Name: expression of transgenes in native bladder urothelium using adenovirus-mediated transduction
Uploaded: 2022-10-06T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction at JoVE.com

この作業は、P30DK079307(MGDへ)、NIH助成金R01DK119183(GAおよびMDCへ)、NIH助成金R01DK129473(GAへ)、米国泌尿器科学会キャリア開発賞、ウィンターズ財団助成金(NMへ)、ピッツバーグ腎臓研究センターの細胞生理学およびモデル生物腎臓イメージングコア(P30DK079307)によるパイロットプロジェクト賞によってサポートされました。 S10OD028596(G.A.へ)は、この原稿で提示された画像の一部をキャプチャするために使用される共焦点システムの購入に資金を提供しました。

BSL2認証を必要とするアデノウイルスの生成を含む実験は、ピッツバーグ大学環境衛生安全局および施設内バイオセーフティ委員会の承認を受けて実施されました。アデノウイルス形質導入(ABSL2認証が必要)を含むすべての動物実験は、実験動物の人道的管理と使用に関する公衆衛生サービスポリシーおよび動物福祉法の関連するガイドライン/規制に従って、ピッツバーグ大学施設動物管理お?...

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	<li>Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Urothelium:+Life+in+a+liquid+environment.">The Urothelium: Life in a liquid environment.</a> Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).</li><li>Truschel, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-regulated+exocytosis/endocytosis+in+bladder+umbrella+cells.">Stretch-regulated exocytosis/endocytosis in bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (3), 830-846 (2002).</li><li>Lewis, S. A., de Moura, J. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+cytoplasmic+vesicles+into+apical+membrane+of+mammalian+urinary+bladder+epthelium.">Incorporation of cytoplasmic vesicles into apical membrane of mammalian urinary bladder epthelium.</a> Nature (London). 297 (5868), 685-688 (1982).</li><li>Eaton, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+contraction+of+the+umbrella+cell+apical+junctional+ring+in+response+to+bladder+filling+and+voiding.">Expansion and contraction of the umbrella cell apical junctional ring in response to bladder filling and voiding.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (16), 2037-2052 (2019).</li><li>Yu, W., Khandelwal, P., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+apical+and+basolateral+membrane+requirements+for+stretch-induced+membrane+traffic+at+the+apical+surface+of+bladder+umbrella+cells.">Distinct apical and basolateral membrane requirements for stretch-induced membrane traffic at the apical surface of bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (1), 282-295 (2009).</li><li>Birder, L., Andersson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+signaling.">Urothelial signaling.</a> Physiological Reviews. 93 (2), 653-680 (2013).</li><li>Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+bladder,+cystitis+and+nerve/urothelial+interactions.">Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions.</a> Autonomic Neuroscience. 182, 89-94 (2014).</li><li>Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+uroepithelial-associated+sensory+web.">The uroepithelial-associated sensory web.</a> Kidney International. 72 (9), 1057-1064 (2007).</li><li>Dalghi, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+for+PIEZO1+and+PIEZO2+in+urothelial+mechanotransduction+and+lower+urinary+tract+interoception.">Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (19), 152984 (2021).</li><li>Montalbetti, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+urothelial+paracellular+transport+promotes+cystitis.">Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis.</a> American Journal of Physiology: Renal Physiology. 309 (12), 1070-1081 (2015).</li><li>Keay, S. K., Birder, L. A., Chai, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+bladder+urothelial+pathophysiology+in+functional+bladder+disorders.">Evidence for bladder urothelial pathophysiology in functional bladder disorders.</a> BioMed Research International. 2014, 865463 (2014).</li><li>Friedel, R. H., Wurst, W., Wefers, B., Kuhn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+conditional+knockout+mice.">Generating conditional knockout mice.</a> Methods in Molecular Biology. 693, 205-231 (2011).</li><li>Kashyap, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+nerve+growth+factor+expression+in+the+bladder+by+antisense+oligonucleotides+as+new+treatment+for+overactive+bladder.">Down-regulation of nerve growth factor expression in the bladder by antisense oligonucleotides as new treatment for overactive bladder.</a> Journal of Urology. 190 (2), 757-764 (2013).</li><li>Bolenz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+and+ex+vivo+urothelial+penetration+by+oligodeoxynucleotides+for+optimizing+treatment+of+transitional+cell+carcinoma.">Cellular uptake and ex vivo urothelial penetration by oligodeoxynucleotides for optimizing treatment of transitional cell carcinoma.</a> Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 30 (5), 265-273 (2008).