Name: expression of transgenes in native bladder urothelium using adenovirus-mediated transduction
Uploaded: 2022-10-06T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par une subvention de projet pilote par l’intermédiaire de P30DK079307 (à M.G.D.), subvention NIH R01DK119183 (à G.A. et M.D.C.), NIH subvention R01DK129473 (à G.A.), un prix de développement de carrière de l’American Urology Association et une subvention de la Fondation Winters (à N.M.), par les noyaux d’imagerie rénale Cell Physiology and Model Organisms du Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307), et par S10OD028596 (à G.A.), qui a financé l’achat du système confocal utilisé pour capturer certaines des images présentées dans ce manuscrit.

Les expériences impliquant la génération d’adénovirus, qui nécessite une certification BSL2, ont été réalisées avec l’approbation des bureaux de santé et de sécurité environnementales de l’Université de Pittsburgh et du comité institutionnel de biosécurité. Toutes les expériences sur les animaux effectuées, y compris la transduction adénovirale (qui nécessite une certification ABSL2), ont été effectuées conformément aux directives / règlements pertinents de la politique du service de santé...

<ol>
	<li>Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Urothelium:+Life+in+a+liquid+environment.">The Urothelium: Life in a liquid environment.</a> Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).</li><li>Truschel, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-regulated+exocytosis/endocytosis+in+bladder+umbrella+cells.">Stretch-regulated exocytosis/endocytosis in bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (3), 830-846 (2002).</li><li>Lewis, S. A., de Moura, J. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+cytoplasmic+vesicles+into+apical+membrane+of+mammalian+urinary+bladder+epthelium.">Incorporation of cytoplasmic vesicles into apical membrane of mammalian urinary bladder epthelium.</a> Nature (London). 297 (5868), 685-688 (1982).</li><li>Eaton, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+contraction+of+the+umbrella+cell+apical+junctional+ring+in+response+to+bladder+filling+and+voiding.">Expansion and contraction of the umbrella cell apical junctional ring in response to bladder filling and voiding.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (16), 2037-2052 (2019).</li><li>Yu, W., Khandelwal, P., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+apical+and+basolateral+membrane+requirements+for+stretch-induced+membrane+traffic+at+the+apical+surface+of+bladder+umbrella+cells.">Distinct apical and basolateral membrane requirements for stretch-induced membrane traffic at the apical surface of bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (1), 282-295 (2009).</li><li>Birder, L., Andersson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+signaling.">Urothelial signaling.</a> Physiological Reviews. 93 (2), 653-680 (2013).</li><li>Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+bladder,+cystitis+and+nerve/urothelial+interactions.">Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions.</a> Autonomic Neuroscience. 182, 89-94 (2014).</li><li>Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+uroepithelial-associated+sensory+web.">The uroepithelial-associated sensory web.</a> Kidney International. 72 (9), 1057-1064 (2007).</li><li>Dalghi, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+for+PIEZO1+and+PIEZO2+in+urothelial+mechanotransduction+and+lower+urinary+tract+interoception.">Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (19), 152984 (2021).</li><li>Montalbetti, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+urothelial+paracellular+transport+promotes+cystitis.">Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis.</a> American Journal of Physiology: Renal Physiology. 309 (12), 1070-1081 (2015).</li><li>Keay, S. K., Birder, L. A., Chai, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+bladder+urothelial+pathophysiology+in+functional+bladder+disorders.">Evidence for bladder urothelial pathophysiology in functional bladder disorders.</a> BioMed Research International. 2014, 865463 (2014).</li><li>Friedel, R. H., Wurst, W., Wefers, B., Kuhn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+conditional+knockout+mice.">Generating conditional knockout mice.</a> Methods in Molecular Biology. 693, 205-231 (2011).</li><li>Kashyap, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+nerve+growth+factor+expression+in+the+bladder+by+antisense+oligonucleotides+as+new+treatment+for+overactive+bladder.">Down-regulation of nerve growth factor expression in the bladder by antisense oligonucleotides as new treatment for overactive bladder.</a> Journal of Urology. 190 (2), 757-764 (2013).</li><li>Bolenz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+and+ex+vivo+urothelial+penetration+by+oligodeoxynucleotides+for+optimizing+treatment+of+transitional+cell+carcinoma.">Cellular uptake and ex vivo urothelial penetration by oligodeoxynucleotides for optimizing treatment of transitional cell carcinoma.