Name: expression of transgenes in native bladder urothelium using adenovirus-mediated transduction
Uploaded: 2022-10-06T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי פרס פרויקט פיילוט באמצעות P30DK079307 (ל- M.G.D.), מענק NIH R01DK119183 (ל- G.A. ו- M.D.C.), מענק NIH R01DK129473 (ל- G.A.), פרס פיתוח קריירה של האגודה האמריקאית לאורולוגיה ומענק קרן וינטרס (ל- N.M.), על ידי פיזיולוגיה של התא וליבות הדמיית כליות של אורגניזמים מודל של מרכז פיטסבורג לחקר הכליות (P30DK079307), ועל ידי S10OD028596 (ל-G.A.), שמימנה את רכישת המערכת הקונפוקלית ששימשה ללכידת חלק מהתמונות המוצגות בכתב יד זה.

ניסויים הכוללים ייצור של אדנווירוסים, הדורשים אישור BSL2, בוצעו תחת אישור של משרדי הבריאות והבטיחות הסביבתית באוניברסיטת פיטסבורג והוועדה המוסדית לבטיחות ביולוגית. כל הניסויים בבעלי חיים שבוצעו, כולל התמרה אדנו-ויראלית (הדורשת אישור ABSL2), נעשו בהתאם להנחיות/תקנות הרלוונטיות של מדיניות שיר?...

