Name: expression of transgenes in native bladder urothelium using adenovirus-mediated transduction
Uploaded: 2022-10-06T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction at JoVE.com

이 작업은 P30DK079307(MGD에게), NIH 보조금 R01DK119183(GA 및 MDC에), NIH 보조금 R01DK129473(GA에), 미국 비뇨기과 협회 경력 개발 상 및 Winters Foundation 보조금(NM)을 통한 파일럿 프로젝트 상, 피츠버그 신장 연구 센터(P30DK079307)의 세포 생리학 및 모델 유기체 신장 이미징 코어, 그리고 S10OD028596(G.A.에게)에 의해, 이 원고에 제시된 이미지 중 일부를 캡처하는 데 사용되는 컨포칼 시스템의 구매 자금을 지원했습니다.

BSL2 인증이 필요한 아데노바이러스 생성과 관련된 실험은 피츠버그 대학교 환경 보건 및 안전 사무소와 기관 생물 안전 위원회의 승인을 받아 수행되었습니다. 아데노바이러스 형질도입(ABSL2 인증 필요)을 포함한 모든 동물 실험은 실험실 동물의 인도적 관리 및 사용에 관한 공중 보건 서비스 정책 및 동물 복지법의 관련 지침/규정에 따라 피츠버그 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 ?...

