Name: expression of transgenes in native bladder urothelium using adenovirus-mediated transduction
Uploaded: 2022-10-06T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch einen Pilotprojektpreis durch P30DK079307 (an M.G.D.), NIH-Zuschuss R01DK119183 (an G.A. und M.D.C.), NIH-Zuschuss R01DK129473 (an G.A.), einen Karriereentwicklungspreis der American Urology Association und einen Zuschuss der Winters Foundation (an N.M.), durch das Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores des Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307) unterstützt. und von S10OD028596 (an G.A.), die den Kauf des konfokalen Systems finanzierte, mit dem einige der in diesem Manuskript präsentierten Bilder aufgenommen wurden.

Experimente zur Erzeugung von Adenoviren, für die eine BSL2-Zertifizierung erforderlich ist, wurden mit Genehmigung der Umweltgesundheits- und Sicherheitsbüros der University of Pittsburgh und des Institutional Biosafety Committee durchgeführt. Alle durchgeführten Tierversuche, einschließlich der adenoviralen Transduktion (für die eine ABSL2-Zertifizierung erforderlich ist), wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien/Vorschriften der Richtlinie des öffentlichen Gesundheitsdienstes zur humanen Pf...

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	<li>Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Urothelium:+Life+in+a+liquid+environment.">The Urothelium: Life in a liquid environment.</a> Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).</li><li>Truschel, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-regulated+exocytosis/endocytosis+in+bladder+umbrella+cells.">Stretch-regulated exocytosis/endocytosis in bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (3), 830-846 (2002).</li><li>Lewis, S. A., de Moura, J. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+cytoplasmic+vesicles+into+apical+membrane+of+mammalian+urinary+bladder+epthelium.">Incorporation of cytoplasmic vesicles into apical membrane of mammalian urinary bladder epthelium.</a> Nature (London). 297 (5868), 685-688 (1982).</li><li>Eaton, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+contraction+of+the+umbrella+cell+apical+junctional+ring+in+response+to+bladder+filling+and+voiding.">Expansion and contraction of the umbrella cell apical junctional ring in response to bladder filling and voiding.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (16), 2037-2052 (2019).</li><li>Yu, W., Khandelwal, P., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+apical+and+basolateral+membrane+requirements+for+stretch-induced+membrane+traffic+at+the+apical+surface+of+bladder+umbrella+cells.">Distinct apical and basolateral membrane requirements for stretch-induced membrane traffic at the apical surface of bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (1), 282-295 (2009).</li><li>Birder, L., Andersson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+signaling.">Urothelial signaling.</a> Physiological Reviews. 93 (2), 653-680 (2013).</li><li>Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+bladder,+cystitis+and+nerve/urothelial+interactions.">Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions.</a> Autonomic Neuroscience. 182, 89-94 (2014).</li><li>Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+uroepithelial-associated+sensory+web.">The uroepithelial-associated sensory web.</a> Kidney International. 72 (9), 1057-1064 (2007).</li><li>Dalghi, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+for+PIEZO1+and+PIEZO2+in+urothelial+mechanotransduction+and+lower+urinary+tract+interoception.">Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (19), 152984 (2021).</li><li>Montalbetti, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+urothelial+paracellular+transport+promotes+cystitis.">Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis.</a> American Journal of Physiology: Renal Physiology. 309 (12), 1070-1081 (2015).</li><li>Keay, S. K., Birder, L. A., Chai, T. 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H., Wurst, W., Wefers, B., Kuhn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+conditional+knockout+mice.">Generating conditional knockout mice.</a> Methods in Molecular Biology. 693, 205-231 (2011).</li><li>Kashyap, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+nerve+growth+factor+expression+in+the+bladder+by+antisense+oligonucleotides+as+new+treatment+for+overactive+bladder.">Down-regulation of nerve growth factor expression in the bladder by antisense oligonucleotides as new treatment for overactive bladder.</a> Journal of Urology. 190 (2), 757-764 (2013).</li><li>Bolenz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+and+ex+vivo+urothelial+penetration+by+oligodeoxynucleotides+for+optimizing+treatment+of+transitional+cell+carcinoma.">Cellular uptake and ex vivo urothelial penetration by oligodeoxynucleotides for optimizing treatment of transitional cell carcinoma.</a> Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 30 (5), 265-273 (2008).</li><li>Tyagi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravesical+antisense+therapy+for+cystitis+using+TAT-peptide+nucleic+acid+conjugates.">Intravesical antisense therapy for cystitis using TAT-peptide nucleic acid conjugates.</a> Molecular Pharmaceutics. 3 (4), 398-406 (2006).</li><li>Sadoff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interim+results+of+a+phase+1-2a+trial+of+Ad26.COV2.S+Covid-19+vaccine.">Interim results of a phase 1-2a trial of Ad26.COV2.S Covid-19 vaccine.</a> New England Journal of Medicine. 384 (19), 1824-1835 (2021).</li><li>Lee, C. 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G., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+endocytosis+in+bladder+umbrella+cells+occurs+through+an+integrin-regulated+and+RhoA-+and+dynamin-dependent+pathway.">Compensatory endocytosis in bladder umbrella cells occurs through an integrin-regulated and RhoA- and dynamin-dependent pathway.</a> The European Molecular Biology Organization journal. 29 (12), 1961-1975 (2010).</li><li>Khandelwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rab11a-Rab8a-Myo5B+network+promotes+stretch-regulated+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells.">A Rab11a-Rab8a-Myo5B network promotes stretch-regulated exocytosis in bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 24 (7), 1007-1019 (2013).</li><li>Prakasam, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A1+adenosine+receptor-stimulated+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells+requires+phosphorylation+of+ADAM17+Ser811+and+EGF+receptor+transactivation.">A1 adenosine receptor-stimulated exocytosis in bladder umbrella cells requires phosphorylation of ADAM17 Ser811 and EGF receptor transactivation.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3798-3812 (2014).</li><li>Gallo, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAB27B+requirement+for+stretch-induced+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells.">RAB27B requirement for stretch-induced exocytosis in bladder umbrella cells.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 314 (3), 349-365 (2018).</li><li>Amasheh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-2+expression+induces+cation-selective+channels+in+tight+junctions+of+epithelial+cells.">Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 115, 4969-4976 (2002).</li><li>Yu, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+cation+selectivity+in+claudin-2-based+paracellular+pores:+identification+of+an+electrostatic+interaction+site.">Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: identification of an electrostatic interaction site.</a> The Journal of General Physiology. 133 (1), 111-127 (2009).</li><li>Kasahara, H., Aoki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+using+adenoviral+RNAi+vector+in+vascular+smooth+muscle+cells+and+cardiomyocytes.">Gene silencing using adenoviral RNAi vector in vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes.</a> Methods in Molecular Medicine. 112, 155-172 (2005).</li><li>Bolognesi, B., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaching+the+limit.">Reaching the limit.</a> eLife. 7, 39804 (2018).</li><li>Atasheva, S., Shayakhmetov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+responses+to+adenovirus+and+adenovirus+vectors.">Cytokine responses to adenovirus and adenovirus vectors.</a> Viruses. 14 (5), 888 (2022).</li><li>Sanchez Freire, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+may+mediate+the+down-regulation+of+neurokinin-1+receptor+in+chronic+bladder+pain+syndrome.">MicroRNAs may mediate the down-regulation of neurokinin-1 receptor in chronic bladder pain syndrome.</a> American Journal of Pathology. 176 (1), 288-303 (2010).</li></ol>

