Name: expression of transgenes in native bladder urothelium using adenovirus-mediated transduction
Uploaded: 2022-10-06T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door een proefprojectprijs via P30DK079307 (aan M.G.D.), NIH-subsidie R01DK119183 (aan G.A. en M.D.C.), NIH-subsidie R01DK129473 (aan G.A.), een American Urology Association Career Development award en een Winters Foundation-beurs (aan N.M.), door de Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores van het Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307), en door S10OD028596 (aan G.A.), die de aankoop financierde van het confocale systeem dat werd gebruikt om enkele van de afbeeldingen in dit manuscript vast te leggen.

Experimenten met het genereren van adenovirussen, waarvoor BSL2-certificering vereist is, werden uitgevoerd onder goedkeuring van de milieugezondheids- en veiligheidskantoren van de Universiteit van Pittsburgh en het Institutional Biosafety Committee. Alle uitgevoerde dierproeven, inclusief adenovirale transductie (waarvoor ABSL2-certificering vereist is), werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen / voorschriften van het beleid van de volksgezondheidsdienst inzake humane zorg en gebruik van proefd...

<ol>
	<li>Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Urothelium:+Life+in+a+liquid+environment.">The Urothelium: Life in a liquid environment.</a> Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).</li><li>Truschel, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-regulated+exocytosis/endocytosis+in+bladder+umbrella+cells.">Stretch-regulated exocytosis/endocytosis in bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (3), 830-846 (2002).</li><li>Lewis, S. A., de Moura, J. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+cytoplasmic+vesicles+into+apical+membrane+of+mammalian+urinary+bladder+epthelium.">Incorporation of cytoplasmic vesicles into apical membrane of mammalian urinary bladder epthelium.</a> Nature (London). 297 (5868), 685-688 (1982).</li><li>Eaton, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+contraction+of+the+umbrella+cell+apical+junctional+ring+in+response+to+bladder+filling+and+voiding.">Expansion and contraction of the umbrella cell apical junctional ring in response to bladder filling and voiding.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (16), 2037-2052 (2019).</li><li>Yu, W., Khandelwal, P., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+apical+and+basolateral+membrane+requirements+for+stretch-induced+membrane+traffic+at+the+apical+surface+of+bladder+umbrella+cells.">Distinct apical and basolateral membrane requirements for stretch-induced membrane traffic at the apical surface of bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (1), 282-295 (2009).</li><li>Birder, L., Andersson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+signaling.">Urothelial signaling.</a> Physiological Reviews. 93 (2), 653-680 (2013).</li><li>Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+bladder,+cystitis+and+nerve/urothelial+interactions.">Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions.</a> Autonomic Neuroscience. 182, 89-94 (2014).</li><li>Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+uroepithelial-associated+sensory+web.">The uroepithelial-associated sensory web.</a> Kidney International. 72 (9), 1057-1064 (2007).</li><li>Dalghi, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+for+PIEZO1+and+PIEZO2+in+urothelial+mechanotransduction+and+lower+urinary+tract+interoception.">Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (19), 152984 (2021).</li><li>Montalbetti, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+urothelial+paracellular+transport+promotes+cystitis.">Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis.</a> American Journal of Physiology: Renal Physiology. 309 (12), 1070-1081 (2015).</li><li>Keay, S. K., Birder, L. A., Chai, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+bladder+urothelial+pathophysiology+in+functional+bladder+disorders.">Evidence for bladder urothelial pathophysiology in functional bladder disorders.</a> BioMed Research International. 2014, 865463 (2014).</li><li>Friedel, R. H., Wurst, W., Wefers, B., Kuhn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+conditional+knockout+mice.">Generating conditional knockout mice.</a> Methods in Molecular Biology. 693, 205-231 (2011).</li><li>Kashyap, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+nerve+growth+factor+expression+in+the+bladder+by+antisense+oligonucleotides+as+new+treatment+for+overactive+bladder.">Down-regulation of nerve growth factor expression in the bladder by antisense oligonucleotides as new treatment for overactive bladder.</a> Journal of Urology. 190 (2), 757-764 (2013).</li><li>Bolenz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+and+ex+vivo+urothelial+penetration+by+oligodeoxynucleotides+for+optimizing+treatment+of+transitional+cell+carcinoma.">Cellular uptake and ex vivo urothelial penetration by oligodeoxynucleotides for optimizing treatment of transitional cell carcinoma.