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	<li>Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Urothelium:+Life+in+a+liquid+environment.">The Urothelium: Life in a liquid environment.</a> Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).</li><li>Truschel, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-regulated+exocytosis/endocytosis+in+bladder+umbrella+cells.">Stretch-regulated exocytosis/endocytosis in bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (3), 830-846 (2002).</li><li>Lewis, S. A., de Moura, J. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+cytoplasmic+vesicles+into+apical+membrane+of+mammalian+urinary+bladder+epthelium.">Incorporation of cytoplasmic vesicles into apical membrane of mammalian urinary bladder epthelium.</a> Nature (London). 297 (5868), 685-688 (1982).</li><li>Eaton, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+contraction+of+the+umbrella+cell+apical+junctional+ring+in+response+to+bladder+filling+and+voiding.">Expansion and contraction of the umbrella cell apical junctional ring in response to bladder filling and voiding.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (16), 2037-2052 (2019).</li><li>Yu, W., Khandelwal, P., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+apical+and+basolateral+membrane+requirements+for+stretch-induced+membrane+traffic+at+the+apical+surface+of+bladder+umbrella+cells.">Distinct apical and basolateral membrane requirements for stretch-induced membrane traffic at the apical surface of bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (1), 282-295 (2009).</li><li>Birder, L., Andersson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+signaling.">Urothelial signaling.</a> Physiological Reviews. 93 (2), 653-680 (2013).</li><li>Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+bladder,+cystitis+and+nerve/urothelial+interactions.">Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions.</a> Autonomic Neuroscience. 182, 89-94 (2014).</li><li>Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+uroepithelial-associated+sensory+web.">The uroepithelial-associated sensory web.</a> Kidney International. 72 (9), 1057-1064 (2007).</li><li>Dalghi, M. 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H., Wurst, W., Wefers, B., Kuhn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+conditional+knockout+mice.">Generating conditional knockout mice.</a> Methods in Molecular Biology. 693, 205-231 (2011).</li><li>Kashyap, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+nerve+growth+factor+expression+in+the+bladder+by+antisense+oligonucleotides+as+new+treatment+for+overactive+bladder.">Down-regulation of nerve growth factor expression in the bladder by antisense oligonucleotides as new treatment for overactive bladder.</a> Journal of Urology. 190 (2), 757-764 (2013).</li><li>Bolenz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+and+ex+vivo+urothelial+penetration+by+oligodeoxynucleotides+for+optimizing+treatment+of+transitional+cell+carcinoma.">Cellular uptake and ex vivo urothelial penetration by oligodeoxynucleotides for optimizing treatment of transitional cell carcinoma.</a> Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 30 (5), 265-273 (2008).</li><li>Tyagi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravesical+antisense+therapy+for+cystitis+using+TAT-peptide+nucleic+acid+conjugates.">Intravesical antisense therapy for cystitis using TAT-peptide nucleic acid conjugates.</a> Molecular Pharmaceutics. 3 (4), 398-406 (2006).</li><li>Sadoff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interim+results+of+a+phase+1-2a+trial+of+Ad26.COV2.S+Covid-19+vaccine.">Interim results of a phase 1-2a trial of Ad26.COV2.S Covid-19 vaccine.</a> New England Journal of Medicine. 384 (19), 1824-1835 (2021).</li><li>Lee, C. 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G., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+endocytosis+in+bladder+umbrella+cells+occurs+through+an+integrin-regulated+and+RhoA-+and+dynamin-dependent+pathway.">Compensatory endocytosis in bladder umbrella cells occurs through an integrin-regulated and RhoA- and dynamin-dependent pathway.</a> The European Molecular Biology Organization journal. 29 (12), 1961-1975 (2010).</li><li>Khandelwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rab11a-Rab8a-Myo5B+network+promotes+stretch-regulated+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells.">A Rab11a-Rab8a-Myo5B network promotes stretch-regulated exocytosis in bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 24 (7), 1007-1019 (2013).</li><li>Prakasam, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A1+adenosine+receptor-stimulated+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells+requires+phosphorylation+of+ADAM17+Ser811+and+EGF+receptor+transactivation.">A1 adenosine receptor-stimulated exocytosis in bladder umbrella cells requires phosphorylation of ADAM17 Ser811 and EGF receptor transactivation.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3798-3812 (2014).</li><li>Gallo, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAB27B+requirement+for+stretch-induced+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells.">RAB27B requirement for stretch-induced exocytosis in bladder umbrella cells.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 314 (3), 349-365 (2018).</li><li>Amasheh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-2+expression+induces+cation-selective+channels+in+tight+junctions+of+epithelial+cells.">Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 115, 4969-4976 (2002).</li><li>Yu, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+cation+selectivity+in+claudin-2-based+paracellular+pores:+identification+of+an+electrostatic+interaction+site.">Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: identification of an electrostatic interaction site.</a> The Journal of General Physiology. 133 (1), 111-127 (2009).</li><li>Kasahara, H., Aoki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+using+adenoviral+RNAi+vector+in+vascular+smooth+muscle+cells+and+cardiomyocytes.">Gene silencing using adenoviral RNAi vector in vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes.</a> Methods in Molecular Medicine. 112, 155-172 (2005).</li><li>Bolognesi, B., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaching+the+limit.">Reaching the limit.</a> eLife. 7, 39804 (2018).</li><li>Atasheva, S., Shayakhmetov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+responses+to+adenovirus+and+adenovirus+vectors.">Cytokine responses to adenovirus and adenovirus vectors.</a> Viruses. 14 (5), 888 (2022).</li><li>Sanchez Freire, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+may+mediate+the+down-regulation+of+neurokinin-1+receptor+in+chronic+bladder+pain+syndrome.">MicroRNAs may mediate the down-regulation of neurokinin-1 receptor in chronic bladder pain syndrome.</a> American Journal of Pathology. 176 (1), 288-303 (2010).</li></ol>

Ramesh et al. 방광암 치료에 아데노바이러스 형질도입을 사용하기 위한 전략 개발에 초점을 맞추었지만 18, 보다 최근의 보고서에서는 정상적인 요로상피 생물학/생리학 및 병태생리학을 연구하는 데 이러한 기술의 유용성을 입증했습니다 10,18,19,20,21 . 이 접?...