<ol>
	<li>Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Urothelium:+Life+in+a+liquid+environment.">The Urothelium: Life in a liquid environment.</a> Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).</li><li>Truschel, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-regulated+exocytosis/endocytosis+in+bladder+umbrella+cells.">Stretch-regulated exocytosis/endocytosis in bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (3), 830-846 (2002).</li><li>Lewis, S. A., de Moura, J. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+cytoplasmic+vesicles+into+apical+membrane+of+mammalian+urinary+bladder+epthelium.">Incorporation of cytoplasmic vesicles into apical membrane of mammalian urinary bladder epthelium.</a> Nature (London). 297 (5868), 685-688 (1982).</li><li>Eaton, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+contraction+of+the+umbrella+cell+apical+junctional+ring+in+response+to+bladder+filling+and+voiding.">Expansion and contraction of the umbrella cell apical junctional ring in response to bladder filling and voiding.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (16), 2037-2052 (2019).</li><li>Yu, W., Khandelwal, P., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+apical+and+basolateral+membrane+requirements+for+stretch-induced+membrane+traffic+at+the+apical+surface+of+bladder+umbrella+cells.">Distinct apical and basolateral membrane requirements for stretch-induced membrane traffic at the apical surface of bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (1), 282-295 (2009).</li><li>Birder, L., Andersson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+signaling.">Urothelial signaling.</a> Physiological Reviews. 93 (2), 653-680 (2013).</li><li>Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+bladder,+cystitis+and+nerve/urothelial+interactions.">Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions.</a> Autonomic Neuroscience. 182, 89-94 (2014).</li><li>Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+uroepithelial-associated+sensory+web.">The uroepithelial-associated sensory web.</a> Kidney International. 72 (9), 1057-1064 (2007).</li><li>Dalghi, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+for+PIEZO1+and+PIEZO2+in+urothelial+mechanotransduction+and+lower+urinary+tract+interoception.">Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (19), 152984 (2021).</li><li>Montalbetti, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+urothelial+paracellular+transport+promotes+cystitis.">Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis.</a> American Journal of Physiology: Renal Physiology. 309 (12), 1070-1081 (2015).</li><li>Keay, S. K., Birder, L. A., Chai, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+bladder+urothelial+pathophysiology+in+functional+bladder+disorders.">Evidence for bladder urothelial pathophysiology in functional bladder disorders.</a> BioMed Research International. 2014, 865463 (2014).</li><li>Friedel, R. H., Wurst, W., Wefers, B., Kuhn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+conditional+knockout+mice.">Generating conditional knockout mice.</a> Methods in Molecular Biology. 693, 205-231 (2011).</li><li>Kashyap, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+nerve+growth+factor+expression+in+the+bladder+by+antisense+oligonucleotides+as+new+treatment+for+overactive+bladder.">Down-regulation of nerve growth factor expression in the bladder by antisense oligonucleotides as new treatment for overactive bladder.</a> Journal of Urology. 190 (2), 757-764 (2013).</li><li>Bolenz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+and+ex+vivo+urothelial+penetration+by+oligodeoxynucleotides+for+optimizing+treatment+of+transitional+cell+carcinoma.">Cellular uptake and ex vivo urothelial penetration by oligodeoxynucleotides for optimizing treatment of transitional cell carcinoma.</a> Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 30 (5), 265-273 (2008).</li><li>Tyagi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravesical+antisense+therapy+for+cystitis+using+TAT-peptide+nucleic+acid+conjugates.">Intravesical antisense therapy for cystitis using TAT-peptide nucleic acid conjugates.</a> Molecular Pharmaceutics. 3 (4), 398-406 (2006).</li><li>Sadoff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interim+results+of+a+phase+1-2a+trial+of+Ad26.COV2.S+Covid-19+vaccine.">Interim results of a phase 1-2a trial of Ad26.COV2.S Covid-19 vaccine.</a> New England Journal of Medicine. 384 (19), 1824-1835 (2021).</li><li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+delivery:+Potential+applications+for+gene+and+cell-Based+therapies+in+the+new+era+of+personalized+medicine.">Adenovirus-mediated gene delivery: Potential applications for gene and cell-Based therapies in the new era of personalized medicine.</a> Genes &amp; Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).</li><li>Ramesh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+pretreatment+agents+to+enhance+adenovirus+infection+of+bladder+epithelium.">Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium.</a> Molecular Therapy. 10 (4), 697-705 (2004).</li><li>Khandelwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab11a-dependent+exocytosis+of+discoidal/fusiform+vesicles+in+bladder+umbrella+cells.">Rab11a-dependent exocytosis of discoidal/fusiform vesicles in bladder umbrella cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15773-15778 (2008).</li><li>Khandelwal, P., Ruiz, W. G., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+endocytosis+in+bladder+umbrella+cells+occurs+through+an+integrin-regulated+and+RhoA-+and+dynamin-dependent+pathway.">Compensatory endocytosis in bladder umbrella cells occurs through an integrin-regulated and RhoA- and dynamin-dependent pathway.</a> The European Molecular Biology Organization journal. 29 (12), 1961-1975 (2010).</li><li>Khandelwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rab11a-Rab8a-Myo5B+network+promotes+stretch-regulated+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells.">A Rab11a-Rab8a-Myo5B network promotes stretch-regulated exocytosis in bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 24 (7), 1007-1019 (2013).</li><li>Prakasam, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A1+adenosine+receptor-stimulated+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells+requires+phosphorylation+of+ADAM17+Ser811+and+EGF+receptor+transactivation.">A1 adenosine receptor-stimulated exocytosis in bladder umbrella cells requires phosphorylation of ADAM17 Ser811 and EGF receptor transactivation.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3798-3812 (2014).</li><li>Gallo, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAB27B+requirement+for+stretch-induced+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells.">RAB27B requirement for stretch-induced exocytosis in bladder umbrella cells.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 314 (3), 349-365 (2018).</li><li>Amasheh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-2+expression+induces+cation-selective+channels+in+tight+junctions+of+epithelial+cells.">Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 115, 4969-4976 (2002).</li><li>Yu, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+cation+selectivity+in+claudin-2-based+paracellular+pores:+identification+of+an+electrostatic+interaction+site.">Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: identification of an electrostatic interaction site.</a> The Journal of General Physiology. 133 (1), 111-127 (2009).</li><li>Kasahara, H., Aoki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+using+adenoviral+RNAi+vector+in+vascular+smooth+muscle+cells+and+cardiomyocytes.">Gene silencing using adenoviral RNAi vector in vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes.</a> Methods in Molecular Medicine. 112, 155-172 (2005).</li><li>Bolognesi, B., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaching+the+limit.">Reaching the limit.</a> eLife. 7, 39804 (2018).</li><li>Atasheva, S., Shayakhmetov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+responses+to+adenovirus+and+adenovirus+vectors.">Cytokine responses to adenovirus and adenovirus vectors.</a> Viruses. 14 (5), 888 (2022).</li><li>Sanchez Freire, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+may+mediate+the+down-regulation+of+neurokinin-1+receptor+in+chronic+bladder+pain+syndrome.">MicroRNAs may mediate the down-regulation of neurokinin-1 receptor in chronic bladder pain syndrome.</a> American Journal of Pathology. 176 (1), 288-303 (2010).</li></ol>