</a> Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 30 (5), 265-273 (2008).</li><li>Tyagi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravesical+antisense+therapy+for+cystitis+using+TAT-peptide+nucleic+acid+conjugates.">Intravesical antisense therapy for cystitis using TAT-peptide nucleic acid conjugates.</a> Molecular Pharmaceutics. 3 (4), 398-406 (2006).</li><li>Sadoff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interim+results+of+a+phase+1-2a+trial+of+Ad26.COV2.S+Covid-19+vaccine.">Interim results of a phase 1-2a trial of Ad26.COV2.S Covid-19 vaccine.</a> New England Journal of Medicine. 384 (19), 1824-1835 (2021).</li><li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+delivery:+Potential+applications+for+gene+and+cell-Based+therapies+in+the+new+era+of+personalized+medicine.">Adenovirus-mediated gene delivery: Potential applications for gene and cell-Based therapies in the new era of personalized medicine.</a> Genes &amp; Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).</li><li>Ramesh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+pretreatment+agents+to+enhance+adenovirus+infection+of+bladder+epithelium.">Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium.</a> Molecular Therapy. 10 (4), 697-705 (2004).</li><li>Khandelwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab11a-dependent+exocytosis+of+discoidal/fusiform+vesicles+in+bladder+umbrella+cells.">Rab11a-dependent exocytosis of discoidal/fusiform vesicles in bladder umbrella cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15773-15778 (2008).</li><li>Khandelwal, P., Ruiz, W. G., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+endocytosis+in+bladder+umbrella+cells+occurs+through+an+integrin-regulated+and+RhoA-+and+dynamin-dependent+pathway.">Compensatory endocytosis in bladder umbrella cells occurs through an integrin-regulated and RhoA- and dynamin-dependent pathway.</a> The European Molecular Biology Organization journal. 29 (12), 1961-1975 (2010).</li><li>Khandelwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rab11a-Rab8a-Myo5B+network+promotes+stretch-regulated+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells.">A Rab11a-Rab8a-Myo5B network promotes stretch-regulated exocytosis in bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 24 (7), 1007-1019 (2013).</li><li>Prakasam, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A1+adenosine+receptor-stimulated+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells+requires+phosphorylation+of+ADAM17+Ser811+and+EGF+receptor+transactivation.">A1 adenosine receptor-stimulated exocytosis in bladder umbrella cells requires phosphorylation of ADAM17 Ser811 and EGF receptor transactivation.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3798-3812 (2014).</li><li>Gallo, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAB27B+requirement+for+stretch-induced+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells.">RAB27B requirement for stretch-induced exocytosis in bladder umbrella cells.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 314 (3), 349-365 (2018).</li><li>Amasheh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-2+expression+induces+cation-selective+channels+in+tight+junctions+of+epithelial+cells.">Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 115, 4969-4976 (2002).</li><li>Yu, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+cation+selectivity+in+claudin-2-based+paracellular+pores:+identification+of+an+electrostatic+interaction+site.">Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: identification of an electrostatic interaction site.</a> The Journal of General Physiology. 133 (1), 111-127 (2009).</li><li>Kasahara, H., Aoki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+using+adenoviral+RNAi+vector+in+vascular+smooth+muscle+cells+and+cardiomyocytes.">Gene silencing using adenoviral RNAi vector in vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes.</a> Methods in Molecular Medicine. 112, 155-172 (2005).</li><li>Bolognesi, B., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaching+the+limit.">Reaching the limit.</a> eLife. 7, 39804 (2018).</li><li>Atasheva, S., Shayakhmetov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+responses+to+adenovirus+and+adenovirus+vectors.">Cytokine responses to adenovirus and adenovirus vectors.</a> Viruses. 14 (5), 888 (2022).</li><li>Sanchez Freire, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+may+mediate+the+down-regulation+of+neurokinin-1+receptor+in+chronic+bladder+pain+syndrome.">MicroRNAs may mediate the down-regulation of neurokinin-1 receptor in chronic bladder pain syndrome.</a> American Journal of Pathology. 176 (1), 288-303 (2010).</li></ol>

Terwijl Ramesh et al. zich richtten op het ontwikkelen van strategieën om adenovirale transductie te gebruiken bij de behandeling van blaaskanker 18, hebben recentere rapporten het nut van deze technieken aangetoond bij het bestuderen van normale urotheliale biologie / fysiologie en pathofysiologie 10,18,19,20,21 . De belangrijkste ken...

