Name: expression of transgenes in native bladder urothelium using adenovirus-mediated transduction
Uploaded: 2022-10-06T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av en pilotprosjektpris gjennom P30DK079307 (til M.G.D.), NIH grant R01DK119183 (til GA og MDC), NIH grant R01DK129473 (til GA), en American Urology Association Career Development award og et Winters Foundation-stipend (til NM), av Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores fra Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307), og av S10OD028596 (til GA), som finansierte innkjøpet av konfokalsystemet som ble brukt til å fange noen av bildene som presenteres i dette manuskriptet.

Eksperimenter som involverer generering av adenovirus, som krever BSL2-sertifisering, ble utført under godkjenning fra University of Pittsburgh Environmental Health and Safety kontorer og Institutional Biosafety Committee. Alle dyreforsøk som ble utført, inkludert adenoviral transduksjon (som krever ABSL2-sertifisering), ble gjort i samsvar med relevante retningslinjer / forskrifter i Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals og dyrevelferdsloven, og under godkjenning av University of P...

<ol>
	<li>Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Urothelium:+Life+in+a+liquid+environment.">The Urothelium: Life in a liquid environment.</a> Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).</li><li>Truschel, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-regulated+exocytosis/endocytosis+in+bladder+umbrella+cells.">Stretch-regulated exocytosis/endocytosis in bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (3), 830-846 (2002).</li><li>Lewis, S. A., de Moura, J. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+cytoplasmic+vesicles+into+apical+membrane+of+mammalian+urinary+bladder+epthelium.">Incorporation of cytoplasmic vesicles into apical membrane of mammalian urinary bladder epthelium.</a> Nature (London). 297 (5868), 685-688 (1982).</li><li>Eaton, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+contraction+of+the+umbrella+cell+apical+junctional+ring+in+response+to+bladder+filling+and+voiding.">Expansion and contraction of the umbrella cell apical junctional ring in response to bladder filling and voiding.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (16), 2037-2052 (2019).</li><li>Yu, W., Khandelwal, P., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+apical+and+basolateral+membrane+requirements+for+stretch-induced+membrane+traffic+at+the+apical+surface+of+bladder+umbrella+cells.">Distinct apical and basolateral membrane requirements for stretch-induced membrane traffic at the apical surface of bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (1), 282-295 (2009).</li><li>Birder, L., Andersson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+signaling.">Urothelial signaling.</a> Physiological Reviews. 93 (2), 653-680 (2013).</li><li>Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+bladder,+cystitis+and+nerve/urothelial+interactions.">Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions.</a> Autonomic Neuroscience. 182, 89-94 (2014).</li><li>Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+uroepithelial-associated+sensory+web.">The uroepithelial-associated sensory web.</a> Kidney International. 72 (9), 1057-1064 (2007).</li><li>Dalghi, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+for+PIEZO1+and+PIEZO2+in+urothelial+mechanotransduction+and+lower+urinary+tract+interoception.">Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (19), 152984 (2021).</li><li>Montalbetti, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+urothelial+paracellular+transport+promotes+cystitis.">Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis.</a> American Journal of Physiology: Renal Physiology. 309 (12), 1070-1081 (2015).</li><li>Keay, S. K., Birder, L. A., Chai, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+bladder+urothelial+pathophysiology+in+functional+bladder+disorders.">Evidence for bladder urothelial pathophysiology in functional bladder disorders.</a> BioMed Research International. 2014, 865463 (2014).</li><li>Friedel, R. H., Wurst, W., Wefers, B., Kuhn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+conditional+knockout+mice.">Generating conditional knockout mice.</a> Methods in Molecular Biology. 693, 205-231 (2011).</li><li>Kashyap, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+nerve+growth+factor+expression+in+the+bladder+by+antisense+oligonucleotides+as+new+treatment+for+overactive+bladder.">Down-regulation of nerve growth factor expression in the bladder by antisense oligonucleotides as new treatment for overactive bladder.</a> Journal of Urology. 190 (2), 757-764 (2013).