</li><li>Tyagi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravesical+antisense+therapy+for+cystitis+using+TAT-peptide+nucleic+acid+conjugates.">Intravesical antisense therapy for cystitis using TAT-peptide nucleic acid conjugates.</a> Molecular Pharmaceutics. 3 (4), 398-406 (2006).</li><li>Sadoff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interim+results+of+a+phase+1-2a+trial+of+Ad26.COV2.S+Covid-19+vaccine.">Interim results of a phase 1-2a trial of Ad26.COV2.S Covid-19 vaccine.</a> New England Journal of Medicine. 384 (19), 1824-1835 (2021).</li><li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+delivery:+Potential+applications+for+gene+and+cell-Based+therapies+in+the+new+era+of+personalized+medicine.">Adenovirus-mediated gene delivery: Potential applications for gene and cell-Based therapies in the new era of personalized medicine.</a> Genes &amp; Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).</li><li>Ramesh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+pretreatment+agents+to+enhance+adenovirus+infection+of+bladder+epithelium.">Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium.</a> Molecular Therapy. 10 (4), 697-705 (2004).</li><li>Khandelwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab11a-dependent+exocytosis+of+discoidal/fusiform+vesicles+in+bladder+umbrella+cells.">Rab11a-dependent exocytosis of discoidal/fusiform vesicles in bladder umbrella cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15773-15778 (2008).</li><li>Khandelwal, P., Ruiz, W. G., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+endocytosis+in+bladder+umbrella+cells+occurs+through+an+integrin-regulated+and+RhoA-+and+dynamin-dependent+pathway.">Compensatory endocytosis in bladder umbrella cells occurs through an integrin-regulated and RhoA- and dynamin-dependent pathway.</a> The European Molecular Biology Organization journal. 29 (12), 1961-1975 (2010).</li><li>Khandelwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rab11a-Rab8a-Myo5B+network+promotes+stretch-regulated+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells.">A Rab11a-Rab8a-Myo5B network promotes stretch-regulated exocytosis in bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 24 (7), 1007-1019 (2013).</li><li>Prakasam, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A1+adenosine+receptor-stimulated+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells+requires+phosphorylation+of+ADAM17+Ser811+and+EGF+receptor+transactivation.">A1 adenosine receptor-stimulated exocytosis in bladder umbrella cells requires phosphorylation of ADAM17 Ser811 and EGF receptor transactivation.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3798-3812 (2014).</li><li>Gallo, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAB27B+requirement+for+stretch-induced+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells.">RAB27B requirement for stretch-induced exocytosis in bladder umbrella cells.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 314 (3), 349-365 (2018).</li><li>Amasheh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-2+expression+induces+cation-selective+channels+in+tight+junctions+of+epithelial+cells.">Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 115, 4969-4976 (2002).</li><li>Yu, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+cation+selectivity+in+claudin-2-based+paracellular+pores:+identification+of+an+electrostatic+interaction+site.">Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: identification of an electrostatic interaction site.</a> The Journal of General Physiology. 133 (1), 111-127 (2009).</li><li>Kasahara, H., Aoki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+using+adenoviral+RNAi+vector+in+vascular+smooth+muscle+cells+and+cardiomyocytes.">Gene silencing using adenoviral RNAi vector in vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes.</a> Methods in Molecular Medicine. 112, 155-172 (2005).</li><li>Bolognesi, B., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaching+the+limit.">Reaching the limit.</a> eLife. 7, 39804 (2018).</li><li>Atasheva, S., Shayakhmetov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+responses+to+adenovirus+and+adenovirus+vectors.">Cytokine responses to adenovirus and adenovirus vectors.</a> Viruses. 14 (5), 888 (2022).</li><li>Sanchez Freire, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+may+mediate+the+down-regulation+of+neurokinin-1+receptor+in+chronic+bladder+pain+syndrome.">MicroRNAs may mediate the down-regulation of neurokinin-1 receptor in chronic bladder pain syndrome.</a> American Journal of Pathology. 176 (1), 288-303 (2010).</li></ol>