Het urotheel is het gespecialiseerde epitheel dat het nierbekken, de urineleiders, de blaas en de proximale urethra1 bekleedt. Het bestaat uit drie lagen: een laag van sterk gedifferentieerde en gepolariseerde vaak bi-nucleate paraplucellen, waarvan de apicale oppervlakken baden in urine; een tussenliggende cellaag met een populatie van bi-nucleaat transit-versterkende cellen die aanleiding kunnen geven tot oppervlakkige paraplucellen als reactie op hun acute verlies; en een enkele laag basale cellen, waarvan een subset functioneert als stamcellen die het geheel van het urotheel kunnen regenereren als reactie op chronische schade. Paraplucellen zijn voornamelijk verantwoordelijk voor het vormen van de urotheliale barrière met hoge weerstand, waarvan componenten een apicale membraan (rijk aan cholesterol en cerebrosiden) met een lage permeabiliteit voor water en opgeloste stoffen omvatten, en een apicale junctionele complex met hoge weerstand (bestaande uit tight junctions, adherens junctions, desmosomen en een bijbehorende actomyosinering)1 . Zowel het apicale oppervlak van de paraplucel als de junctionele ring zetten uit tijdens het vullen van de blaas en keren snel terug naar hun voorgevulde toestand na het legen van 1,2,3,4,5. Naast zijn rol in de barrièrefunctie, wordt ook verondersteld dat het urotheel sensorische en transducerfuncties heeft die het mogelijk maken om veranderingen in het extracellulaire milieu (bijv. Stretch) te detecteren en deze informatie via afgifte van mediatoren (waaronder ATP, adenosine en acetylcholine) door te geven aan onderliggende weefsels, waaronder suburotheliale afferente zenuwprocessen 6,7,8 . Recent bewijs van deze rol wordt gevonden bij muizen zonder urotheliale expressie van zowel Piezo1 als Piezo2, wat resulteert in een veranderde ledigingsfunctie9. Bovendien ontwikkelen ratten die het tight-junction porievormende eiwit CLDN2 in de paraplucellaag overexpressie overexpressie, ontsteking en pijn analoog aan die bij patiënten met interstitiële cystitis10. Er wordt verondersteld dat verstoring van de urotheliale sensorische / transducer- of barrièrefunctie kan bijdragen aan verschillende blaasaandoeningen 6,11.
Een beter begrip van de biologie van het urotheel in normale en ziektetoestanden hangt af van de beschikbaarheid van hulpmiddelen waarmee onderzoekers gemakkelijk endogene genexpressie kunnen downreguleren of de expressie van transgenen in het inheemse weefsel mogelijk maken. Hoewel een benadering om genexpressie te downreguleren is om voorwaardelijke urotheliale knock-out muizen te genereren, hangt deze aanpak af van de beschikbaarheid van muizen met floxed allelen, is arbeidsintensief en kan maanden tot jaren duren om12 te voltooien. Het is dan ook niet verrassend dat onderzoekers technieken hebben ontwikkeld om het urotheel te transfecteren of te transduceren, wat kan leiden tot resultaten op een kortere tijdschaal. Gepubliceerde methoden voor transfectie omvatten het gebruik van kationische lipiden13, anti-sense fosforothioated oligodeoxynucleotiden 14, of antisense nucleïnezuren gebonden aan het HIV TAT-eiwit dat 11-mer peptide15 penetreert. De focus van dit protocol ligt echter op het gebruik van adenovirale gemedieerde transductie, een goed bestudeerde methodologie die efficiënt is in genafgifte aan een breed scala aan cellen, is getest in tal van klinische onderzoeken en werd onlangs gebruikt om het cDNA dat codeert voor het COVID-19 capsid-eiwit te leveren aan ontvangers van één variant van het COVID-19-vaccin16, 17. Voor een meer grondige beschrijving van de levenscyclus van het adenovirus, adenovirale vectoren en klinische toepassingen van adenovirussen, wordt de lezer verwezen naar referentie17.
Een belangrijke mijlpaal in het gebruik van adenovirussen om het urotheel te transduceren, was een rapport van Ramesh et al. dat korte voorbehandelingen met detergentia, waaronder N-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) dramatisch verbeterde transductie van het urotheel door een adenovirus dat codeert voor β-galactosidase18. Met behulp van deze proof-of-principle studie als leidraad, is adenovirale transductie van het urotheel nu gebruikt om een verscheidenheid aan eiwitten tot expressie te brengen, waaronder Rab-familie GTPases, guanine-nucleotide uitwisselingsfactoren, myosine motorfragmenten, porievormende tight junction-geassocieerde claudinen en ADAM17 10,19,20,21,22 . Dezelfde aanpak werd aangepast om kleine interfererende RNA's (siRNA) tot expressie te brengen, waarvan de effecten werden gered door co-expressie van siRNA-resistente varianten van het transgen22. Het hier beschreven protocol omvat algemene methoden om grote hoeveelheden sterk geconcentreerd adenovirus te genereren, een vereiste voor deze technieken, evenals aanpassingen van de methoden van Ramesh et al.18 om transgenen in het urotheel met hoge efficiëntie tot expressie te brengen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL pipette</td>
			<td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td>
			<td>CLS4488</td>