בעוד ראמש ועמיתיו התמקדו בפיתוח אסטרטגיות לשימוש בהתמרה אדנו-ויראלית בטיפול בסרטן שלפוחית השתן 18, דיווחים עדכניים יותר הדגימו את התועלת של טכניקות אלה בחקר ביולוגיה / פיזיולוגיה של דרכי השתן ופתופיזיולוגיה תקינה 10,18,19,20,21...

האורותל הוא אפיתל מיוחד המרפד את אגן הכליה, השופכנים, שלפוחית השתן והשופכה הפרוקסימלית1. הוא מורכב משלוש שכבות: שכבה של תאי מטריה ממוינים ומקוטבים מאוד, לעתים קרובות דו-גרעיניים, שפני השטח האפיקליים שלהם שטופים בשתן; שכבת תאי ביניים עם אוכלוסייה של תאים מגבירי מעבר דו-גרעיניים שיכולים ליצור תאי מטריה שטחיים בתגובה לאובדנם החריף; ושכבה אחת של תאי בסיס, תת-קבוצה שלהם מתפקדים כתאי גזע שיכולים לחדש את כל דרכי השתן בתגובה לפגיעה כרונית. תאי מטריה אחראים בעיקר ליצירת מחסום דרכי השתן בעל העמידות הגבוהה, שמרכיביו כוללים קרום אפיקלי (עשיר בכולסטרול וצרברוזידים) בעל חדירות נמוכה למים ולמומסים, וקומפלקס צמתים אפיקלי בעל עמידות גבוהה (המורכב מצמתים הדוקים, צמתים נצמדים, דסמוזומים וטבעת אקטומיוזין קשורה)1 . הן פני השטח האפיקליים של תא המטריה והן טבעת הצומת שלו מתרחבים במהלך מילוי שלפוחית השתן וחוזרים למצבם המלא מראש במהירות לאחר התרוקנות 1,2,3,4,5. בנוסף לתפקידו בתפקוד המחסום, משערים כי לאורותלים יש גם תפקודי חישה ומתמרים המאפשרים לו לחוש שינויים בסביבה החוץ-תאית (למשל, מתיחה) ולהעביר מידע זה באמצעות שחרור מתווכים (כולל ATP, אדנוזין ואצטילכולין) לרקמות הבסיסיות,כולל תהליכים עצביים תת-אורותליים 6,7,8 . עדויות עדכניות לתפקיד זה נמצאות בעכברים חסרי ביטוי דרכי השתן הן של Piezo1 והן של Piezo2, מה שגורם לשינוי בפונקציית ההתרוקנות9. בנוסף, חולדות המבטאות יתר על המידה את החלבון CLDN2 יוצר הנקבוביות בשכבת תאי המטריה מפתחות דלקת וכאב דומים לאלה שנצפו בחולים עם דלקת שלפוחית השתן אינטרסטיציאלית10. משערים כי הפרעה בתפקוד החושי/מתמר או מחסום דרכי השתן עשויה לתרום למספר הפרעות בשלפוחית השתן 6,11.
הבנה טובה יותר של הביולוגיה של השתן במצבים נורמליים ובמצבי מחלה תלויה בזמינותם של כלים שיאפשרו לחוקרים להפחית בקלות את ביטוי הגנים האנדוגניים או לאפשר ביטוי של טרנסגנים ברקמה הטבעית. בעוד שגישה אחת להפחתת ויסות ביטוי גנים היא יצירת עכברי נוקאאוט מותנים של דרכי השתן, גישה זו תלויה בזמינות של עכברים עם אללים פלוקסדיים, היא אינטנסיבית ויכולה להימשך חודשים עד שנים כדי להשלים12. באופן לא מפתיע, אם כן, חוקרים פיתחו טכניקות להדביק או להתמיר את האורותל, מה שיכול להוביל לתוצאות בטווח זמן קצר יותר. שיטות שפורסמו לטרנספקציה כוללות שימוש בשומנים קטיוניים13, אוליגודאוקסינוקלאוטידים אנטי-סנס 14, או חומצות גרעין אנטיסנס הקשורות לחלבון HIV TAT החודר לפפטיד 11-mer15. עם זאת, המוקד של פרוטוקול זה הוא על השימוש בטרנסדוקציה בתיווך אדנובירל, מתודולוגיה נחקרת היטב היעילה בהעברת גנים למגוון רחב של תאים, נבדקה בניסויים קליניים רבים, ולאחרונה שימשה להעברת cDNA המקודד את חלבון הקפסיד COVID-19 למקבלי גרסה אחת של חיסון COVID-1916, 17. לתיאור מעמיק יותר של מחזור החיים של אדנווירוס, וקטורים אדנו-ויראליים ויישומים קליניים של אדנווירוסים, הקורא מופנה להפניה17.
אבן דרך חשובה בשימוש באדנו-וירוסים להעברת האורותל, הייתה דו"ח של Ramesh et al. שהראה טיפולים מקדימים קצרים עם דטרגנטים, כולל N-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) שיפור דרמטי בהתמרה של האורותליום על ידי אדנווירוס המקודד β-גלקטוזידאז18. באמצעות מחקר הוכחת עיקרון זה כמדריך, התמרה בתיווך אדנובירל של האורותליום שימשה כעת לביטוי מגוון חלבונים, כולל GTPases ממשפחת ראב, גורמי חילוף גואנין-נוקלאוטידים, שברי מנוע מיוזין, קלאודינים הקשורים לצומת הדוק יוצרי נקבוביות, ו- ADAM17 10,19,20,21,22 . אותה גישה הותאמה לבטא רנ"א מפריע קטן (siRNA), שהשפעותיו ניצלו על ידי ביטוי משותף של גרסאות עמידות ל-siRNA של הטרנסגן22. הפרוטוקול המתואר כאן כולל שיטות כלליות ליצירת כמויות גדולות של אדנו-וירוס מרוכז מאוד, דרישה לטכניקות אלה, כמו גם התאמות של השיטות של Ramesh et al.18 כדי לבטא טרנסגנים באורותליום ביעילות גבוהה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL pipette</td>
			<td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td>
			<td>CLS4488</td>
			<td>sterile, serological pipette, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mL ultracentrifuge tube</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>06-752</td>
			<td>PET thinwall ultracentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352097</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G needle</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>305196</td>
			<td>18 G x 1.5 in needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL pipette</td>
			<td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td>
			<td>CLS4489</td>
			<td>sterile, serological pipette, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352098</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipette</td>