</a> Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 30 (5), 265-273 (2008).</li><li>Tyagi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravesical+antisense+therapy+for+cystitis+using+TAT-peptide+nucleic+acid+conjugates.">Intravesical antisense therapy for cystitis using TAT-peptide nucleic acid conjugates.</a> Molecular Pharmaceutics. 3 (4), 398-406 (2006).</li><li>Sadoff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interim+results+of+a+phase+1-2a+trial+of+Ad26.COV2.S+Covid-19+vaccine.">Interim results of a phase 1-2a trial of Ad26.COV2.S Covid-19 vaccine.</a> New England Journal of Medicine. 384 (19), 1824-1835 (2021).</li><li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+delivery:+Potential+applications+for+gene+and+cell-Based+therapies+in+the+new+era+of+personalized+medicine.">Adenovirus-mediated gene delivery: Potential applications for gene and cell-Based therapies in the new era of personalized medicine.</a> Genes &amp; Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).</li><li>Ramesh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+pretreatment+agents+to+enhance+adenovirus+infection+of+bladder+epithelium.">Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium.</a> Molecular Therapy. 10 (4), 697-705 (2004).</li><li>Khandelwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab11a-dependent+exocytosis+of+discoidal/fusiform+vesicles+in+bladder+umbrella+cells.">Rab11a-dependent exocytosis of discoidal/fusiform vesicles in bladder umbrella cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15773-15778 (2008).</li><li>Khandelwal, P., Ruiz, W. G., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+endocytosis+in+bladder+umbrella+cells+occurs+through+an+integrin-regulated+and+RhoA-+and+dynamin-dependent+pathway.">Compensatory endocytosis in bladder umbrella cells occurs through an integrin-regulated and RhoA- and dynamin-dependent pathway.</a> The European Molecular Biology Organization journal. 29 (12), 1961-1975 (2010).</li><li>Khandelwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rab11a-Rab8a-Myo5B+network+promotes+stretch-regulated+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells.">A Rab11a-Rab8a-Myo5B network promotes stretch-regulated exocytosis in bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 24 (7), 1007-1019 (2013).</li><li>Prakasam, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A1+adenosine+receptor-stimulated+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells+requires+phosphorylation+of+ADAM17+Ser811+and+EGF+receptor+transactivation.">A1 adenosine receptor-stimulated exocytosis in bladder umbrella cells requires phosphorylation of ADAM17 Ser811 and EGF receptor transactivation.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3798-3812 (2014).</li><li>Gallo, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAB27B+requirement+for+stretch-induced+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells.">RAB27B requirement for stretch-induced exocytosis in bladder umbrella cells.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 314 (3), 349-365 (2018).</li><li>Amasheh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-2+expression+induces+cation-selective+channels+in+tight+junctions+of+epithelial+cells.">Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 115, 4969-4976 (2002).</li><li>Yu, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+cation+selectivity+in+claudin-2-based+paracellular+pores:+identification+of+an+electrostatic+interaction+site.">Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: identification of an electrostatic interaction site.</a> The Journal of General Physiology. 133 (1), 111-127 (2009).</li><li>Kasahara, H., Aoki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+using+adenoviral+RNAi+vector+in+vascular+smooth+muscle+cells+and+cardiomyocytes.">Gene silencing using adenoviral RNAi vector in vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes.</a> Methods in Molecular Medicine. 112, 155-172 (2005).</li><li>Bolognesi, B., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaching+the+limit.">Reaching the limit.</a> eLife. 7, 39804 (2018).</li><li>Atasheva, S., Shayakhmetov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+responses+to+adenovirus+and+adenovirus+vectors.">Cytokine responses to adenovirus and adenovirus vectors.</a> Viruses. 14 (5), 888 (2022).</li><li>Sanchez Freire, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+may+mediate+the+down-regulation+of+neurokinin-1+receptor+in+chronic+bladder+pain+syndrome.">MicroRNAs may mediate the down-regulation of neurokinin-1 receptor in chronic bladder pain syndrome.</a> American Journal of Pathology. 176 (1), 288-303 (2010).</li></ol>

Alors que Ramesh et coll. se concentraient sur l’élaboration de stratégies pour utiliser la transduction adénovirale dans le traitement du cancer de la vessie 18, des rapports plus récents ont démontré l’utilité de ces techniques dans l’étude de la biologie, de la physiologie urothéliale normale et de la physiopathologie 10,18,19,20,21<sup class...