Während sich Ramesh et al. auf die Entwicklung von Strategien zur Verwendung der adenoviralen Transduktion bei der Behandlung von Blasenkrebs konzentrierten 18, haben neuere Berichte den Nutzen dieser Techniken bei der Untersuchung der normalen Urothelbiologie/-physiologie und Pathophysiologie gezeigt 10,18,19,20,21 . Zu den wichtigen ...

Das Urothel ist das spezialisierte Epithel, das das Nierenbecken, die Harnleiter, die Blase und die proximale Harnröhreauskleidet 1. Es besteht aus drei Schichten: einer Schicht hochdifferenzierter und polarisierter, oft zweikerniger Schirmzellen, deren apikale Oberflächen in Urin gebadet sind; eine intermediäre Zellschicht mit einer Population von zweikernigen transitamplifizierenden Zellen, die als Reaktion auf ihren akuten Verlust zu oberflächlichen Regenschirmzellen führen können; und eine einzelne Schicht von Basalzellen, von denen eine Teilmenge als Stammzellen fungiert, die das gesamte Urothel als Reaktion auf chronische Verletzungen regenerieren können. Regenschirmzellen sind hauptsächlich für die Bildung der hochresistenten Urothelbarriere verantwortlich, zu deren Bestandteilen eine apikale Membran (reich an Cholesterin und Cerebrosiden) mit geringer Durchlässigkeit für Wasser und gelöste Stoffe sowie ein hochresistenter apikaler Verbindungskomplex (bestehend aus Tight Junctions, Adherens Junctions, Desmosomen und einem zugehörigen Actomyosin-Ring) gehören1 . Sowohl die apikale Oberfläche der Regenschirmzelle als auch ihr Verbindungsring dehnen sich während der Blasenfüllung aus und kehren nach dem Entleeren von 1,2,3,4,5 schnell in ihren vorgefüllten Zustand zurück. Zusätzlich zu seiner Rolle in der Barrierefunktion wird angenommen, dass das Urothel auch sensorische und Wandlerfunktionen hat, die es ihm ermöglichen, Veränderungen im extrazellulären Milieu (z. B. Dehnung) zu erfassen und diese Informationen über die Freisetzung von Mediatoren (einschließlich ATP, Adenosin und Acetylcholin) an darunter liegende Gewebe zu übertragen, einschließlich suburothelialer afferenter Nervenprozesse 6,7,8 . Neuere Beweise für diese Rolle finden sich bei Mäusen, denen die urotheliale Expression von Piezo1 und Piezo2 fehlt, was zu einer veränderten Hohlraumfunktionführt 9. Darüber hinaus entwickeln Ratten, die das porenbildende Protein CLDN2 in der Regenschirmzellschicht überexprimieren, Entzündungen und Schmerzen, die denen bei Patienten mit interstitieller Zystitis entsprechen10. Es wird die Hypothese aufgestellt, dass eine Störung der urothelialen Sensorik/Transducer- oder Barrierefunktion zu mehreren Blasenstörungen beitragen kann 6,11.
Ein besseres Verständnis der Biologie des Urothels in normalen und Krankheitszuständen hängt von der Verfügbarkeit von Werkzeugen ab, die es den Forschern ermöglichen, die endogene Genexpression leicht herunterzuregulieren oder die Expression von Transgenen im nativen Gewebe zu ermöglichen. Während ein Ansatz zur Herunterregulierung der Genexpression darin besteht, bedingte Urothel-Knockout-Mäuse zu erzeugen, hängt dieser Ansatz von der Verfügbarkeit von Mäusen mit floxierten Allelen ab, ist arbeitsintensiv und kann Monate bis Jahre dauern, bis er abgeschlossen ist12. Es überrascht daher nicht, dass Forscher Techniken entwickelt haben, um das Urothel zu transfizieren oder zu transduzieren, was zu Ergebnissen auf einer kürzeren Zeitskala führen kann. Veröffentlichte Methoden zur Transfektion umfassen die Verwendung von kationischen Lipiden13, Antisense-phosphorothioierten Oligodesoxynukleotiden14 oder Antisense-Nukleinsäuren, die an das HIV-TAT-Protein gebunden sind, das das 11-mer-Peptid15 durchdringt. Der Schwerpunkt dieses Protokolls liegt jedoch auf der Verwendung der adenoviral-vermittelten Transduktion, einer gut untersuchten Methodik, die bei der Genabgabe an ein breites Spektrum von Zellen effizient ist, in zahlreichen klinischen Studien getestet wurde und zuletzt verwendet wurde, um die cDNA, die für das COVID-19-Kapsidprotein kodiert, an Empfänger einer Variante des COVID-19-Impfstoffs zu liefern16, 17. Sonstiges Für eine ausführlichere Beschreibung des Lebenszyklus des Adenovirus, der adenoviralen Vektoren und der klinischen Anwendungen von Adenoviren wird der Leser auf Referenz17 verwiesen.
Ein wichtiger Meilenstein bei der Verwendung von Adenoviren zur Transduktion des Urothels war ein Bericht von Ramesh et al., der zeigte, dass kurze Vorbehandlungen mit Detergenzien, einschließlich N-Dodecyl-β-D-Maltosid (DDM), die die Transduktion des Urothels durch ein Adenovirus, das für β-Galactosidase18 kodiert, dramatisch verbesserten. Unter Verwendung dieser Proof-of-Principle-Studie wurde nun die adenoviral vermittelte Transduktion des Urothels verwendet, um eine Vielzahl von Proteinen zu exprimieren, darunter GTPasen der Rab-Familie, Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren, Myosin-Motorfragmente, porenbildende Tight-Junction-assoziierte Claudine und ADAM17 10,19,20,21,22 . Derselbe Ansatz wurde angepasst, um kleine interferierende RNAs (siRNA) zu exprimieren, deren Effekte durch die Co-Expression von siRNA-resistenten Varianten des Transgens22 gerettet wurden. Das hier beschriebene Protokoll umfasst allgemeine Methoden zur Erzeugung großer Mengen hochkonzentrierter Adenoviren, eine Voraussetzung für diese Techniken, sowie Anpassungen der Methoden von Ramesh et al.18, um Transgene im Urothel mit hoher Effizienz zu exprimieren.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL pipette</td>
