Name: expression of transgenes in native bladder urothelium using adenovirus-mediated transduction
Uploaded: 2022-10-06T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da un progetto pilota attraverso P30DK079307 (a M.G.D.), NIH grant R01DK119183 (a G.A. e MDC), NIH grant R01DK129473 (a G.A.), un premio per lo sviluppo della carriera dell'American Urology Association e una sovvenzione della Winters Foundation (a NM), dal Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores del Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307), e da S10OD028596 (a G.A.), che ha finanziato l'acquisto del sistema confocale utilizzato per catturare alcune delle immagini presentate in questo manoscritto.

Gli esperimenti che coinvolgono la generazione di adenovirus, che richiede la certificazione BSL2, sono stati eseguiti sotto l'approvazione degli uffici di salute e sicurezza ambientale dell'Università di Pittsburgh e del Comitato istituzionale per la biosicurezza. Tutti gli esperimenti sugli animali eseguiti, compresa la trasduzione adenovirale (che richiede la certificazione ABSL2), sono stati condotti in conformità con le linee guida / regolamenti pertinenti della politica del servizio sanitario pubblico sulla cura ...

<ol>
	<li>Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Urothelium:+Life+in+a+liquid+environment.">The Urothelium: Life in a liquid environment.</a> Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).</li><li>Truschel, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-regulated+exocytosis/endocytosis+in+bladder+umbrella+cells.">Stretch-regulated exocytosis/endocytosis in bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (3), 830-846 (2002).</li><li>Lewis, S. A., de Moura, J. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+cytoplasmic+vesicles+into+apical+membrane+of+mammalian+urinary+bladder+epthelium.">Incorporation of cytoplasmic vesicles into apical membrane of mammalian urinary bladder epthelium.</a> Nature (London). 297 (5868), 685-688 (1982).</li><li>Eaton, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+contraction+of+the+umbrella+cell+apical+junctional+ring+in+response+to+bladder+filling+and+voiding.">Expansion and contraction of the umbrella cell apical junctional ring in response to bladder filling and voiding.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (16), 2037-2052 (2019).</li><li>Yu, W., Khandelwal, P., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+apical+and+basolateral+membrane+requirements+for+stretch-induced+membrane+traffic+at+the+apical+surface+of+bladder+umbrella+cells.">Distinct apical and basolateral membrane requirements for stretch-induced membrane traffic at the apical surface of bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (1), 282-295 (2009).</li><li>Birder, L., Andersson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+signaling.">Urothelial signaling.</a> Physiological Reviews. 93 (2), 653-680 (2013).</li><li>Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+bladder,+cystitis+and+nerve/urothelial+interactions.">Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions.</a> Autonomic Neuroscience. 182, 89-94 (2014).</li><li>Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+uroepithelial-associated+sensory+web.">The uroepithelial-associated sensory web.</a> Kidney International. 72 (9), 1057-1064 (2007).</li><li>Dalghi, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+for+PIEZO1+and+PIEZO2+in+urothelial+mechanotransduction+and+lower+urinary+tract+interoception.">Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (19), 152984 (2021).</li><li>Montalbetti, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+urothelial+paracellular+transport+promotes+cystitis.">Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis.</a> American Journal of Physiology: Renal Physiology. 309 (12), 1070-1081 (2015).</li><li>Keay, S. K., Birder, L. A., Chai, T. 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G., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+endocytosis+in+bladder+umbrella+cells+occurs+through+an+integrin-regulated+and+RhoA-+and+dynamin-dependent+pathway.">Compensatory endocytosis in bladder umbrella cells occurs through an integrin-regulated and RhoA- and dynamin-dependent pathway.</a> The European Molecular Biology Organization journal. 29 (12), 1961-1975 (2010).</li><li>Khandelwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rab11a-Rab8a-Myo5B+network+promotes+stretch-regulated+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells.">A Rab11a-Rab8a-Myo5B network promotes stretch-regulated exocytosis in bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 24 (7), 1007-1019 (2013).</li><li>Prakasam, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A1+adenosine+receptor-stimulated+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells+requires+phosphorylation+of+ADAM17+Ser811+and+EGF+receptor+transactivation.">A1 adenosine receptor-stimulated exocytosis in bladder umbrella cells requires phosphorylation of ADAM17 Ser811 and EGF receptor transactivation.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3798-3812 (2014).</li><li>Gallo, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAB27B+requirement+for+stretch-induced+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells.">RAB27B requirement for stretch-induced exocytosis in bladder umbrella cells.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 314 (3), 349-365 (2018).</li><li>Amasheh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-2+expression+induces+cation-selective+channels+in+tight+junctions+of+epithelial+cells.">Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 115, 4969-4976 (2002).</li><li>Yu, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+cation+selectivity+in+claudin-2-based+paracellular+pores:+identification+of+an+electrostatic+interaction+site.">Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: identification of an electrostatic interaction site.</a> The Journal of General Physiology. 133 (1), 111-127 (2009).</li><li>Kasahara, H., Aoki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+using+adenoviral+RNAi+vector+in+vascular+smooth+muscle+cells+and+cardiomyocytes.">Gene silencing using adenoviral RNAi vector in vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes.</a> Methods in Molecular Medicine. 112, 155-172 (2005).</li><li>Bolognesi, B., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaching+the+limit.">Reaching the limit.</a> eLife. 7, 39804 (2018).</li><li>Atasheva, S., Shayakhmetov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+responses+to+adenovirus+and+adenovirus+vectors.">Cytokine responses to adenovirus and adenovirus vectors.</a> Viruses. 14 (5), 888 (2022).</li><li>Sanchez Freire, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+may+mediate+the+down-regulation+of+neurokinin-1+receptor+in+chronic+bladder+pain+syndrome.">MicroRNAs may mediate the down-regulation of neurokinin-1 receptor in chronic bladder pain syndrome.</a> American Journal of Pathology. 176 (1), 288-303 (2010).</li></ol>