Rameshらは、膀胱癌の治療にアデノウイルス形質導入を使用する戦略の開発に焦点を当てていましたが18、最近の報告では、正常な尿路上皮生物学/生理学および病態生理学の研究におけるこれらの技術の有用性が実証されています10,18,19,20,21。.このアプ?...

尿路上皮は、腎盂、尿管、膀胱、および近位尿道1を覆う特殊な上皮です。それは3つの層で構成されています:高度に分化し分極したしばしば二核傘細胞の層であり、その頂端表面は尿に浸されています。それらの急性喪失に応答して表在性アンブレラ細胞を生じさせることができる二核トランジット増幅細胞の集団を有する中間細胞層。基底細胞の単層であり、そのサブセットは、慢性損傷に応答して尿路上皮全体を再生することができる幹細胞として機能する。アンブレラ細胞は主に、水や溶質に対する透過性の低い頂端膜(コレステロールとセレブロシドが豊富)や、高抵抗の頂端接合複合体(タイトジャンクション、アドヒアレンスジャンクション、デスモソーム、および関連するアクトミオシンリングで構成される)を含む高抵抗尿路上皮バリアの形成に関与しています1。.傘細胞の頂端表面とその接合リングの両方が膀胱充填中に拡張し、排尿後に急速に充填前の状態に戻ります1、2、3、4、5。バリア機能におけるその役割に加えて、尿路上皮はまた、細胞外環境の変化を感知することを可能にする感覚およびトランスデューサー機能を有すると仮定されている(例えば、伸張)そしてメディエーター(ATP、アデノシン、アセチルコリンを含む)の放出を介してこの情報を、下皮下求心性神経突起を含む下層組織に伝達する6,7,8。.この役割の最近の証拠は、Piezo1とPiezo2の両方の尿路上皮発現を欠くマウスで発見され、その結果、排尿機能が変化します9。さらに、傘細胞層でタイトジャンクション孔形成タンパク質CLDN2を過剰発現しているラットは、間質性膀胱炎の患者に見られるのと同様の炎症と痛みを発症します10。尿路上皮感覚/トランスデューサーまたはバリア機能の破壊がいくつかの膀胱障害に寄与する可能性があるという仮説が立てられています6,11。
正常状態および疾患状態における尿路上皮の生物学のより良い理解は、研究者が内因性遺伝子発現を容易にダウンレギュレートしたり、天然組織における導入遺伝子の発現を可能にしたりすることを可能にするツールの利用可能性にかかっています。遺伝子発現をダウンレギュレートする1つのアプローチは、条件付き尿路上皮ノックアウトマウスを生成することですが、このアプローチは、フロックス対立遺伝子を持つマウスの利用可能性に依存し、労働集約的であり、完了するまでに数か月から数年かかる場合があります12。当然のことながら、研究者は尿路上皮をトランスフェクトまたは形質導入する技術を開発しており、これによりより短い時間スケールで結果が得られる可能性があります。トランスフェクションのための公表された方法には、カチオン性脂質13、アンチセンスホスホロチオ化オリゴデオキシヌクレオチド14、またはHIV TATタンパク質につなが留されたアンチセンス核酸透過性11量体ペプチド15の使用が含まれる。ただし、このプロトコルの焦点は、広範囲の細胞への遺伝子送達に効率的である十分に研究された方法論であるアデノウイルス媒介形質導入の使用にあり、多数の臨床試験でテストされており、最近では、COVID-19カプシドタンパク質をコードするcDNAをCOVID-19ワクチンの1つの変異体のレシピエントに送達するために使用されました16。17.アデノウイルスのライフサイクル、アデノウイルスベクター、およびアデノウイルスの臨床応用のより完全な説明については、読者は参考文献17に向けられる。
尿路上皮を形質導入するためのアデノウイルスの使用における重要なマイルストーンは、N-ドデシル-β-D-マルトシド(DDM)を含む界面活性剤による短い前処理が、β-ガラクトシダーゼ18をコードするアデノウイルスによる尿路上皮の形質導入を劇的に増強したことを示したRameshらの報告でした。この原理実証研究をガイドとして、尿路上皮のアデノウイルス媒介形質導入は、RabファミリーGTPアーゼ、グアニンヌクレオチド交換因子、ミオシンモーターフラグメント、孔形成タイトジャンクション関連クローディン、およびADAM17 10、19、20、21、22を含むさまざまなタンパク質を発現するために使用されています10、19、20、21、22.同じアプローチが小さな干渉RNA(siRNA)を発現するように適応され、その効果は導入遺伝子22のsiRNA耐性変異体を共発現することによって救出された。ここで説明するプロトコルには、これらの技術の要件である大量の高濃度アデノウイルスを生成するための一般的な方法、および尿路上皮で導入遺伝子を高効率で発現させるためのRameshらの方法の適応が含まれます18。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL pipette</td>
			<td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td>
			<td>CLS4488</td>
			<td>sterile, serological pipette, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mL ultracentrifuge tube</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>06-752</td>
			<td>PET thinwall ultracentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352097</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G needle</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>305196</td>
			<td>18 G x 1.5 in needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL pipette</td>
			<td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td>
			<td>CLS4489</td>
			<td>sterile, serological pipette, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352098</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipette</td>
			<td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td>
			<td>CLS4487</td>
			<td>sterile, serological pipette, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cavicide</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>6400012</td>
			<td>Anti-viral solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish - 15 cm</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>353025</td>
			<td>sterile, tissue-culture treated&#160; (150 mm x 25 mm dish)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>893.1832</td>
			<td>handle length 24 cm, blade length 1.7 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C-4306</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM culture medium (high glucose)</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11965092</td>