			<td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td>
			<td>CLS4488</td>
			<td>sterile, serological pipette, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mL ultracentrifuge tube</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>06-752</td>
			<td>PET thinwall ultracentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352097</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G needle</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>305196</td>
			<td>18 G x 1.5 in needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL pipette</td>
			<td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td>
			<td>CLS4489</td>
			<td>sterile, serological pipette, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352098</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipette</td>
			<td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td>
			<td>CLS4487</td>
			<td>sterile, serological pipette, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cavicide</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>6400012</td>
			<td>Anti-viral solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish - 15 cm</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>353025</td>
			<td>sterile, tissue-culture treated&#160; (150 mm x 25 mm dish)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>893.1832</td>
			<td>handle length 24 cm, blade length 1.7 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C-4306</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM culture medium (high glucose)</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11965092</td>
			<td>with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>EDS</td>
			<td>Bioiultra grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Hyclone (Cytiva)</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td>defined serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td>5.75 in glass pipette, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G-5516</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV catheter - mouse</td>
			<td>Smith Medical Jelco</td>
			<td>3063</td>
			<td>24 G x 3/4 in Safety IV catheter&#160; radiopaque</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV catheter - rat</td>
			<td>Smith Medical Jelco</td>
			<td>3060</td>
			<td>22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P-9541</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>Cell culture grade&#160; &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#8226;7 H2O</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>431478</td>
			<td>&#160;&#8805; 99.99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-dodecyl-&#946;-D-maltoside&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4641</td>
			<td>&#160;&#8805; 98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nose cone for multiple animals</td>
			<td>custom designed</td>
			<td></td>
			<td>commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-10 column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-085-01</td>
			<td>Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin antibiotic (100x)</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>15070063</td>
			<td>100x concentrated solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>BioPhotometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stand and clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-679Q and 05-769-8FQ</td>
			<td>available from numerous suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter unit</td>
			<td>Fisher Scientific (Nalgene)</td>
			<td>09-740-65B</td>
			<td>0.2 &#181;m rapid-flow filter unit (150 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter unit 0.2 &#181;m (syringe)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td>Millipore Sigma Milex 0.22 &#181;m filter unit that attaches to syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super speed centrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5810R</td>
			<td>with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1 mL)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>309628</td>
			<td>1-mL syringe Luer-lok tip - sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (3 mL)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>309656</td>
			<td>3-mL syringe slip tip - sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table-top centrifuge (low speed)</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5702</td>
			<td>with swinging bucket rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td>polyethylene 3.4 mL transfer pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>648310-M</td>
			<td>Molecular Biology grade&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE select protease solution</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>12604013</td>
			<td>TrypLE express enzyme (1x), no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-80 XP</td>
			<td>with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporizer&#160;</td>
			<td>General Anesthetic Services, Inc.</td>
			<td>Tec 3</td>
			<td>Isoflurane vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td>analog vortex mixer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of transgenes in native bladder urothelium using adenovirus-mediated transduction