</li><li>Bolenz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+and+ex+vivo+urothelial+penetration+by+oligodeoxynucleotides+for+optimizing+treatment+of+transitional+cell+carcinoma.">Cellular uptake and ex vivo urothelial penetration by oligodeoxynucleotides for optimizing treatment of transitional cell carcinoma.</a> Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 30 (5), 265-273 (2008).</li><li>Tyagi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravesical+antisense+therapy+for+cystitis+using+TAT-peptide+nucleic+acid+conjugates.">Intravesical antisense therapy for cystitis using TAT-peptide nucleic acid conjugates.</a> Molecular Pharmaceutics. 3 (4), 398-406 (2006).</li><li>Sadoff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interim+results+of+a+phase+1-2a+trial+of+Ad26.COV2.S+Covid-19+vaccine.">Interim results of a phase 1-2a trial of Ad26.COV2.S Covid-19 vaccine.</a> New England Journal of Medicine. 384 (19), 1824-1835 (2021).</li><li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+delivery:+Potential+applications+for+gene+and+cell-Based+therapies+in+the+new+era+of+personalized+medicine.">Adenovirus-mediated gene delivery: Potential applications for gene and cell-Based therapies in the new era of personalized medicine.</a> Genes &amp; Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).</li><li>Ramesh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+pretreatment+agents+to+enhance+adenovirus+infection+of+bladder+epithelium.">Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium.</a> Molecular Therapy. 10 (4), 697-705 (2004).</li><li>Khandelwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab11a-dependent+exocytosis+of+discoidal/fusiform+vesicles+in+bladder+umbrella+cells.">Rab11a-dependent exocytosis of discoidal/fusiform vesicles in bladder umbrella cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15773-15778 (2008).</li><li>Khandelwal, P., Ruiz, W. G., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+endocytosis+in+bladder+umbrella+cells+occurs+through+an+integrin-regulated+and+RhoA-+and+dynamin-dependent+pathway.">Compensatory endocytosis in bladder umbrella cells occurs through an integrin-regulated and RhoA- and dynamin-dependent pathway.</a> The European Molecular Biology Organization journal. 29 (12), 1961-1975 (2010).</li><li>Khandelwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rab11a-Rab8a-Myo5B+network+promotes+stretch-regulated+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells.">A Rab11a-Rab8a-Myo5B network promotes stretch-regulated exocytosis in bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 24 (7), 1007-1019 (2013).</li><li>Prakasam, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A1+adenosine+receptor-stimulated+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells+requires+phosphorylation+of+ADAM17+Ser811+and+EGF+receptor+transactivation.">A1 adenosine receptor-stimulated exocytosis in bladder umbrella cells requires phosphorylation of ADAM17 Ser811 and EGF receptor transactivation.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3798-3812 (2014).</li><li>Gallo, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAB27B+requirement+for+stretch-induced+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells.">RAB27B requirement for stretch-induced exocytosis in bladder umbrella cells.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 314 (3), 349-365 (2018).</li><li>Amasheh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-2+expression+induces+cation-selective+channels+in+tight+junctions+of+epithelial+cells.">Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 115, 4969-4976 (2002).</li><li>Yu, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+cation+selectivity+in+claudin-2-based+paracellular+pores:+identification+of+an+electrostatic+interaction+site.">Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: identification of an electrostatic interaction site.</a> The Journal of General Physiology. 133 (1), 111-127 (2009).</li><li>Kasahara, H., Aoki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+using+adenoviral+RNAi+vector+in+vascular+smooth+muscle+cells+and+cardiomyocytes.">Gene silencing using adenoviral RNAi vector in vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes.</a> Methods in Molecular Medicine. 112, 155-172 (2005).</li><li>Bolognesi, B., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaching+the+limit.">Reaching the limit.</a> eLife. 7, 39804 (2018).</li><li>Atasheva, S., Shayakhmetov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+responses+to+adenovirus+and+adenovirus+vectors.">Cytokine responses to adenovirus and adenovirus vectors.</a> Viruses. 14 (5), 888 (2022).</li><li>Sanchez Freire, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+may+mediate+the+down-regulation+of+neurokinin-1+receptor+in+chronic+bladder+pain+syndrome.">MicroRNAs may mediate the down-regulation of neurokinin-1 receptor in chronic bladder pain syndrome.</a> American Journal of Pathology. 176 (1), 288-303 (2010).</li></ol>