			<td>with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>EDS</td>
			<td>Bioiultra grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Hyclone (Cytiva)</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td>defined serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td>5.75 in glass pipette, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G-5516</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV catheter - mouse</td>
			<td>Smith Medical Jelco</td>
			<td>3063</td>
			<td>24 G x 3/4 in Safety IV catheter&#160; radiopaque</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV catheter - rat</td>
			<td>Smith Medical Jelco</td>
			<td>3060</td>
			<td>22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P-9541</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>Cell culture grade&#160; &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#8226;7 H2O</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>431478</td>
			<td>&#160;&#8805; 99.99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-dodecyl-&#946;-D-maltoside&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4641</td>
			<td>&#160;&#8805; 98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nose cone for multiple animals</td>
			<td>custom designed</td>
			<td></td>
			<td>commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-10 column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-085-01</td>
			<td>Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin antibiotic (100x)</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>15070063</td>
			<td>100x concentrated solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>BioPhotometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stand and clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-679Q and 05-769-8FQ</td>
			<td>available from numerous suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter unit</td>
			<td>Fisher Scientific (Nalgene)</td>
			<td>09-740-65B</td>
			<td>0.2 &#181;m rapid-flow filter unit (150 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter unit 0.2 &#181;m (syringe)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td>Millipore Sigma Milex 0.22 &#181;m filter unit that attaches to syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super speed centrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5810R</td>
			<td>with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1 mL)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>309628</td>
			<td>1-mL syringe Luer-lok tip - sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (3 mL)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>309656</td>
			<td>3-mL syringe slip tip - sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table-top centrifuge (low speed)</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5702</td>
			<td>with swinging bucket rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td>polyethylene 3.4 mL transfer pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>648310-M</td>
			<td>Molecular Biology grade&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE select protease solution</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>12604013</td>
			<td>TrypLE express enzyme (1x), no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-80 XP</td>
			<td>with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporizer&#160;</td>
			<td>General Anesthetic Services, Inc.</td>
			<td>Tec 3</td>
			<td>Isoflurane vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td>analog vortex mixer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of transgenes in native bladder urothelium using adenovirus-mediated transduction