Es wird angenommen, dass das Urothel, das das Nierenbecken, die Harnleiter, die Blase und die proximale Harnröhre auskleidet, nicht nur eine hochresistente Barriere bildet und Informationen über seine Umgebung an das darunter liegende Gewebe überträgt, wodurch die Entleerungsfunktion und das Verhalten gefördert werden. Eine Störung der Urothelbarriere oder ihrer sensorischen/Schallkopffunktion kann zu Erkrankungen führen. Die Untersuchung dieser komplexen Ereignisse wird durch das Fehlen einfacher Strategien zur Veränderung der Gen- und Proteinexpression im Urothel behindert. Hier werden Methoden beschrieben, die es den Forschern ermöglichen, große Mengen an Adenoviren mit hohem Titer zu erzeugen, die dann verwendet werden können, um Nagetier-Urothel mit hoher Effizienz und auf relativ einfache Weise zu transduzieren. Sowohl cDNAs als auch kleine interferierende RNAs können mittels adenoviraler Transduktion exprimiert werden, und der Einfluss der Transgenexpression auf die Urothelfunktion kann 12 h bis mehrere Tage später beurteilt werden. Diese Methoden haben eine breite Anwendbarkeit auf Studien der normalen und abnormalen Urothelbiologie unter Verwendung von Maus- oder Rattentiermodellen.