L’urothélium est l’épithélium spécialisé qui tapisse le bassinet du rein, les uretères, la vessie et l’urètre proximal1. Il comprend trois strates : une couche de cellules parapluies hautement différenciées et polarisées, souvent binucléées, dont les surfaces apicales baignent dans l’urine ; une couche cellulaire intermédiaire avec une population de cellules binucléées amplifiant le transit qui peut donner naissance à des cellules parapluies superficielles en réponse à leur perte aiguë; et une seule couche de cellules basales, dont un sous-ensemble fonctionne comme des cellules souches qui peuvent régénérer la totalité de l’urothélium en réponse à une lésion chronique. Les cellules parapluies sont principalement responsables de la formation de la barrière urothéliale à haute résistance, dont les composants comprennent une membrane apicale (riche en cholestérol et en cérébrosides) avec une faible perméabilité à l’eau et aux solutés, et un complexe jonctionnel apical à haute résistance (composé de jonctions serrées, de jonctions adhérentes, de desmosomes et d’un cycle actomyosine associé)1 . La surface apicale de la cellule parapluie et son anneau jonctionnel se dilatent pendant le remplissage de la vessie et reviennent rapidement à leur état pré-rempli après l’évacuation de 1,2,3,4,5. En plus de son rôle dans la fonction de barrière, on suppose également que l’urothélium a des fonctions sensorielles et transductrices qui lui permettent de détecter les changements dans le milieu extracellulaire (p. ex. étirement) et de transmettre cette information par la libération de médiateurs (y compris l’ATP, l’adénosine et l’acétylcholine) aux tissus sous-jacents, y compris les processus nerveux afférents sous-urothéliaux 6,7,8 . Des preuves récentes de ce rôle sont trouvées chez les souris dépourvues d’expression urothéliale de Piezo1 et Piezo2, ce qui entraîne une altération de la fonction de miction9. De plus, les rats surexprimant la protéine CLDN2 formant des pores à jonction serrée dans la couche cellulaire parapluie développent une inflammation et une douleur analogues à celles observées chez les patients atteints de cystite interstitielle10. On suppose que la perturbation de la fonction sensorielle/transductrice urothéliale ou de la barrière peut contribuer à plusieurs troubles de la vessie 6,11.
Une meilleure compréhension de la biologie de l’urothélium dans les états normaux et pathologiques dépend de la disponibilité d’outils qui permettront aux chercheurs de réguler facilement à la baisse l’expression des gènes endogènes ou de permettre l’expression des transgènes dans le tissu natif. Alors qu’une approche pour réguler à la baisse l’expression des gènes consiste à générer des souris knockout urothéliales conditionnelles, cette approche dépend de la disponibilité de souris avec des allèles floxés, nécessite beaucoup de travail et peut prendre des mois ou des années pour compléter12. Il n’est donc pas surprenant que les chercheurs aient mis au point des techniques pour transfecter ou transduire l’urothélium, ce qui peut conduire à des résultats sur une échelle de temps plus courte. Les méthodes publiées pour la transfection comprennent l’utilisation de lipides cationiques13, d’oligodésoxynucléotides phosphorothioés antisens14 ou d’acides nucléiques antisens attachés à la protéine TAT du VIH pénétrant le peptide11-mère 15. Cependant, ce protocole met l’accent sur l’utilisation de la transduction médiée par l’adénoviral, une méthodologie bien étudiée qui est efficace pour la livraison de gènes à un large éventail de cellules, qui a été testée dans de nombreux essais cliniques et, plus récemment, a été utilisée pour administrer l’ADNc codant pour la protéine de capside COVID-19 aux receveurs d’une variante du vaccin COVID-1916, 17. Pour une description plus complète du cycle de vie de l’adénovirus, des vecteurs adénoviraux et des applications cliniques des adénovirus, le lecteur est invité à consulter la référence17.
Une étape importante dans l’utilisation des adénovirus pour transduire l’urothélium a été un rapport de Ramesh et al. qui a montré de courts prétraitements avec des détergents, y compris le N-dodécyl-β-D-maltoside (DDM) considérablement amélioré la transduction de l’urothélium par un adénovirus codant β-galactosidase18. En utilisant cette étude de preuve de principe comme guide, la transduction médiée par adénoviral de l’urothélium a maintenant été utilisée pour exprimer une variété de protéines, y compris les GTPases de la famille Rab, les facteurs d’échange guanine-nucléotide, les fragments moteurs de myosine, les claudines associées à la jonction serrée formant des pores et ADAM17 10,19,20,21,22 . La même approche a été adaptée pour exprimer de petits ARN interférents (siRNA), dont les effets ont été sauvés par la co-expression de variantes résistantes au siRNA du transgène22. Le protocole décrit ici comprend des méthodes générales pour générer de grandes quantités d’adénovirus hautement concentrés, une exigence pour ces techniques, ainsi que des adaptations des méthodes de Ramesh et al.18 pour exprimer les transgènes dans l’urothélium avec une grande efficacité.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL pipette</td>