요로상피(urothelium)는 신장 골반, 요관, 방광, 근위 요도를 둘러싸고 있는 특수 상피이다1. 그것은 3 개의 지층으로 구성되어 있습니다 : 고도로 분화되고 분극화 된 종종 이중 핵 우산 세포의 층으로, 정점 표면은 소변으로 목욕됩니다. 이들의 급성 손실에 반응하여 표재성 우산 세포를 발생시킬 수 있는 이핵-전이-증폭 세포의 집단을 갖는 중간 세포층; 및 기저 세포의 단일 층, 그 하위 집합은 만성 손상에 대한 반응으로 요로 상피 전체를 재생할 수 있는 줄기 세포로 기능합니다. 우산 세포는 주로 고내성 요로상피 장벽을 형성하는 역할을 하며, 그 구성 요소에는 물과 용질에 대한 투과성이 낮은 정점막(콜레스테롤과 세레브로사이드가 풍부함)과 고저항 정점 접합 복합체(밀착 접합부, 부착 접합부, 데스모솜 및 관련 악토미오신 고리로 구성됨)가 포함됩니다.1 . 우산 세포의 정점 표면과 접합 링은 모두 방광 충전 중에 확장되고 1,2,3,4,5를 배뇨한 후 빠르게 미리 채워진 상태로 돌아갑니다. 장벽 기능에서의 역할 외에도 요로피는 세포외 환경의 변화(예: 스트레칭)를 감지하고 매개체(ATP, 아데노신 및 아세틸콜린 포함)의 방출을 통해 이 정보를 전달하여 이 정보를 비뇨상피하 구심성 신경 과정을 포함한 기저 조직으로 전달할 수 있는 감각 및 변환기 기능을 가지고 있다는 가설이 있습니다 6,7,8 . 이 역할에 대한 최근의 증거는 Piezo1과 Piezo2 모두의 요로상피 발현이 결여된 마우스에서 발견되며, 이는 변경된 배뇨 기능을 초래합니다9. 또한, 우산 세포층에서 밀착 접합 기공 형성 단백질인 CLDN2를 과발현하는 쥐는 간질성 방광염 환자에서 볼 수 있는 것과 유사한 염증과 통증을 일으킨다10. 요로상피관/변환기/장벽 기능의 파괴가 여러 방광 장애에 기여할 수 있다는 가설이 있습니다 6,11.
정상 및 질병 상태에서 요로상피의 생물학에 대한 더 나은 이해는 연구자가 내인성 유전자 발현을 쉽게 하향 조절하거나 천연 조직에서 이식유전자의 발현을 허용할 수 있는 도구의 가용성에 달려 있습니다. 유전자 발현을 하향 조절하는 한 가지 접근법은 조건부 요로상피 녹아웃 마우스를 생성하는 것이지만, 이 접근법은 플록스 대립유전자가 있는 마우스의 가용성에 따라 달라지며 노동 집약적이며 완료하는 데 수개월에서 수년이 걸릴 수 있습니다12. 당연히 연구자들은 요로상피를 형질주입하거나 형질도입하는 기술을 개발했으며, 이는 더 짧은 시간 규모로 결과를 가져올 수 있습니다. 형질감염을 위해 공개된 방법은 양이온성 지질13, 안티센스 포스포로티오화 올리고데옥시뉴클레오티드 14, 또는 HIV TAT 단백질 침투 11-mer 펩티드15에 테더링된 안티센스 핵산의 사용을 포함한다. 그러나 이 프로토콜의 초점은 광범위한 세포에 대한 유전자 전달에 효율적인 잘 연구된 방법론인 아데노비랄 매개 형질도입의 사용에 있으며, 수많은 임상 시험에서 테스트되었으며, 가장 최근에는 COVID-19 캡시드 단백질을 암호화하는 cDNA를 COVID-19 백신의 한 변종 수혜자에게 전달하는 데 사용되었습니다16, 17. 아데노바이러스 수명 주기, 아데노바이러스 벡터 및 아데노바이러스의 임상적 적용에 대한 보다 자세한 설명은 독자가 참조17을 참조하도록 지시합니다.
요로상피를 형질도입하기 위한 아데노바이러스 사용의 중요한 이정표는 Ramesh et al. N-도데실-β-D-말토사이드(DDM)를 포함한 세제로 짧은 전처리가 β-갈락토시다아제를 암호화하는 아데노바이러스에 의한 요로상피의 형질도입을 극적으로 향상시켰습니다18. 이 원리 증명 연구를 지침으로 사용하여 요로상피의 아데노비랄 매개 형질도입은 이제 Rab-family GTPases, 구아닌-뉴클레오티드 교환 인자, 미오신 운동 단편, 기공 형성 밀착 접합 관련 클라우딘 및 ADAM17 10,19,20,21,22 . 동일한 접근법이 작은 간섭 RNA(siRNA)를 발현하도록 조정되었으며, 그 효과는 이식유전자22의 siRNA 내성 변이체를 공동 발현함으로써 구출되었습니다. 여기에 설명된 프로토콜에는 이러한 기술에 대한 요구 사항인 고농축 아데노바이러스를 대량으로 생성하는 일반적인 방법과 요로상피에서 이식유전자를 고효율로 발현하기 위한 Ramesh et al.18의 방법의 적응이 포함됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL pipette</td>
			<td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td>
			<td>CLS4488</td>
			<td>sterile, serological pipette, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mL ultracentrifuge tube</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>06-752</td>
			<td>PET thinwall ultracentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352097</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G needle</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>305196</td>
			<td>18 G x 1.5 in needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL pipette</td>
			<td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td>
			<td>CLS4489</td>
			<td>sterile, serological pipette, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352098</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipette</td>
			<td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td>
			<td>CLS4487</td>
			<td>sterile, serological pipette, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cavicide</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>6400012</td>
			<td>Anti-viral solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish - 15 cm</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>353025</td>
			<td>sterile, tissue-culture treated&#160; (150 mm x 25 mm dish)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>893.1832</td>
			<td>handle length 24 cm, blade length 1.7 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C-4306</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM culture medium (high glucose)</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11965092</td>