			<td>sterile, serological pipette, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mL ultracentrifuge tube</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>06-752</td>
			<td>PET thinwall ultracentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352097</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G needle</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>305196</td>
			<td>18 G x 1.5 in needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL pipette</td>
			<td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td>
			<td>CLS4489</td>
			<td>sterile, serological pipette, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352098</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipette</td>
			<td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td>
			<td>CLS4487</td>
			<td>sterile, serological pipette, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cavicide</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>6400012</td>
			<td>Anti-viral solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish - 15 cm</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>353025</td>
			<td>sterile, tissue-culture treated&#160; (150 mm x 25 mm dish)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>893.1832</td>
			<td>handle length 24 cm, blade length 1.7 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C-4306</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM culture medium (high glucose)</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11965092</td>
			<td>with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>EDS</td>
			<td>Bioiultra grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Hyclone (Cytiva)</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td>defined serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td>5.75 in glass pipette, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G-5516</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV catheter - mouse</td>
			<td>Smith Medical Jelco</td>
			<td>3063</td>
			<td>24 G x 3/4 in Safety IV catheter&#160; radiopaque</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV catheter - rat</td>
			<td>Smith Medical Jelco</td>
			<td>3060</td>
			<td>22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P-9541</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>Cell culture grade&#160; &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#8226;7 H2O</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>431478</td>
			<td>&#160;&#8805; 99.99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-dodecyl-&#946;-D-maltoside&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4641</td>
			<td>&#160;&#8805; 98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nose cone for multiple animals</td>
			<td>custom designed</td>
			<td></td>
			<td>commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-10 column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-085-01</td>
			<td>Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin antibiotic (100x)</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>15070063</td>
			<td>100x concentrated solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>BioPhotometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stand and clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-679Q and 05-769-8FQ</td>
			<td>available from numerous suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter unit</td>
			<td>Fisher Scientific (Nalgene)</td>
			<td>09-740-65B</td>
			<td>0.2 &#181;m rapid-flow filter unit (150 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter unit 0.2 &#181;m (syringe)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td>Millipore Sigma Milex 0.22 &#181;m filter unit that attaches to syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super speed centrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5810R</td>
			<td>with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1 mL)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>309628</td>
			<td>1-mL syringe Luer-lok tip - sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (3 mL)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>309656</td>
			<td>3-mL syringe slip tip - sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table-top centrifuge (low speed)</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5702</td>
			<td>with swinging bucket rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td>polyethylene 3.4 mL transfer pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>648310-M</td>
			<td>Molecular Biology grade&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE select protease solution</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>12604013</td>
			<td>TrypLE express enzyme (1x), no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-80 XP</td>
			<td>with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporizer&#160;</td>
			<td>General Anesthetic Services, Inc.</td>
			<td>Tec 3</td>
			<td>Isoflurane vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td>analog vortex mixer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of transgenes in native bladder urothelium using adenovirus-mediated transduction