			<td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td>
			<td>CLS4488</td>
			<td>sterile, serological pipette, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mL ultracentrifuge tube</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>06-752</td>
			<td>PET thinwall ultracentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352097</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G needle</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>305196</td>
			<td>18 G x 1.5 in needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL pipette</td>
			<td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td>
			<td>CLS4489</td>
			<td>sterile, serological pipette, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352098</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipette</td>
			<td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td>
			<td>CLS4487</td>
			<td>sterile, serological pipette, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cavicide</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>6400012</td>
			<td>Anti-viral solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish - 15 cm</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>353025</td>
			<td>sterile, tissue-culture treated&#160; (150 mm x 25 mm dish)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>893.1832</td>
			<td>handle length 24 cm, blade length 1.7 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C-4306</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM culture medium (high glucose)</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11965092</td>
			<td>with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>EDS</td>
			<td>Bioiultra grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Hyclone (Cytiva)</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td>defined serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td>5.75 in glass pipette, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G-5516</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV catheter - mouse</td>
			<td>Smith Medical Jelco</td>
			<td>3063</td>
			<td>24 G x 3/4 in Safety IV catheter&#160; radiopaque</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV catheter - rat</td>
			<td>Smith Medical Jelco</td>
			<td>3060</td>
			<td>22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P-9541</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>Cell culture grade&#160; &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#8226;7 H2O</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>431478</td>
			<td>&#160;&#8805; 99.99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-dodecyl-&#946;-D-maltoside&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4641</td>
			<td>&#160;&#8805; 98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nose cone for multiple animals</td>
			<td>custom designed</td>
			<td></td>
			<td>commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-10 column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-085-01</td>
			<td>Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin antibiotic (100x)</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>15070063</td>
			<td>100x concentrated solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>BioPhotometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stand and clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-679Q and 05-769-8FQ</td>
			<td>available from numerous suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter unit</td>
			<td>Fisher Scientific (Nalgene)</td>
			<td>09-740-65B</td>
			<td>0.2 &#181;m rapid-flow filter unit (150 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter unit 0.2 &#181;m (syringe)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td>Millipore Sigma Milex 0.22 &#181;m filter unit that attaches to syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super speed centrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5810R</td>
			<td>with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1 mL)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>309628</td>
			<td>1-mL syringe Luer-lok tip - sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (3 mL)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>309656</td>
			<td>3-mL syringe slip tip - sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table-top centrifuge (low speed)</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5702</td>
			<td>with swinging bucket rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td>polyethylene 3.4 mL transfer pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>648310-M</td>
			<td>Molecular Biology grade&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE select protease solution</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>12604013</td>
			<td>TrypLE express enzyme (1x), no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-80 XP</td>
			<td>with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporizer&#160;</td>
			<td>General Anesthetic Services, Inc.</td>
			<td>Tec 3</td>
			<td>Isoflurane vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td>analog vortex mixer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of transgenes in native bladder urothelium using adenovirus-mediated transduction