			<td>with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>EDS</td>
			<td>Bioiultra grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Hyclone (Cytiva)</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td>defined serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td>5.75 in glass pipette, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G-5516</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV catheter - mouse</td>
			<td>Smith Medical Jelco</td>
			<td>3063</td>
			<td>24 G x 3/4 in Safety IV catheter&#160; radiopaque</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV catheter - rat</td>
			<td>Smith Medical Jelco</td>
			<td>3060</td>
			<td>22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P-9541</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>Cell culture grade&#160; &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#8226;7 H2O</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>431478</td>
			<td>&#160;&#8805; 99.99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-dodecyl-&#946;-D-maltoside&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4641</td>
			<td>&#160;&#8805; 98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nose cone for multiple animals</td>
			<td>custom designed</td>
			<td></td>
			<td>commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-10 column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-085-01</td>
			<td>Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin antibiotic (100x)</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>15070063</td>
			<td>100x concentrated solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>BioPhotometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stand and clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-679Q and 05-769-8FQ</td>
			<td>available from numerous suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter unit</td>
			<td>Fisher Scientific (Nalgene)</td>
			<td>09-740-65B</td>
			<td>0.2 &#181;m rapid-flow filter unit (150 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter unit 0.2 &#181;m (syringe)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td>Millipore Sigma Milex 0.22 &#181;m filter unit that attaches to syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super speed centrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5810R</td>
			<td>with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1 mL)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>309628</td>
			<td>1-mL syringe Luer-lok tip - sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (3 mL)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>309656</td>
			<td>3-mL syringe slip tip - sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table-top centrifuge (low speed)</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5702</td>
			<td>with swinging bucket rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td>polyethylene 3.4 mL transfer pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>648310-M</td>
			<td>Molecular Biology grade&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE select protease solution</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>12604013</td>
			<td>TrypLE express enzyme (1x), no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-80 XP</td>
			<td>with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporizer&#160;</td>
			<td>General Anesthetic Services, Inc.</td>
			<td>Tec 3</td>
			<td>Isoflurane vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td>analog vortex mixer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of transgenes in native bladder urothelium using adenovirus-mediated transduction