Naast het vormen van een barrière met hoge weerstand, wordt verondersteld dat het urotheel dat het nierbekken, urineleiders, blaas en proximale urethra bekleedt, informatie over zijn omgeving waarneemt en doorgeeft aan de onderliggende weefsels, waardoor de ledigingsfunctie en het gedrag worden bevorderd. Verstoring van de urotheliale barrière, of de sensorische / transducerfunctie, kan leiden tot ziekte. Het bestuderen van deze complexe gebeurtenissen wordt belemmerd door een gebrek aan eenvoudige strategieën om de gen- en eiwitexpressie in het urotheel te veranderen. Hier worden methoden beschreven waarmee onderzoekers grote hoeveelheden adenovirus met een hoge titer kunnen genereren, die vervolgens kunnen worden gebruikt om knaagdier urotheel met hoge efficiëntie en op een relatief eenvoudige manier te transduceren. Zowel cDNA's als kleine storende RNA's kunnen worden uitgedrukt met behulp van adenovirale transductie, en de impact van transgenexpressie op de urotheliale functie kan 12 uur tot enkele dagen later worden beoordeeld. Deze methoden zijn breed toepasbaar op studies van normale en abnormale urotheliale biologie met behulp van muis- of rattendiermodellen.

Virusvoorbereiding Een voorbeeld van viruszuivering door dichtheidsgradiëntcentrifugatie is weergegeven in figuur 1A. De lichtroze band, te vinden op het grensvlak van het geladen celmateriaal en de 1,25 g/ml CsCl-laag, bestaat voornamelijk uit verstoorde cellen en hun puin (zie magentapijl in figuur 1A). Het ontleent zijn roze kleur aan de kleine hoeveelheid cultuurmedium die wordt overgenomen van stap 1.5 in het protocol. De relevante viru...

Watch this Scientific Journal Video about Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction at JoVE.com

Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction

Er worden methoden beschreven voor het genereren van grote hoeveelheden recombinante adenovirussen, die vervolgens kunnen worden gebruikt om het inheemse knaagdier urotheel te transduceren, waardoor expressie van transgenen of downregulatie van endogene genproducten mogelijk is.

Expressie van transgenen in native blaasurotheel met behulp van adenovirus-gemedieerde transductie

In addition to forming a high-resistance barrier, the urothelium lining the renal pelvis, ureters, bladder, and proximal urethra is hypothesized to sense ...