En plus de former une barrière à haute résistance, l’urothélium qui tapisse le bassinet du rein, les uretères, la vessie et l’urètre proximal est supposé détecter et transmettre des informations sur son environnement aux tissus sous-jacents, favorisant ainsi la fonction et le comportement de miction. La perturbation de la barrière urothéliale, ou de sa fonction sensorielle/transductrice, peut entraîner une maladie. L’étude de ces événements complexes est entravée par le manque de stratégies simples pour modifier l’expression des gènes et des protéines dans l’urothélium. Les méthodes décrites ici permettent aux chercheurs de générer de grandes quantités d’adénovirus à titre élevé, qui peuvent ensuite être utilisés pour transduire l’urothélium des rongeurs avec une grande efficacité et d’une manière relativement simple. Les ADNc et les petits ARN interférents peuvent être exprimés par transduction adénovirale, et l’impact de l’expression transgénique sur la fonction urothéliale peut être évalué 12 h à plusieurs jours plus tard. Ces méthodes ont une large applicabilité aux études de biologie urothéliale normale et anormale utilisant des modèles animaux de souris ou de rats.

Préparation du virus Un exemple de purification virale par centrifugation à gradient de densité est présenté à la figure 1A. La bande rose clair, située à l’interface du matériel cellulaire chargé et de la couche de CsCl de 1,25 g/mL, est principalement composée de cellules perturbées et de leurs débris (voir la flèche magenta à la figure 1A). Il tire sa couleur rosâtre de la petite quantité de milieu de culture qui est rep...

Watch this Scientific Journal Video about Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction at JoVE.com

Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction

Des méthodes sont décrites pour la génération de grandes quantités d’adénovirus recombinants, qui peuvent ensuite être utilisés pour transduire l’urothélium de rongeur natif permettant l’expression de transgènes ou la régulation négative de produits géniques endogènes.

Expression de transgènes dans l’urothélium vésical natif par transduction médiée par adénovirus

In addition to forming a high-resistance barrier, the urothelium lining the renal pelvis, ureters, bladder, and proximal urethra is hypothesized to sense ...