			<td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td>
			<td>CLS4487</td>
			<td>sterile, serological pipette, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cavicide</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>6400012</td>
			<td>Anti-viral solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish - 15 cm</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>353025</td>
			<td>sterile, tissue-culture treated&#160; (150 mm x 25 mm dish)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>893.1832</td>
			<td>handle length 24 cm, blade length 1.7 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C-4306</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM culture medium (high glucose)</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11965092</td>
			<td>with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>EDS</td>
			<td>Bioiultra grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Hyclone (Cytiva)</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td>defined serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td>5.75 in glass pipette, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G-5516</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV catheter - mouse</td>
			<td>Smith Medical Jelco</td>
			<td>3063</td>
			<td>24 G x 3/4 in Safety IV catheter&#160; radiopaque</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV catheter - rat</td>
			<td>Smith Medical Jelco</td>
			<td>3060</td>
			<td>22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P-9541</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>Cell culture grade&#160; &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#8226;7 H2O</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>431478</td>
			<td>&#160;&#8805; 99.99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-dodecyl-&#946;-D-maltoside&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4641</td>
			<td>&#160;&#8805; 98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nose cone for multiple animals</td>
			<td>custom designed</td>
			<td></td>
			<td>commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-10 column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-085-01</td>
			<td>Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin antibiotic (100x)</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>15070063</td>
			<td>100x concentrated solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>BioPhotometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stand and clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-679Q and 05-769-8FQ</td>
			<td>available from numerous suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter unit</td>
			<td>Fisher Scientific (Nalgene)</td>
			<td>09-740-65B</td>
			<td>0.2 &#181;m rapid-flow filter unit (150 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter unit 0.2 &#181;m (syringe)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td>Millipore Sigma Milex 0.22 &#181;m filter unit that attaches to syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super speed centrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5810R</td>
			<td>with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1 mL)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>309628</td>
			<td>1-mL syringe Luer-lok tip - sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (3 mL)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>309656</td>
			<td>3-mL syringe slip tip - sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table-top centrifuge (low speed)</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5702</td>
			<td>with swinging bucket rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td>polyethylene 3.4 mL transfer pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>648310-M</td>
			<td>Molecular Biology grade&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE select protease solution</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>12604013</td>
			<td>TrypLE express enzyme (1x), no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-80 XP</td>
			<td>with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporizer&#160;</td>
			<td>General Anesthetic Services, Inc.</td>
			<td>Tec 3</td>
			<td>Isoflurane vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td>analog vortex mixer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of transgenes in native bladder urothelium using adenovirus-mediated transduction