Vorbereitung auf Viren Ein Beispiel für die Virusreinigung durch Dichtegradientenzentrifugation ist in Abbildung 1A dargestellt. Das hellrosa Band, das sich an der Grenzfläche zwischen dem beladenen Zellmaterial und der 1,25 g/ml CsCl-Schicht befindet, besteht hauptsächlich aus zerrissenen Zellen und ihren Trümmern (siehe magentafarbener Pfeil in Abbildung 1A). Es leitet seine rosafarbene Farbe von der geringen Menge an Nährmedium ab, di...

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Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction

Es werden Methoden zur Erzeugung großer Mengen rekombinanter Adenoviren beschrieben, die dann zur Transduktion des nativen Nagetier-Urothels verwendet werden können, was die Expression von Transgenen oder die Herunterregulierung endogener Genprodukte ermöglicht.

Expression von Transgenen im nativen Blasenurothel mittels Adenovirus-vermittelter Transduktion

In addition to forming a high-resistance barrier, the urothelium lining the renal pelvis, ureters, bladder, and proximal urethra is hypothesized to sense ...

Dieses Protokoll beschreibt Methoden, die es den Forschern ermöglichen, CDNAs oder SIRNAs im nativen Blasenurothel zu exprimieren. Die Hauptvorteile dieser Technik sind ihre relative Einfachheit, die Fähigkeit, cDNAs, siRNAs im Urothel mit hoher Effizienz und innerhalb eines relativ kurzen Zeitraums zu exprimieren. Der schwierigste Teil dieser Technik ist die Katheterisierung.Die gesamte Technik ist jedoch relativ einfach zu beherrschen, wenn sie einmal erlernt ist. Das Verfahren wird von Giovanni Ruiz, einem Forschungsspezialisten IV in meinem Labor, demonstriert. Legen Sie zunächst die betäubte Maus auf ein Heizkissen neben den Nasenkegeln.Halten Sie das Tier für die Dauer des Protokolls unter Narkose. Vergewissern Sie sich, dass die Maus mit einer Zehenprise vollständig betäubt ist. Um zu verhindern, dass Luft in die Blase gelangt, füllen Sie den Kunststoffkatheterteil eines IV-Katheters und die zugehörige Nabe mit sterilem PBS mit einer sterilen Transferpipette oder Spritze.Wenn sich das Tier in Rückenlage befindet, tupfen Sie den äußeren Harnröhrengang mit 70% Alkohol ab. Greifen Sie dann vorsichtig nach dem Gewebe, das den äußeren Harnröhrengang bildet, und strecken Sie es mit einer feinen Pinzette senkrecht vom Tier weg. Führen Sie den sterilen Katheter in den äußeren Meatus ein.Führen Sie den Katheter mit der anderen Hand vorsichtig senkrecht etwa drei bis vier Millimeter in den Harnröhrengang ein. Senken Sie dann den Katheter, der in den äußeren Meatus eingeführt wird, in Richtung des Schwanzes des Tieres, was den Eintritt in den Teil der Harnröhre erleichtert, der unterhalb des Schambeins und schließlich in die Blase verläuft. Lassen Sie den Urin in der Blase austreten.Entfernen Sie den Restharn, indem Sie das Crede-Manöver ausführen, indem Sie den Blasenbuckel im Unterbauchbereich massieren und sanft nach unten drücken. Um das Urothel für die Transduktion empfänglich zu machen, waschen Sie die Maus- oder Rattenblase, indem Sie eine sterile Ein-Milliliter-Spritze, die mit PBS gefüllt ist, an der Katheternabe anbringen. Injizieren Sie 100 Mikroliter steriles PBS in die Mausblase.Nachdem Sie die Spritze von der Katheterverschraubung abgenommen haben, lassen Sie das PBS abtropfen. 