Mens Ramesh et al. var fokusert på å utvikle strategier for å bruke adenoviral transduksjon i behandlingen av blærekreft 18, har nyere rapporter vist nytten av disse teknikkene i å studere normal urotelbiologi / fysiologi og patofysiologi 10,18,19,20,21 . De viktige funksjonene i denne tilnærmingen inkluderer følgende: (i) I hele...

Urotelet er det spesialiserte epitelet som strekker nyrebekkenet, urinlederne, blæren og det proksimale urinrøret1. Den består av tre lag: et lag av svært differensierte og polariserte ofte bi-nukleate paraplyceller, hvis apikale overflater er badet i urin; et mellomliggende cellelag med en populasjon av bi-nukleate transittforsterkende celler som kan gi opphav til overfladiske paraplyceller som svar på deres akutte tap; og et enkelt lag av basale celler, en delmengde som fungerer som stamceller som kan regenerere hele urotelet som respons på kronisk skade. Paraplyceller er hovedsakelig ansvarlige for å danne den høyresistente urotelbarrieren, hvorav komponenter inkluderer en apikal membran (rik på kolesterol og cerebrosider) med lav permeabilitet for vann og løsemidler, og et apikalt krysskompleks med høy motstand (bestående av tette kryss, adherenskryss, desmosomer og en tilhørende aktomyosinring)1 . Både den apikale overflaten av paraplycellen og dens kryssring utvides under blærefylling og går raskt tilbake til sin ferdigfylte tilstand etter tømming 1,2,3,4,5. I tillegg til sin rolle i barrierefunksjon, er urotelet også antatt å ha sensoriske og transduserfunksjoner som gjør det mulig å oppdage endringer i det ekstracellulære miljøet (f.eks. Stretch) og overføre denne informasjonen via frigjøring av mediatorer (inkludert ATP, adenosin og acetylkolin) til underliggende vev, inkludert suburoteliale afferente nerveprosesser 6,7,8 . Nyere bevis på denne rollen er funnet hos mus som mangler uroteluttrykk for både Piezo1 og Piezo2, noe som resulterer i endret vannlatingsfunksjon9. I tillegg utvikler rotter som overuttrykker det poredannende proteinet CLDN2 i paraplycellelaget betennelse og smerte som er analog med det som ses hos pasienter med interstitiell cystitt10. Det er en hypotese at forstyrrelse av urotelial sensorisk/transduser eller barrierefunksjon kan bidra til flere blærelidelser 6,11.
En bedre forståelse av urotelets biologi i normale og sykdomstilstander avhenger av tilgjengeligheten av verktøy som gjør det mulig for etterforskere å lett nedregulere endogent genuttrykk eller tillate ekspresjon av transgener i det opprinnelige vevet. Mens en tilnærming til å nedregulere genuttrykk er å generere betingede urotelial knockoutmus, avhenger denne tilnærmingen av tilgjengeligheten av mus med floxed alleler, er arbeidsintensiv og kan ta måneder til år å fullføre12. Ikke overraskende da har forskere utviklet teknikker for å transfektere eller transducere urotelet, noe som kan føre til resultater på kortere tidsskala. Publiserte metoder for transfeksjon inkluderer bruk av kationiske lipider13, anti-sense fosforothioated oligodeoxynucleotides 14, eller antisense nukleinsyrer bundet til HIV TAT protein penetrerende 11-mer peptid15. Imidlertid er fokuset i denne protokollen på bruk av adenoviral-mediert transduksjon, en godt studert metodikk som er effektiv ved genlevering til et bredt spekter av celler, har blitt testet i en rekke kliniske studier, og ble nylig brukt til å levere cDNA som koder for COVID-19-kapsidproteinet til mottakere av en variant av COVID-19-vaksinen16, 17. For en grundigere beskrivelse av adenovirusets livssyklus, adenovirale vektorer og kliniske anvendelser av adenovirus, henvises leseren til referanse17.
En viktig milepæl i bruken av adenovirus for å transducere urotelet, var en rapport fra Ramesh et al. som viste korte forbehandlinger med vaskemidler, inkludert N-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) dramatisk forbedret transduksjon av urotelet av et adenovirus som koder for β-galaktosidase18. Ved å bruke denne proof-of-principle-studien som en veiledning, har adenoviral-mediert transduksjon av urotelet nå blitt brukt til å uttrykke en rekke proteiner, inkludert Rab-familie GTPaser, guanin-nukleotidutvekslingsfaktorer, myosinmotoriske fragmenter, poredannende tette kryssassosierte klaudiner og ADAM17 10,19,20,21,22 . Den samme tilnærmingen ble tilpasset for å uttrykke små forstyrrende RNA (siRNA), hvis effekter ble reddet ved å uttrykke siRNA-resistente varianter av transgen22. Protokollen beskrevet her inkluderer generelle metoder for å generere store mengder høykonsentrert adenovirus, et krav til disse teknikkene, samt tilpasninger av metodene til Ramesh et al.18 for å uttrykke transgener i urotelet med høy effektivitet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL pipette</td>
			<td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td>
			<td>CLS4488</td>
			<td>sterile, serological pipette, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mL ultracentrifuge tube</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>06-752</td>
			<td>PET thinwall ultracentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352097</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G needle</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>305196</td>
			<td>18 G x 1.5 in needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL pipette</td>
			<td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td>
			<td>CLS4489</td>
			<td>sterile, serological pipette, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352098</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipette</td>
			<td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td>
			<td>CLS4487</td>
			<td>sterile, serological pipette, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cavicide</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>6400012</td>
			<td>Anti-viral solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish - 15 cm</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>353025</td>
			<td>sterile, tissue-culture treated&#160; (150 mm x 25 mm dish)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>893.1832</td>
			<td>handle length 24 cm, blade length 1.7 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C-4306</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM culture medium (high glucose)</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11965092</td>
			<td>with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>EDS</td>
			<td>Bioiultra grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Hyclone (Cytiva)</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td>defined serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td>5.75 in glass pipette, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G-5516</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV catheter - mouse</td>
			<td>Smith Medical Jelco</td>
			<td>3063</td>
			<td>24 G x 3/4 in Safety IV catheter&#160; radiopaque</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV catheter - rat</td>
			<td>Smith Medical Jelco</td>
			<td>3060</td>
			<td>22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P-9541</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>Cell culture grade&#160; &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#8226;7 H2O</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>431478</td>
			<td>&#160;&#8805; 99.99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-dodecyl-&#946;-D-maltoside&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4641</td>
			<td>&#160;&#8805; 98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nose cone for multiple animals</td>
			<td>custom designed</td>
			<td></td>
			<td>commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-10 column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-085-01</td>
			<td>Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin antibiotic (100x)</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>15070063</td>
			<td>100x concentrated solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>BioPhotometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stand and clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-679Q and 05-769-8FQ</td>
			<td>available from numerous suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter unit</td>
			<td>Fisher Scientific (Nalgene)</td>
			<td>09-740-65B</td>
			<td>0.2 &#181;m rapid-flow filter unit (150 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter unit 0.2 &#181;m (syringe)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td>Millipore Sigma Milex 0.22 &#181;m filter unit that attaches to syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super speed centrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5810R</td>
			<td>with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1 mL)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>309628</td>
			<td>1-mL syringe Luer-lok tip - sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (3 mL)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>309656</td>
			<td>3-mL syringe slip tip - sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table-top centrifuge (low speed)</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5702</td>
			<td>with swinging bucket rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td>polyethylene 3.4 mL transfer pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>648310-M</td>
			<td>Molecular Biology grade&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE select protease solution</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>12604013</td>
			<td>TrypLE express enzyme (1x), no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-80 XP</td>
			<td>with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporizer&#160;</td>
			<td>General Anesthetic Services, Inc.</td>
			<td>Tec 3</td>
			<td>Isoflurane vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td>analog vortex mixer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of transgenes in native bladder urothelium using adenovirus-mediated transduction