בנוסף ליצירת מחסום בעל התנגדות גבוהה, משערים כי השתן המצפה את אגן הכליה, השופכנים, שלפוחית השתן והשופכה הפרוקסימלית חש ומעביר מידע על סביבתו לרקמות שמתחתיו, ומקדם תפקוד והתנהגות של התרוקנות. הפרעה במחסום דרכי השתן, או בתפקוד החושי/מתמר שלו, עלולה להוביל למחלה. חקר האירועים המורכבים האלה נפגע בשל היעדר אסטרטגיות פשוטות לשינוי ביטוי גנים וחלבונים באורותל. מתוארות כאן שיטות המאפשרות לחוקרים לייצר כמויות גדולות של אדנו-וירוס בעל טיטר גבוה, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בו כדי להפוך מכרסם אורותל ביעילות גבוהה, ובאופן פשוט יחסית. הן cDNA והן RNA מפריע קטן יכולים לבוא לידי ביטוי באמצעות התמרה אדנו-ויראלית, ואת ההשפעה של ביטוי טרנסגנים על תפקוד דרכי השתן ניתן להעריך 12 שעות עד כמה ימים מאוחר יותר. לשיטות אלה ישימות רחבה במחקרים של ביולוגיה נורמלית ולא תקינה של דרכי השתן באמצעות מודלים של חיות עכבר או חולדה.

הכנת וירוסים דוגמה לטיהור וירוסים על-ידי צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות מוצגת באיור 1A. הפס הוורוד בהיר, שנמצא בממשק של החומר התאי הטעון ושכבת CsCl של 1.25 גרם/מ"ל, מורכב בעיקר מתאים משובשים והפסולת שלהם (ראו חץ מגנטה באיור 1A). צבעו הוורדרד שואב מהכמות הקט?...