Mentre Ramesh et al. si sono concentrati sullo sviluppo di strategie per utilizzare la trasduzione adenovirale nel trattamento del cancro della vescica 18, rapporti più recenti hanno dimostrato l'utilità di queste tecniche nello studio della normale biologia uroteliale / fisiologia e fisiopatologia 10,18,19,20,21 . Le caratteristiche ...

L'urotelio è l'epitelio specializzato che riveste la pelvi renale, gli ureteri, la vescica e l'uretra prossimale1. Comprende tre strati: uno strato di cellule ombrello altamente differenziate e polarizzate spesso bi-nucleate, le cui superfici apicali sono immerse nelle urine; uno strato cellulare intermedio con una popolazione di cellule binucleate che amplificano il transito che possono dare origine a cellule ombrello superficiali in risposta alla loro perdita acuta; e un singolo strato di cellule basali, un sottoinsieme delle quali funziona come cellule staminali in grado di rigenerare l'intero urotelio in risposta a lesioni croniche. Le cellule ombrello sono principalmente responsabili della formazione della barriera uroteliale ad alta resistenza, i cui componenti includono una membrana apicale (ricca di colesterolo e cerebrosidi) con bassa permeabilità all'acqua e ai soluti e un complesso giunzionale apicale ad alta resistenza (composto da giunzioni strette, giunzioni aderenti, desmosomi e un anello di actomiosina associato)1 . Sia la superficie apicale della cellula ombrello che il suo anello giunzionale si espandono durante il riempimento della vescica e ritornano rapidamente al loro stato pre-riempito dopo aver annullato 1,2,3,4,5. Oltre al suo ruolo nella funzione di barriera, si ipotizza che l'urotelio abbia anche funzioni sensoriali e trasduttrici che gli consentono di percepire i cambiamenti nell'ambiente extracellulare (ad esempio, allungare) e trasmettere queste informazioni attraverso il rilascio di mediatori (tra cui ATP, adenosina e acetilcolina) ai tessuti sottostanti, compresi i processi nervosi afferenti suburoteliali 6,7,8 . Recenti prove di questo ruolo si trovano in topi privi di espressione uroteliale sia di Piezo1 che di Piezo2, che si traduce in un'alterata funzione minzionale9. Inoltre, i ratti che sovraesprimono la proteina CLDN2 che forma i pori stretti nello strato cellulare dell'ombrello sviluppano infiammazione e dolore analoghi a quelli osservati nei pazienti con cistite interstiziale10. Si ipotizza che l'interruzione della funzione sensoriale/trasduttore uroteliale o della barriera possa contribuire a diversi disturbi della vescica 6,11.
Una migliore comprensione della biologia dell'urotelio negli stati normali e patologici dipende dalla disponibilità di strumenti che consentiranno ai ricercatori di sottoregolare prontamente l'espressione genica endogena o consentire l'espressione di transgeni nel tessuto nativo. Mentre un approccio per sottoregolare l'espressione genica è quello di generare topi knockout uroteliali condizionali, questo approccio dipende dalla disponibilità di topi con alleli floxati, è laborioso e può richiedere mesi o anni per completarne12. Non sorprende quindi che i ricercatori abbiano sviluppato tecniche per trasfettare o trasdurre l'urotelio, che possono portare a risultati su una scala temporale più breve. I metodi pubblicati per la trasfezione includono l'uso di lipidi cationici13, oligodeossinucleotidi fosforotioati antisenso14 o acidi nucleici antisenso legati alla proteina TAT dell'HIV che penetra il peptide 11-mer15. Tuttavia, il focus di questo protocollo è sull'uso della trasduzione adenovirale-mediata, una metodologia ben studiata che è efficiente nella consegna genica a una vasta gamma di cellule, è stata testata in numerosi studi clinici e più recentemente è stata utilizzata per fornire il cDNA che codifica la proteina del capside COVID-19 ai destinatari di una variante del vaccino COVID-1916, 17. Per una descrizione più approfondita del ciclo di vita dell'adenovirus, dei vettori adenovirali e delle applicazioni cliniche degli adenovirus, il lettore è indirizzato al riferimento17.
Un'importante pietra miliare nell'uso di adenovirus per trasdurre l'urotelio, è stato un rapporto di Ramesh et al. che ha mostrato brevi pretrattamenti con detergenti, tra cui N-dodecil-β-D-maltoside (DDM) drammaticamente aumentato la trasduzione dell'urotelio da parte di un adenovirus che codifica β-galattosidasi18. Utilizzando questo studio proof-of-principle come guida, la trasduzione adenovirale-mediata dell'urotelio è stata ora utilizzata per esprimere una varietà di proteine, tra cui GTPasi della famiglia Rab, fattori di scambio guanina-nucleotide, frammenti motori di miosina, claudine associate alla giunzione stretta che formano pori e ADAM17 10,19,20,21,22 . Lo stesso approccio è stato adattato per esprimere piccoli RNA interferenti (siRNA), i cui effetti sono stati salvati da varianti co-esprimenti resistenti ai siRNA del transgene22. Il protocollo qui descritto include metodi generali per generare grandi quantità di adenovirus altamente concentrato, un requisito per queste tecniche, nonché adattamenti dei metodi di Ramesh et al.18 per esprimere transgeni nell'urotelio con alta efficienza.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL pipette</td>