고저항 장벽을 형성하는 것 외에도 신장 골반, 요관, 방광 및 근위 요도를 둘러싸고 있는 요로상피는 환경에 대한 정보를 감지하고 기저 조직으로 전달하여 배뇨 기능과 행동을 촉진하는 것으로 가정됩니다. 요로상피장벽 또는 감각/변환기 기능의 파괴는 질병을 유발할 수 있습니다. 이러한 복잡한 사건을 연구하는 것은 요로상피에서 유전자와 단백질 발현을 변화시키는 간단한 전략이 없기 때문에 방해를 받습니다. 연구자가 다량의 고역가 아데노바이러스를 생성할 수 있도록 하는 방법이 여기에 설명되어 있으며, 이를 사용하여 설치류 요로상피를 고효율로 비교적 간단한 방식으로 형질도입할 수 있습니다. cDNA와 작은 간섭 RNA는 모두 아데노바이러스 형질도입을 사용하여 발현될 수 있으며, 요로상피 기능에 대한 이식유전자 발현의 영향은 12시간에서 며칠 후에 평가할 수 있습니다. 이러한 방법은 마우스 또는 쥐 동물 모델을 사용한 정상 및 비정상 요로상피 생물학 연구에 광범위하게 적용할 수 있습니다.

바이러스 준비 밀도 구배 원심분리에 의한 바이러스 정제의 예가 도 1A에 제시되어 있다. 로드된 세포 물질과 1.25g/mL CsCl 층의 계면에서 발견되는 연한 분홍색 띠는 주로 파괴된 세포와 그 파편으로 구성됩니다( 그림 1A의 자홍색 화살표 참조). 그것은 프로토콜의 1.5 단계에서 이월되는 소량의 배양 배지에서 분홍빛이 도는 색을 띤다. 유백...

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Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction

다량의 재조합 아데노바이러스의 생성에 대한 방법이 기재되어 있으며, 이는 이식유전자의 발현 또는 내인성 유전자 산물의 하향조절을 허용하는 천연 설치류 요로상피를 형질도입하는 데 사용될 수 있습니다.

아데노바이러스 매개 형질도입을 이용한 천연 방광 요로상피에서의 형질전환 유전자의 발현

In addition to forming a high-resistance barrier, the urothelium lining the renal pelvis, ureters, bladder, and proximal urethra is hypothesized to sense ...