Watch this Scientific Journal Video about Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction at JoVE.com

Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction

שיטות מתוארות ליצירת כמויות גדולות של אדנו-וירוסים רקומביננטיים, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בהם כדי להתמיר את המכרסם המקומי urothelium המאפשר ביטוי של transgenes או downregulation של תוצרי גנים אנדוגניים.

ביטוי טרנסגנים באורותליום טבעי של שלפוחית השתן באמצעות התמרה בתיווך אדנו-וירוס

In addition to forming a high-resistance barrier, the urothelium lining the renal pelvis, ureters, bladder, and proximal urethra is hypothesized to sense ...

פרוטוקול זה מתאר שיטות המאפשרות לחוקרים לבטא CDNA או SIRNA באורותל שלפוחית השתן הטבעי. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם הפשטות היחסית שלה, היכולת לבטא cDNAs, siRNAs באורותל ביעילות גבוהה, ובתוך פרק זמן קצר יחסית. החלק הקשה ביותר בטכניקה זו הוא הצנתור.עם זאת, קל יחסית לשלוט בטכניקה הכוללת לאחר שנלמדה. מי שידגים את ההליך יהיה ג'ובאני רואיז, מומחה מחקר IV במעבדה שלי. כדי להתחיל, הניחו את העכבר המורדם על כרית חימום ליד קונוסים באף.יש לשמור על בעל החיים תחת הרדמה למשך כל תקופת הפרוטוקול. ודא שהעכבר מורדם לחלוטין עם צביטת בוהן. כדי למנוע החדרת אוויר לשלפוחית השתן, מלא את חלק הצנתר הפלסטי של צנתר IV ואת הרכזת המשויכת אליו עם PBS סטרילי באמצעות פיפטה או מזרק העברה סטרילית.כאשר בעל החיים במצב שכיבה מקלון את בשר השופכה החיצוני עם 70% אלכוהול. לאחר מכן תפסו בעדינות את הרקמה היוצרת את בשר השופכה החיצוני והרחיבו אותו אנכית הרחק מהחיה באמצעות מלקחיים עדינים. מחדירים את הצנתר הסטרילי לתוך הבשר החיצוני.בעזרת היד השנייה מחדירים בזהירות את הצנתר במאונך כשלושה עד ארבעה מילימטרים לתוך בשר השופכה. לאחר מכן מורידים את הצנתר המוחדר לבשר החיצוני לכיוון זנב החיה, מה שמקל על כניסתו לחלק של השופכה שעובר מתחת לעצם הערווה ובסופו של דבר לתוך שלפוחית השתן. יש לאפשר לשתן בשלפוחית השתן לדלוף החוצה.הסר שאריות שתן על ידי ביצוע התמרון של Crede על ידי עיסוי ולחץ עדין כלפי מטה על בליטת שלפוחית השתן באזור הבטן התחתונה. כדי להפוך את השתן פתוח להתמרה, שטפו את העכבר או שלפוחית השתן של החולדה על ידי חיבור מזרק סטרילי של מיליליטר אחד מלא PBS למרכז הצנתר. הזריקו 100 מיקרוליטר של PBS סטרילי לשלפוחית השתן של העכבר.לאחר ניתוק המזרק מהתאמת הצנתר, יש לאפשר ל-PBS להתנקז. להחדיר 100 מיקרוליטר של 0.1%N-דודציל-בטא-D-מלטוזיד מומס PBS ומסנן 0.2 מיקרומטר מעוקר לתוך שלפוחית העכבר באמצעות מזרק סטרילי של מיליליטר. שמור את N-dodecyl-beta-D-maltoside בשלפוחית השתן במשך 10 דקות על ידי השארת המזרק במקומו.הסר את N-דודציל-בטא-D-מלטוזיד משלפוחית השתן על ידי ניתוק המזרק ולאפשר לו להתנקז החוצה. כדי להכניס את הנגיף לשלפוחית השתן לחבר מזרק סטרילי של מיליליטר לרכזת הצנתר ולהחדיר 5, 000, 000 עד 100, 000, 000 IVP של אדנווירוס מדולל ב 100 מיקרוליטר של PBS סטרילי עבור עכברים, או 450 מיקרוליטר עבור חולדות לתוך שלפוחית השתן. לאחר 30 דקות, נתקו את המזרק ואפשרו לתמיסת הנגיף לפנות את שלפוחית השתן אל פד חד פעמי.