			<td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td>
			<td>CLS4488</td>
			<td>sterile, serological pipette, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mL ultracentrifuge tube</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>06-752</td>
			<td>PET thinwall ultracentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352097</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G needle</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>305196</td>
			<td>18 G x 1.5 in needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL pipette</td>
			<td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td>
			<td>CLS4489</td>
			<td>sterile, serological pipette, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352098</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipette</td>
			<td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td>
			<td>CLS4487</td>
			<td>sterile, serological pipette, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cavicide</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>6400012</td>
			<td>Anti-viral solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish - 15 cm</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>353025</td>
			<td>sterile, tissue-culture treated&#160; (150 mm x 25 mm dish)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>893.1832</td>
			<td>handle length 24 cm, blade length 1.7 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C-4306</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM culture medium (high glucose)</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11965092</td>
			<td>with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>EDS</td>
			<td>Bioiultra grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Hyclone (Cytiva)</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td>defined serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td>5.75 in glass pipette, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G-5516</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV catheter - mouse</td>
			<td>Smith Medical Jelco</td>
			<td>3063</td>
			<td>24 G x 3/4 in Safety IV catheter&#160; radiopaque</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV catheter - rat</td>
			<td>Smith Medical Jelco</td>
			<td>3060</td>
			<td>22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P-9541</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>Cell culture grade&#160; &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#8226;7 H2O</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>431478</td>
			<td>&#160;&#8805; 99.99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-dodecyl-&#946;-D-maltoside&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4641</td>
			<td>&#160;&#8805; 98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nose cone for multiple animals</td>
			<td>custom designed</td>
			<td></td>
			<td>commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-10 column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-085-01</td>
			<td>Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin antibiotic (100x)</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>15070063</td>
			<td>100x concentrated solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>BioPhotometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stand and clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-679Q and 05-769-8FQ</td>
			<td>available from numerous suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter unit</td>
			<td>Fisher Scientific (Nalgene)</td>
			<td>09-740-65B</td>
			<td>0.2 &#181;m rapid-flow filter unit (150 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter unit 0.2 &#181;m (syringe)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td>Millipore Sigma Milex 0.22 &#181;m filter unit that attaches to syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super speed centrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5810R</td>
			<td>with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1 mL)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>309628</td>
			<td>1-mL syringe Luer-lok tip - sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (3 mL)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>309656</td>
			<td>3-mL syringe slip tip - sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table-top centrifuge (low speed)</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5702</td>
			<td>with swinging bucket rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td>polyethylene 3.4 mL transfer pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>648310-M</td>
			<td>Molecular Biology grade&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE select protease solution</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>12604013</td>
			<td>TrypLE express enzyme (1x), no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-80 XP</td>
			<td>with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporizer&#160;</td>
			<td>General Anesthetic Services, Inc.</td>
			<td>Tec 3</td>
			<td>Isoflurane vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td>analog vortex mixer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of transgenes in native bladder urothelium using adenovirus-mediated transduction