高抵抗バリアを形成することに加えて、腎盂、尿管、膀胱、および近位尿道の内側を覆う尿路上皮は、その環境に関する情報を感知して下にある組織に伝達し、排尿機能と行動を促進すると仮定されています。尿路上皮バリアまたはその感覚/トランスデューサー機能の破壊は、疾患につながる可能性があります。これらの複雑な事象の研究は、尿路上皮における遺伝子およびタンパク質発現を変化させるための単純な戦略の欠如によって妨げられている。ここでは、研究者が大量の高力価アデノウイルスを生成することを可能にし、それを使用してげっ歯類の尿路上皮を高効率で比較的簡単な方法で形質導入することができる方法について説明します。cDNAと低分子干渉RNAの両方をアデノウイルス形質導入を用いて発現させることができ、尿路上皮機能に対する導入遺伝子発現の影響を12時間から数日後に評価することができる。これらの方法は、マウスまたはラット動物モデルを用いた正常および異常な尿路上皮生物学の研究に広く適用できます。

ウイルスの準備 密度勾配遠心分離によるウイルス精製の一例を 図1Aに示す。ロードされた細胞物質と1.25 g / mLのCsCl層の界面に見られる淡いピンク色のバンドは、主に破壊された細胞とその破片で構成されています( 図1Aのマゼンタの矢印を参照)。ピンクがかった色は、プロトコルのステップ1.5から引き継がれた少量の培地に由来し?...

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Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction

大量の組換えアデノウイルスを生成するための方法が記載されており、次いで、それを使用して天然のげっ歯類の尿路上皮を形質導入し、導入遺伝子の発現または内因性遺伝子産物のダウンレギュレーションを可能にすることができる。

アデノウイルスを介した形質導入を用いた天然膀胱尿路上皮における導入遺伝子の発現

In addition to forming a high-resistance barrier, the urothelium lining the renal pelvis, ureters, bladder, and proximal urethra is hypothesized to sense ...

