siddende.Fjern N-dodecyl-beta-D-maltosid fra blæren ved at løsne sprøjten og lade den løbe ud. For at introducere viruset i blæren fastgøres en steril milliliter sprøjte til kateternavet og indsætter 5.000.000 til 100.000.000 IVP adenovirus fortyndet i 100 mikroliter steril PBS til mus eller 450 mikroliter til rotter i blæren. Efter 30 minutter skal du tage sprøjten af og lade virusopløsningen evakuere blæren på en engangspude.Blott enhver resterende virusopløsning med en absorberende serviet, mens puden kasseres, og tør biofarligt affald af. For at give dyret mulighed for at komme sig, ophøre strømmen af isofluran. Lad dyret komme sig og være helt mobilt, inden det sættes tilbage i buret, navnlig hvis dyrene er opstaldet i grupper.Analyser virkningerne af transgenekspression 12 til 72 timer efter behandling ved hjælp af metoder som mRNA in situ-hybridisering, Western blot eller immunofluorescens. Western blot-analyse af urotheliale lysater afslørede V5-mærket humant væksthormonekspression i urothelium af transducerede blærer, men ikke i utransduced. Ekspressionen blev også bekræftet ved immunofluorescens ved anvendelse af antistoffer, der genkendte humant væksthormon eller V5-epitopmærket.Western blot-analyse bekræftede ekspressionen af Claudin-2 hos rotter transduceret med adenovirus, men ikke hos rotter transduceret med et kontrolleret GFP-kodende virus. Immunofluorescensanalyse bekræftede yderligere eksogen Claudin-2-ekspression i urotheliale paraplyceller transduceret med viruskodende Claudin-2 cDNA. Påvisning af eksogen Claudin-2 i Tight Junction Protein 1 ved immunofluorescens og konfokal mikroskopi af helmonteret eller tværsnitsformet urothelium afslørede tilstedeværelsen af Tight Junction og intracellulære akkumuleringer af Claudin-2 i cellecytoplasmaet.Billedfeltet viser, at optælling af antallet af transducerede paraplyceller afslører en effektivitet, der nærmer sig 95%og i hele blærevæggen transduceres kun urothelium, og intet andet væv er målrettet mod det indpodede adenovirus. Kateteriseringen er afgørende for, at protokollen fungerer efter hensigten. Denne teknik gør det muligt for efterforskere at studere normal urothelial biologi, samt at forstå tilstande, hvor protein overekspression eller underekspression fører til sygdom.

Research

JoVE Journal

Biology

Targeted Expression of GFP in the Hair Follicle Using Ex Vivo Viral Transduction

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Genetisk kodede Molecular Probes at studere G-protein-koblede receptorer

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Proteomiske Prøveforberedelse fra formalin Faste og Paraffin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...