Oltre a formare una barriera ad alta resistenza, si ipotizza che l'urotelio che riveste la pelvi renale, gli ureteri, la vescica e l'uretra prossimale percepisca e trasmetta informazioni sul suo ambiente ai tessuti sottostanti, promuovendo la funzione e il comportamento minzionale. La rottura della barriera uroteliale, o della sua funzione sensoriale / trasduttore, può portare a malattie. Lo studio di questi eventi complessi è ostacolato dalla mancanza di strategie semplici per alterare l'espressione genica e proteica nell'urotelio. Qui sono descritti metodi che consentono ai ricercatori di generare grandi quantità di adenovirus ad alto titolo, che può quindi essere utilizzato per trasdurre l'urotelio dei roditori con alta efficienza e in modo relativamente semplice. Sia i cDNA che i piccoli RNA interferenti possono essere espressi utilizzando la trasduzione adenovirale e l'impatto dell'espressione del transgene sulla funzione uroteliale può essere valutato da 12 ore a diversi giorni dopo. Questi metodi hanno un'ampia applicabilità agli studi di biologia uroteliale normale e anormale utilizzando modelli animali murini o ratti.

Preparazione del virus Un esempio di purificazione del virus mediante centrifugazione a gradiente di densità è mostrato nella Figura 1A. La banda rosa chiaro, che si trova all'interfaccia tra il materiale cellulare caricato e lo strato di CsCl da 1,25 g/ml, è composta principalmente da cellule disgregate e dai loro detriti (vedi freccia magenta in Figura 1A). Deriva il suo colore rosato dalla piccola quantità di terreno di coltura che vie...

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Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction

Vengono descritti metodi per la generazione di grandi quantità di adenovirus ricombinanti, che possono quindi essere utilizzati per trasdurre l'urotelio nativo dei roditori consentendo l'espressione di transgeni o la downregulation di prodotti genici endogeni.

Espressione di transgeni nell'urotelio vescicale nativo mediante trasduzione mediata da adenovirus

In addition to forming a high-resistance barrier, the urothelium lining the renal pelvis, ureters, bladder, and proximal urethra is hypothesized to sense ...