100 Mikroliter 0,1%N-Dodecyl-beta-D-Maltosid, gelöst in PBS, und 0,2 Mikrometer Filter, sterilisiert in die Mausblase, werden mit einer sterilen Ein-Milliliter-Spritze sterilisiert. Halten Sie das N-Dodecyl-beta-D-Maltosid 10 Minuten lang in der Blase, indem Sie die Spritze an Ort und Stelle lassen.Entfernen Sie das N-Dodecyl-beta-D-Maltosid aus der Blase, indem Sie die Spritze abnehmen und abtropfen lassen. Um das Virus in die Blase einzuführen, befestigen Sie eine sterile Ein-Milliliter-Spritze an der Katheternabe und träufeln Sie 5.000.000 bis 100.000.000 IVP Adenovirus, verdünnt in 100 Mikrolitern sterilem PBS für Mäuse oder 450 Mikroliter für Ratten, in die Blase ein. Nehmen Sie nach 30 Minuten die Spritze ab und lassen Sie die Viruslösung die Blase auf ein Einwegkissen evakuieren.Tupfen Sie alle Restvirenlösung mit einem saugfähigen Tuch ab, während Sie das Pad entsorgen, und wischen Sie biologisch gefährliche Abfälle ab. Damit sich das Tier erholen kann, stoppen Sie den Fluss von Isofluran. Lassen Sie das Tier sich erholen und vollständig mobil sein, bevor Sie es in seinen Käfig zurückbringen, insbesondere wenn die Tiere in einer Gruppe untergebracht sind.Analysieren Sie die Auswirkungen der Transgenexpression 12 bis 72 Stunden nach der Behandlung mit Methoden wie mRNA-in-situ-Hybridisierung, Western Blot oder Immunfluoreszenz. Die Western-Blot-Analyse von Urothellysaten ergab eine V5-markierte Expression des menschlichen Wachstumshormons im Urothel der transduzierten Blasen, nicht jedoch in den nicht transduzierten. Die Expression wurde auch durch Immunfluoreszenz unter Verwendung von Antikörpern bestätigt, die das menschliche Wachstumshormon oder das V5-Epitop-Tag erkannten.Die Western-Blot-Analyse bestätigte die Expression von Claudin-2 bei Ratten, die mit Adenovirus transduziert wurden, jedoch nicht bei solchen, die mit einem kontrollierten GFP-kodierenden Virus transduziert wurden. Die Immunfluoreszenzanalyse bestätigte außerdem die exogene Claudin-2-Expression in Urothel-Umbrella-Zellen, die mit viruskodierender Claudin-2-cDNA transduziert wurden. Der Nachweis von exogenem Claudin-2 im Tight Junction Protein 1 durch Immunfluoreszenz und konfokale Mikroskopie des gesamten montierten oder im Querschnitt geschnittenen Urothels zeigte das Vorhandensein von Tight Junction und intrazellulären Akkumulationen von Claudin-2 im Zellzytoplasma.Das Bildfeld zeigt, dass die Zählung der Anzahl der transduzierten Regenschirmzellen eine Effizienz von fast 95% zeigt, und in der gesamten Blasenwand wird nur das Urothel transduziert, und kein anderes Gewebe wird vom eingeträufelten Adenovirus angegriffen. Die Katheterisierung ist entscheidend, damit das Protokoll wie beabsichtigt funktioniert. Diese Technik ermöglicht es den Forschern, die normale Urothelbiologie zu untersuchen und Bedingungen zu verstehen, bei denen eine Über- oder Unterexpression von Proteinen zu Krankheiten führt.

Research

JoVE Journal

Biology

Targeted Expression of GFP in the Hair Follicle Using Ex Vivo Viral Transduction

Gezielte Expression von GFP in den Haarfollikel mit Ex Vivo viralen Transduktion

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft ...

Forschung

Biologie

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Detection of Protein Ubiquitination

Detektion von Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Mit dem Gene Pulser MXcell Elektroporation System zur Primary Cells mit hohem Wirkungsgrad zu transfizieren

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Verwendung eines automatisierten Cell Counter zu Genexpressionsstudien Simplify: siRNA Knockdown von IL-4 abhängige Genexpression in Namalwalzellen

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

Adenovirus-vermittelte genetische Entfernung von Signalmolekülen in kultivierten primären embryonalen Maus-Fibroblasten

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Rekonstitution der Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Genetisch kodierte Molecular Probes, um G-Protein-gekoppelte Rezeptoren Studieren

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Proteomik Probenvorbereitung von Formalin fixiert und in Paraffin eingebetteten Gewebe

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...