יש להכתים כל תמיסת וירוס שארית עם מגבון סופג תוך השלכת הפד ולנגב בפסולת מסוכנת ביולוגית. על מנת לאפשר לחיה להתאושש, להפסיק את זרימת isoflurane. אפשרו לבעל החיים להתאושש ולהיות נייד לחלוטין לפני החזרתו לכלוב שלו, במיוחד אם בעלי החיים נמצאים בקבוצה.לנתח את ההשפעות של ביטוי טרנסגנים 12 עד 72 שעות לאחר הטיפול באמצעות שיטות כגון mRNA באתרו הכלאה, כתם מערבי, או immunofluorescence. ניתוח כתם מערבי של ליזטים של דרכי השתן גילה ביטוי הורמון גדילה אנושי המתויג V5 באורותל של שלפוחית השתן, אך לא באלה שלא עברו טרנספורמציה. הביטוי אושר גם על ידי immunofluorescence באמצעות נוגדנים שזיהו הורמון גדילה אנושי, או תג אפיטופ V5.ניתוח כתמים מערביים אישר את הביטוי של Claudin-2 בחולדות שהומרו עם אדנווירוס, אך לא באלה שהותמרו עם וירוס מקודד GFP מבוקר. ניתוח אימונופלואורסנציה אישר עוד יותר ביטוי אקסוגני של Claudin-2 בתאי מטריה של דרכי השתן שהומרו עם Claudin-2 cDNA המקודד לנגיף. זיהוי של Claudin-2 אקסוגני בחלבון Tight Junction Protein 1 על ידי אימונופלואורסצנטיות ומיקרוסקופ קונפוקלי של אורותל שלם רכוב או חתך חשף נוכחות של צומת הדוק והצטברות תוך תאית של Claudin-2 בציטופלסמה של התא.שדה התמונה מראה כי ספירת מספר תאי המטריה המומרים מגלה יעילות המתקרבת ל -95% ובכל דופן שלפוחית השתן רק השתן מומרת, ואף רקמה אחרת אינה ממוקדת על ידי אדנווירוס המוחדר. הצנתור הוא קריטי כדי שהפרוטוקול יעבוד כמתוכנן. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לחקור ביולוגיה תקינה של דרכי השתן, כמו גם להבין מצבים שבהם ביטוי יתר של חלבונים, או תת-ביטוי, מוביל למחלות.

Research

JoVE Journal

Biology

Targeted Expression of GFP in the Hair Follicle Using Ex Vivo Viral Transduction

ביטוי ממוקד של ה-GFP ב זקיק השיער באמצעות אקס התמרה Vivo ויראלי

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Detection of Protein Ubiquitination

זיהוי של חלבון Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

שימוש ג&#39;ין Pulser מערכת MXcell electroporation כדי Transfect תאים ראשוניים עם יעילות גבוהה

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

שימוש מונה תא אוטומטי כדי לפשט את הביטוי מחקרים ג&#39;ין: siRNA מציאה הביטוי IL 4-Gene תלויים תאים Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

Adenovirus בתיווך הסרת גנטית של מולקולות איתות ב Cultured Fibroblasts עכבר ראשיים עובריים

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

ב הכינון במבחנה של ט פעילים castaneum שהטלומרז

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

בדיקות מולקולריות גנטי מקודדות לחקר רצפטורים מצמידים חלבון G

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

לדוגמא הכנת proteomic מפורמלין קבועה ורקמות פרפין Embedded

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...