Ce protocole décrit des méthodes qui permettent aux chercheurs d’exprimer des ADNC ou des SIRNA dans l’urothélium natif de la vessie. Les principaux avantages de cette technique sont sa relative simplicité, la capacité d’exprimer des ADNc, des siRNA dans l’urothélium avec une grande efficacité, et dans un laps de temps relativement court. La partie la plus difficile de cette technique est le cathétérisme.Cependant, la technique globale est relativement facile à maîtriser une fois apprise. Giovanni Ruiz, spécialiste de recherche IV dans mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer, placez la souris anesthésiée sur un coussin chauffant à côté des cônes nasaux.Maintenir l’animal sous anesthésie pendant toute la durée du protocole. Confirmez que la souris est complètement anesthésiée avec un pincement d’orteil. Pour éviter d’introduire de l’air dans la vessie, remplissez la partie du cathéter en plastique d’un cathéter IV et du moyeu associé avec du PBS stérile à l’aide d’une pipette de transfert ou d’une seringue stérile.Avec l’animal en décubitus dorsal, écouvillonner le méat urétral externe avec 70% d’alcool. Ensuite, saisissez doucement le tissu formant le méat urétral externe et étendez-le verticalement loin de l’animal à l’aide de pinces fines. Insérez le cathéter stérile dans le méat externe.En utilisant l’autre main, insérez soigneusement le cathéter verticalement d’environ trois à quatre millimètres dans le méat urétral. Ensuite, abaissez le cathéter inséré dans le méat externe vers la queue de l’animal, ce qui facilite son entrée dans la partie de l’urètre qui passe sous l’os pubien et finalement dans la vessie. Laissez l’urine dans la vessie s’écouler.Enlevez toute urine résiduelle en effectuant la manœuvre de Crede en massant et en appuyant doucement sur la bosse de la vessie dans la région abdominale inférieure. Pour rendre l’urothélium réceptif à la transduction, lavez la vessie de souris ou de rat en fixant une seringue stérile d’un millilitre remplie de PBS au moyeu du cathéter. Injectez 100 microlitres de PBS stérile dans la vessie de la souris.Après avoir détaché la seringue de l’ajustement du cathéter, laissez le PBS s’égoutter. Instiller 100 microlitres de N-dodécyl-bêta-D-maltoside à 0,1% dissous dans du PBS et un filtre à 0,2 micromètre stérilisé dans la vessie de souris à l’aide d’une seringue stérile d’un millilitre. Retenir le N-dodécyl-bêta-D-maltoside dans la vessie pendant 10 minutes en laissant la seringue en place.Retirez le N-dodécyl-bêta-D-maltoside de la vessie en détachant la seringue et en la laissant s’écouler. Pour introduire le virus dans la vessie, attachez une seringue stérile d’un millilitre au moyeu du cathéter et instillez 5 000 000 000 à 100 000 000 IVP d’adénovirus dilué dans 100 microlitres de PBS stérile pour les souris, ou 450 microlitres pour les rats dans la vessie. Après 30 minutes, détachez la seringue et laissez la solution virale évacuer la vessie sur une serviette jetable.Éponger toute solution virale résiduelle avec une lingette absorbante tout en jetant le tampon et essuyer les déchets biologiques dangereux. Afin de permettre à l’animal de récupérer, cesser l’écoulement de l’isoflurane. Laissez l’animal se rétablir et être complètement mobile avant de le remettre dans sa cage, en particulier si les animaux sont logés en groupe.Analyser les effets de l’expression transgénique 12 à 72 heures après le traitement à l’aide de méthodes telles que l’hybridation in situ de l’ARNm, le transfert Western ou l’immunofluorescence. L’analyse par transfert Western des lysats urothéliaux a révélé l’expression de l’hormone de croissance humaine marquée V5 dans l’urothélium des vessies transduites, mais pas dans les vessies non transduites. L’expression a également été confirmée par immunofluorescence à l’aide d’anticorps qui ont reconnu l’hormone de croissance humaine, ou le marqueur d’épitope V5.L’analyse par transfert Western a confirmé l’expression de Claudin-2 chez les rats transduits avec l’adénovirus, mais pas chez ceux transduits avec un virus contrôlé codant pour la GFP. L’analyse par immunofluorescence a confirmé l’expression exogène de Claudin-2 dans les cellules parapluies urothéliales transduites avec l’ADNc de Claudin-2 codant pour le virus. La détection de la claudine-2 exogène dans la protéine 1 de la jonction serrée par immunofluorescence et microscopie confocale de l’urothélium entier monté ou en coupe transversale a révélé la présence de jonctions serrées et d’accumulations intracellulaires de claudine-2 dans le cytoplasme cellulaire.Le champ d’image montre que compter le nombre de cellules parapluies transduites révèle une efficacité qui approche 95% et dans l’ensemble de la paroi de la vessie, seul l’urothélium est transduit, et aucun autre tissu n’est ciblé par l’adénovirus instillé. Le cathétérisme est essentiel pour que le protocole fonctionne comme prévu. Cette technique permet aux chercheurs d’étudier la biologie urothéliale normale, ainsi que de comprendre les conditions dans lesquelles la surexpression ou la sous-expression des protéines conduit à la maladie.

Research

JoVE Journal

Biology

Targeted Expression of GFP in the Hair Follicle Using Ex Vivo Viral Transduction

Expression ciblée de la GFP dans le follicule pileux ex vivo utilisant transduction virale

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft ...

Recherche

Biologie

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

La préparation des cultures primaires de cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse murine pour l&#39;électroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Detection of Protein Ubiquitination

La détection des protéines ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Coloration des protéines dans les gels de Coomassie G-250, sans solvant et l&#39;acide acétique organique

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Utilisation du système d&#39;électroporation Gene Pulser MXcell à transfecter des cellules primaires à haut rendement

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Aide d&#39;un compteur de cellules automatisé pour simplifier les études d&#39;expression génique: Knockdown siRNA de l&#39;IL-4 dans l&#39;expression des gènes dépendant cellules Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

Adénovirus suppression génétique des molécules de signalisation dans les cultures de fibroblastes de souris embryonnaires primaires

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

La reconstitution in vitro de l&#39;actif T. La télomérase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Molecular Probes génétiquement codés pour étude g récepteurs couplés à la protéine

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Protéomique Préparation de l&#39;échantillon de formol et inclus en paraffine fixe tissus

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...