このプロトコルは、研究者が天然の膀胱尿路上皮でCDNAまたはSIRNAを発現できるようにする方法について説明しています。この技術の主な利点は、その比較的単純さ、尿路上皮内のcDNA、siRNAを高効率で、そして比較的短期間で発現する能力である。この技術の最も難しい部分はカテーテル法です。ただし、全体的なテクニックは、一度習得すると比較的簡単に習得できます。手順を実演するのは、私の研究室の研究スペシャリストIVであるジョバンニルイスです。まず、麻酔をかけたマウスをノーズコーンの隣の加熱パッドに置きます。プロトコルの期間中、動物を麻酔下で維持します。つま先をつまんでマウスが完全に麻酔されていることを確認します。膀胱に空気が入らないようにするには、滅菌トランスファーピペットまたはシリンジを使用して、IVカテーテルのプラスチックカテーテル部分と関連するハブに滅菌PBSを充填します。動物を仰臥位にして、外尿道口を70%アルコールで拭きます。次に、外尿道口を形成する組織をそっとつかみ、細かい鉗子を使用して動物から垂直に伸ばします。滅菌カテーテルを外道に挿入します。もう一方の手を使用して、カテーテルを尿道口に約3〜4ミリメートル垂直に慎重に挿入します。次に、外口に挿入されたカテーテルを動物の尾に向かって下げ、恥骨の下を通り、最終的には膀胱に入る尿道の部分への侵入を容易にします。膀胱内の尿が漏れるのを待ちます。下腹部の膀胱隆起をマッサージしてそっと押し下げることにより、クリードの操作を実行して、残りの尿を取り除きます。尿路上皮を形質導入を受け入れやすくするには、PBSで満たされた滅菌1ミリリットルのシリンジをカテーテルハブに取り付けて、マウスまたはラットの膀胱を洗浄します。100マイクロリットルの滅菌PBSをマウスの膀胱に注入します。シリンジをカテーテルフィッティングから取り外した後、PBSを排出させます。滅菌した1ミリリットルのシリンジを使用して、PBSおよび滅菌した0.2マイクロメートルのフィルターに溶解した0.1%N-ドデシル-β-D-マルトシド100マイクロリットルをマウス膀胱に注入します。シリンジを所定の位置に残して、N-ドデシル-ベータ-D-マルトシドを膀胱内に10分間保持します。.N-ドデシル-β-D-マルトシドを膀胱から取り外し、シリンジを取り外して排出させます。.ウイルスを膀胱に導入するには、滅菌1ミリリットルのシリンジをカテーテルハブに取り付け、マウスの場合は100マイクロリットルの滅菌PBS、ラットの場合は450マイクロリットルで希釈した5, 000, 000〜100, 000,000 IVPのアデノウイルスを膀胱に注入します。30分後、シリンジを取り外し、ウイルス溶液が膀胱を使い捨てパッドに排出できるようにします。パッドを廃棄しながら、残留ウイルス溶液を吸収性ワイプで拭き取り、バイオハザード廃棄物で拭きます。動物が回復することを可能にするために、イソフルランの流れを止める。特に動物がグループハウスされている場合は、ケージに戻す前に、動物が回復し、完全に移動できるようにします。mRNA in situハイブリダイゼーション、ウェスタンブロット、免疫蛍光などの方法を使用して、治療後12〜72時間の導入遺伝子発現の影響を分析します。尿路上皮ライセートのウェスタンブロット分析では、形質導入された膀胱の尿路上皮でV5タグ付きヒト成長ホルモンの発現が明らかになりましたが、形質導入されていない膀胱では発現しませんでした。発現は、ヒト成長ホルモン、またはV5エピトープタグを認識する抗体を用いた免疫蛍光法によっても確認された。ウェスタンブロット分析では、アデノウイルスを形質導入したラットではクローディン-2の発現が確認されましたが、制御されたGFPコードウイルスを形質導入したラットでは確認されませんでした。免疫蛍光分析により、ウイルスをコードするクローディン-2 cDNAで形質導入された尿路上皮傘細胞における外因性クローディン-2発現がさらに確認されました。マウントまたは断面尿路上皮全体の免疫蛍光および共焦点顕微鏡によるタイトジャンクションタンパク質1中の外因性クローディン-2の検出により、細胞質におけるクローディン-2のタイトジャンクションおよび細胞内蓄積の存在が明らかになりました。画像フィールドは、形質導入された傘細胞の数を数えると、95%に近づく効率が明らかになり、膀胱壁全体で尿路上皮のみが形質導入され、他の組織は注入されたアデノウイルスの標的にならないことを示しています。カテーテル法は、プロトコルが意図したとおりに機能するために重要です。この技術により、研究者は正常な尿路上皮生物学を研究し、タンパク質の過剰発現または発現不足が疾患につながる状態を理解することができます。

Research

JoVE Journal

Biology

Targeted Expression of GFP in the Hair Follicle Using Ex Vivo Viral Transduction

ex vivoでのウイルス形質導入を用いた毛包におけるGFPの標的発現

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft ...

生物学

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

エレクトロポレーションのためのマウス骨髄からの一次造血細胞培養の準備

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Detection of Protein Ubiquitination

タンパク質のユビキチン化の検出

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

クーマシー有機溶媒および酢酸のないG - 250でゲル中のタンパク質の染色

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

高効率で初代培養細胞をトランスフェクトするためにジーンパルサーMXcellのエレクトロポレーションシステムの使用

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

ナマルバ細胞におけるIL - 4依存性遺伝子発現のsiRNAのノックダウン：遺伝子発現研究を簡素化する自動化セルカウンターの使い方

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

培養一次マウス胚線維芽細胞におけるシグナル伝達分子のアデノウイルス媒介遺伝子除去

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

アクティブT.の試験管内再構成でcastaneumのテロメラーゼ

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

遺伝的にコードされた分子プローブは、Gタンパク質共役受容体を研究する

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

ホルマリン固定からプロテオミクスサンプル調製およびパラフィン包埋組織

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...