이 프로토콜은 조사자가 천연 방광 요로상피에서 CDNA 또는 SIRNA를 발현할 수 있도록 하는 방법을 설명합니다. 이 기술의 주요 장점은 상대적으로 단순성, 요로상피에서 cDNA, siRNA를 고효율로 비교적 짧은 시간 내에 발현하는 능력입니다. 이 기술의 가장 어려운 부분은 카테터 삽입입니다.그러나 전반적인 기술은 한 번 배우면 비교적 쉽게 마스터할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구 전문가 IV인 Giovanni Ruiz가 될 것입니다. 시작하려면 마취 된 마우스를 코 콘 옆의 가열 패드에 놓습니다.프로토콜 기간 동안 동물을 마취 상태로 유지하십시오. 마우스가 발가락 핀치로 완전히 마취되었는지 확인합니다. 방광으로 공기가 유입되는 것을 방지하려면 멸균 이송 피펫 또는 주사기를 사용하여 IV 카테터 및 관련 허브의 플라스틱 카테터 부분을 멸균 PBS로 채웁니다.앙와위 자세의 동물과 함께 외부 요도 비도를 70 % 알코올로 닦습니다. 그런 다음 외부 요도 비도를 형성하는 조직을 부드럽게 잡고 미세한 집게를 사용하여 동물에서 수직으로 확장합니다. 멸균 카테터를 외부 비도에 삽입합니다.다른 손을 사용하여 카테터를 요도 비도에 약 3-4mm 수직으로 조심스럽게 삽입합니다. 그런 다음 외부 비도에 삽입 된 카테터를 동물의 꼬리쪽으로 내리면 치골 아래를 통과하여 궁극적으로 방광으로 들어가는 요도 부분으로 쉽게 들어갈 수 있습니다. 방광의 소변이 새어 나오도록하십시오.Crede의 조작을 수행하여 하복부 부위의 방광 범프를 마사지하고 부드럽게 눌러 잔류 소변을 제거합니다. 요로상피가 형질도입을 수용하도록 하려면 PBS로 채워진 멸균된 1밀리리터 주사기를 카테터 허브에 부착하여 마우스 또는 쥐 방광을 세척합니다. 100마이크로리터의 멸균 PBS를 마우스 방광에 주입합니다.카테터 피팅에서 주사기를 분리한 후 PBS가 배출되도록 합니다. PBS에 용해된 0.1%N-도데실-베타-D-말토사이드 100마이크로리터를 주입하고 멸균된 1밀리리터 주사기를 사용하여 마우스 방광에 멸균된 0.2마이크로미터 필터를 주입합니다. 주사기를 제자리에 두고 N-dodecyl-beta-D-maltoside를 방광에 10분 동안 유지합니다.주사기를 분리하고 배출되도록 하여 방광에서 N-dodecyl-beta-D-maltoside를 제거합니다. 방광에 바이러스를 도입하려면 멸균 된 1 밀리리터 주사기를 카테터 허브에 부착하고 5, 000, 000에서 100, 000, 000 IVP의 아데노 바이러스를 100 마이크로 리터의 멸균 PBS에 희석하거나 쥐의 경우 450 마이크로 리터를 방광에 주입하십시오. 30분 후 주사기를 분리하고 바이러스 용액이 방광을 일회용 패드로 배출하도록 합니다.패드를 버리는 동안 흡수성 물티슈로 잔류 바이러스 용액을 닦아내고 생물학적 유해 폐기물로 닦아냅니다. 동물이 회복 할 수 있도록하려면 이소 플루 란의 흐름을 중단하십시오. 특히 동물이 집단 사육장인 경우 새장으로 돌려보내기 전에 동물이 회복되고 완전히 움직일 수 있도록 하십시오.mRNA in situ hybridization, western blot 또는 immunofluorescence와 같은 방법을 사용하여 처리 후 12 내지 72시간 후에 이식유전자 발현의 효과를 분석한다. 요로상피 용해물의 웨스턴 블롯 분석은 형질도입된 방광의 요로상피에서 V5 태그가 부착된 인간 성장 호르몬 발현을 나타내었지만 형질도입되지 않은 방광에서는 발현되지 않았습니다. 또한 인간 성장 호르몬 또는 V5 에피토프 태그를 인식하는 항체를 이용한 면역형광법으로도 발현을 확인하였다.웨스턴 블롯 분석은 아데노바이러스로 형질도입된 쥐에서 Claudin-2의 발현을 확인했지만 통제된 GFP-인코딩 바이러스로 형질도입된 쥐에서는 확인되지 않았습니다. 면역형광 분석은 바이러스-코딩 Claudin-2 cDNA로 형질도입된 요로상피우산 세포에서 외인성 Claudin-2 발현을 추가로 확인했습니다. 전체 장착 또는 단면 요로상피의 면역형광 및 공초점 현미경에 의한 Tight Junction Protein 1의 외인성 Claudin-2의 검출은 세포 세포질에서 Tight Junction의 존재 및 Claudin-2의 세포 내 축적을 밝혀냈습니다.이미지 필드는 형질도입된 우산 세포의 수를 세면 95%에 가까운 효율이 나타나고 방광벽 전체에서 요로상피만 형질도입되고 주입된 아데노바이러스에 의해 표적이 되는 다른 조직은 없음을 보여줍니다. 카테터 삽입은 프로토콜이 의도한 대로 작동하는 데 중요합니다. 이 기술을 통해 연구자는 정상적인 요로상피 생물학을 연구할 수 있을 뿐만 아니라 단백질 과발현 또는 과소 발현이 질병을 유발하는 상태를 이해할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Targeted Expression of GFP in the Hair Follicle Using Ex Vivo Viral Transduction

예 VIVO 바이러스성 전달을 사용하여 헤어 대과에 GFP 타겟팅 표현

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft ...

연구

생물학

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Electroporation에 대한 Murine 골수에서 조혈 세포 차 문화의 준비

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Detection of Protein Ubiquitination

단백질 Ubiquitination의 감지

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

고효율 기본 셀을 Transfect하는 진 Pulser Electroporation MXcell의 시스템을 사용하여

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

유전자 발현 연구를 단순화하는 자동 셀 카운터를 사용하여 : Namalwa 셀에서 IL - 4 종속 유전자 발현의 siRNA의 최저

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

교양 차 마우스 배아 섬유아 세포의 신호 분자의 아데노 바이러스 - 매개 유전자 제거

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

활성 T.의 체외의 Reconstitution에서 castaneum의 Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

유전자 인코딩 분자 프로브는 G 단백질 결합 수용체를 연구하는

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

포르말린에서 프로테오믹스 샘플 준비 파라핀 조직에게 고정 및

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...