Questo protocollo descrive i metodi che consentono ai ricercatori di esprimere CDNA o SIRNA nell'urotelio vescicale nativo. I principali vantaggi di questa tecnica sono la sua relativa semplicità, la capacità di esprimere cDNA, siRNA nell'urotelio con alta efficienza e in un periodo di tempo relativamente breve. La parte più difficile di questa tecnica è il cateterismo.Tuttavia, la tecnica complessiva è relativamente facile da padroneggiare una volta appresa. A dimostrare la procedura sarà Giovanni Ruiz, Research Specialist IV nel mio laboratorio. Per iniziare posizionare il topo anestetizzato su una piastra riscaldante vicino ai coni del naso.Mantenere l'animale sotto anestesia per tutta la durata del protocollo. Confermare che il mouse è completamente anestetizzato con un pizzico di punta. Per evitare l'introduzione di aria nella vescica, riempire la porzione di catetere di plastica di un catetere IV e dell'hub associato con PBS sterile utilizzando una pipetta di trasferimento sterile o una siringa.Con l'animale in posizione supina tamponare il meato uretrale esterno con alcol al 70%. Quindi afferrare delicatamente il tessuto che forma il meato uretrale esterno ed estenderlo verticalmente lontano dall'animale usando una pinza fine. Inserire il catetere sterile nel meato esterno.Usando l'altra mano inserire con attenzione il catetere verticalmente di circa tre o quattro millimetri nel meato uretrale. Quindi abbassare il catetere inserito nel meato esterno verso la coda dell'animale, che facilita il suo ingresso nella porzione dell'uretra che passa sotto l'osso pubico e infine nella vescica. Lasciare che l'urina nella vescica fuoriesca.Rimuovere l'urina residua eseguendo la manovra di Creda massaggiando e premendo delicatamente verso il basso sulla protuberanza della vescica nella zona addominale inferiore. Per rendere l'urotelio ricettivo alla trasduzione, lavare la vescica del topo o del ratto attaccando una siringa sterile da un millilitro piena di PBS all'hub del catetere. Iniettare 100 microlitri di PBS sterile nella vescica del topo.Dopo aver staccato la siringa dal catetere, lasciare drenare il PBS. Instillare 100 microlitri di 0,1% N-dodecil-beta-D-maltoside sciolto in PBS e filtro da 0,2 micrometri sterilizzato nella vescica del topo utilizzando una siringa sterile da un millilitro. Mantenere la N-dodecil-beta-D-maltoside nella vescica per 10 minuti lasciando la siringa in posizione.Rimuovere l'N-dodecil-beta-D-maltoside dalla vescica staccando la siringa e lasciandola defluire. Per introdurre il virus nella vescica attaccare una siringa sterile da un millilitro all'hub del catetere e instillare 5.000.000 a 100.000.000 IVP di adenovirus diluito in 100 microlitri di PBS sterile per i topi o 450 microlitri per i ratti nella vescica. Dopo 30 minuti, staccare la siringa e lasciare che la soluzione virale evacui la vescica su un tampone monouso.Tamponare qualsiasi soluzione di virus residuo con una salvietta assorbente mentre si elimina il tampone e pulire i rifiuti biopericolosi. Per consentire all'animale di riprendersi, cessare il flusso di isoflurano. Consentire all'animale di riprendersi ed essere completamente mobile prima di riportarlo nella sua gabbia, in particolare se gli animali sono alloggiati in gruppo.Analizzare gli effetti dell'espressione transgenica da 12 a 72 ore dopo il trattamento utilizzando metodi come l'ibridazione mRNA in situ, Western blot o immunofluorescenza. L'analisi Western blot dei lisati uroteliali ha rivelato l'espressione dell'ormone della crescita umano marcato V5 nell'urotelio delle vesciche trasdotte, ma non in quelle non trasdotte. L'espressione è stata confermata anche dall'immunofluorescenza utilizzando anticorpi che hanno riconosciuto l'ormone della crescita umano, o il tag dell'epitopo V5.L'analisi Western blot ha confermato l'espressione di Claudin-2 nei ratti trasdotti con adenovirus, ma non in quelli trasdotti con un virus codificante GFP controllato. L'analisi di immunofluorescenza ha ulteriormente confermato l'espressione esogena di Claudin-2 in cellule ombrello uroteliali trasdotte con il cDNA di Claudin-2 codificante il virus. Il rilevamento di Claudin-2 esogeno nella Tight Junction Protein 1 mediante immunofluorescenza e microscopia confocale dell'intero urotelio montato o in sezione trasversale ha rivelato la presenza di Tight Junction e accumuli intracellulari di Claudin-2 nel citoplasma cellulare.Il campo dell'immagine mostra che il conteggio del numero di cellule ombrello trasdotte rivela un'efficienza che si avvicina al 95% e nella totalità della parete della vescica viene trasdotto solo l'urotelio e nessun altro tessuto è preso di mira dall'adenovirus instillato. Il cateterismo è fondamentale affinché il protocollo funzioni come previsto. Questa tecnica consente ai ricercatori di studiare la normale biologia uroteliale, nonché di comprendere le condizioni in cui la sovraespressione proteica, o sottoespressione, porta alla malattia.

Research

JoVE Journal

Biology

Targeted Expression of GFP in the Hair Follicle Using Ex Vivo Viral Transduction

Espressione mirato di GFP nel follicolo pilifero Utilizzando Ex trasduzione virale Vivo

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft ...

Ricerca

Biologia

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

La preparazione di colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino per elettroporazione

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Detection of Protein Ubiquitination

Rilevamento di proteine ​​Ubiquitinazione

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Utilizzando il sistema di elettroporazione Gene Pulser MXcell per trasfettare cellule primarie con alta efficienza

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

L&#39;utilizzo di un contatore automatico cella per semplificare gli studi sull&#39;espressione genica: Knockdown siRNA di IL-4 genica dipendente nelle celle Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

Adenovirus-mediata rimozione genetica di molecole di segnalazione in fibroblasti di topo coltivate primarie embrionali

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

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