Dit protocol beschrijft methoden waarmee onderzoekers CDNA's of SIRNA's kunnen uitdrukken in het inheemse blaasurotheel. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn de relatieve eenvoud, het vermogen om cDNA's, siRNA's in het urotheel met hoge efficiëntie en binnen een relatief korte tijd tot expressie te brengen. Het moeilijkste deel van deze techniek is de katheterisatie.De algehele techniek is echter relatief gemakkelijk onder de knie te krijgen als je het eenmaal hebt geleerd. Giovanni Ruiz, een Research Specialist IV in mijn laboratorium, zal de procedure demonstreren. Om te beginnen plaats je de verdoofde muis op een verwarmingskussen naast de neuskegels.Houd het dier onder narcose voor de duur van het protocol. Controleer of de muis volledig verdoofd is met een teenknijper. Om te voorkomen dat er lucht in de blaas wordt gebracht, vult u het plastic kathetergedeelte van een infuuskatheter en de bijbehorende naaf met steriele PBS met behulp van een steriele transferpipet of spuit.Met het dier in rugligging swabt de uitwendige urethrale meatus met 70% alcohol. Pak vervolgens voorzichtig het weefsel dat de externe urethrale meatus vormt en strek het verticaal weg van het dier met een fijne tang. Breng de steriele katheter in de uitwendige meatus in.Breng met de andere hand de katheter voorzichtig verticaal ongeveer drie tot vier millimeter in de urethrale meatus in. Laat vervolgens de katheter die in de uitwendige meatus is ingebracht in de richting van de staart van het dier zakken, waardoor het gemakkelijker wordt om binnen te komen in het deel van de urethra dat onder het schaambeen en uiteindelijk in de blaas passeert. Laat de urine in de blaas uitlekken.Verwijder eventuele resterende urine door Crede's manoeuvre uit te voeren door te masseren en zachtjes op de blaasbult in de onderbuik te drukken. Om het urotheel ontvankelijk te maken voor transductie, wast u de blaas van de muis of rat door een steriele spuit van één milliliter gevuld met PBS aan de katheterhub te bevestigen. Injecteer 100 microliter steriel PBS in de muizenblaas.Nadat u de spuit van de katheterfitting hebt losgemaakt, laat u de PBS leeglopen. Inbreng 100 microliter 0,1% N-dodecyl-bèta-D-maltoside opgelost in PBS en 0,2 micrometer filter gesteriliseerd in de muizenblaas met behulp van een steriele spuit van één milliliter. Houd de N-dodecyl-beta-D-maltoside gedurende 10 minuten in de blaas door de spuit op zijn plaats te laten.Verwijder de N-dodecyl-beta-D-maltoside uit de blaas door de spuit los te maken en uit te laten lopen. Om het virus in de blaas te introduceren, bevestigt u een steriele spuit van één milliliter aan de katheterhub en brengt u 5.000.000.000 tot 100.000.000 IVP adenovirus verdund in 100 microliter steriel PBS voor muizen of 450 microliter voor ratten in de blaas. Maak na 30 minuten de spuit los en laat de virusoplossing de blaas evacueren op een wegwerppad.Dep eventuele resterende virusoplossing met een absorberend doekje terwijl u het maandverband weggooit en veeg het biologisch gevaarlijk afval eraf. Om het dier te laten herstellen, stopt u de stroom isofluraan. Laat het dier herstellen en volledig mobiel zijn voordat u het terugbrengt naar zijn kooi, vooral als de dieren in groepshuisvesting zijn.Analyseer de effecten van transgenexpressie 12 tot 72 uur na de behandeling met behulp van methoden zoals mRNA in situ hybridisatie, Western blot of immunofluorescentie. Western blot-analyse van urotheliale lysaten onthulde V5-gelabelde menselijke groeihormoonexpressie in het urotheel van getransduceerde blazen, maar niet in niet-getransduceerde blazen. De expressie werd ook bevestigd door immunofluorescentie met behulp van antilichamen die menselijk groeihormoon herkenden, of de V5-epitooptag.Western blot-analyse bevestigde de expressie van Claudin-2 bij ratten getransduceerd met adenovirus, maar niet bij ratten getransduceerd met een gecontroleerd GFP-coderend virus. Immunofluorescentieanalyse bevestigde verder exogene Claudin-2-expressie in urotheliale paraplucellen getransduceerd met viruscoderend Claudin-2 cDNA. Detectie van exogene Claudin-2 in Tight Junction Protein 1 door immunofluorescentie en confocale microscopie van geheel gemonteerd of dwarsdoorsnedend urotheel onthulde de aanwezigheid van Tight Junction en intracellulaire accumulaties van Claudin-2 in het celcytoplasma.Het beeldveld laat zien dat het tellen van het aantal getransduceerde paraplucellen een efficiëntie onthult die 95% benadert en in het geheel van de blaaswand wordt alleen het urotheel getransduceerd en geen ander weefsel wordt aangevallen door het ingebrachte adenovirus. De katheterisatie is van cruciaal belang om het protocol te laten werken zoals bedoeld. Deze techniek stelt onderzoekers in staat om de normale urotheliale biologie te bestuderen, evenals om omstandigheden te begrijpen waarin eiwitoverexpressie of onderexpressie tot ziekte leidt.

Research

JoVE Journal

Biology

Targeted Expression of GFP in the Hair Follicle Using Ex Vivo Viral Transduction

Gerichte Expressie van GFP in de haarfollikel Met behulp van Ex Vivo Viral Transduction

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

De vervaardiging van primaire hematopoietische cellen culturen uit Murine Bone Marrow voor Elektroporatie

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Detection of Protein Ubiquitination

Detectie van eiwit ubiquitinering

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Kleuring van eiwitten in Gels met Coomassie G-250 zonder organisch oplosmiddel en azijnzuur

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Met behulp van de Gene Puiser MXcell Elektroporatie systeem om primaire cellen transfecteren met een hoog rendement

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Met behulp van een geautomatiseerde cel Counter aan Gene Expression Studies Vereenvoudigen: siRNA Knockdown van IL-4 Afhankelijk van genexpressie in cellen Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

Adenovirus-gemedieerde Genetische Verwijdering van signaalmoleculen in gekweekte primaire muis embryonale fibroblasten

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro reconstitutie van de Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Genetisch gecodeerde Molecular Probes aan G-eiwit gekoppelde receptoren Studie

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Proteomics Monstervoorbereiding van formaline gefixeerde en in paraffine ingebed weefsel

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...