I tillegg til å danne en høy motstandsbarriere, er urotelet som fôrer nyrebekkenet, urinlederne, blæren og proksimale urinrøret hypoteset for å fornemme og overføre informasjon om miljøet til det underliggende vevet, fremme tømmingsfunksjon og oppførsel. Forstyrrelse av urotelbarrieren, eller dens sensoriske / transduserfunksjon, kan føre til sykdom. Å studere disse komplekse hendelsene hindres av mangel på enkle strategier for å endre gen- og proteinuttrykk i urotelet. Metoder er beskrevet her som gjør det mulig for etterforskere å generere store mengder høytiter adenovirus, som deretter kan brukes til å transdusere gnagerurotel med høy effektivitet, og på en relativt enkel måte. Både cDNA og små forstyrrende RNA kan uttrykkes ved hjelp av adenoviral transduksjon, og virkningen av transgen ekspresjon på urotelfunksjonen kan vurderes 12 timer til flere dager senere. Disse metodene har bred anvendelighet for studier av normal og unormal urotelbiologi ved bruk av muse- eller rottedyrmodeller.

Virus forberedelse Et eksempel på virusrensing ved sentrifugering av tetthetsgradient er vist i figur 1A. Det lysrosa båndet, som finnes ved grensesnittet mellom det lastede cellematerialet og 1,25 g/ml CsCl-laget, består hovedsakelig av forstyrrede celler og deres rusk (se magenta pil i figur 1A). Den henter sin rosa farge fra den lille mengden kulturmedium som overføres fra trinn 1.5 i protokollen. Viruspartiklene av interesse, som vise...

Watch this Scientific Journal Video about Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction at JoVE.com

Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction

Metoder er beskrevet for generering av store mengder rekombinante adenovirus, som deretter kan brukes til å transducere det opprinnelige gnagerurotelet som muliggjør ekspresjon av transgener eller nedregulering av endogene genprodukter.

Ekspresjon av transgener i naturlig blære urotel ved bruk av adenovirusmediert transduksjon

In addition to forming a high-resistance barrier, the urothelium lining the renal pelvis, ureters, bladder, and proximal urethra is hypothesized to sense ...

Denne protokollen beskriver metoder som tillater etterforskere å uttrykke CDNA eller SIRNA i det opprinnelige blæreurotelet. De viktigste fordelene ved denne teknikken er dens relative enkelhet, evnen til å uttrykke cDNA, siRNA i urotelet med høy effektivitet, og innen en relativt kort periode. Den vanskeligste delen av denne teknikken er kateteriseringen.Imidlertid er den generelle teknikken relativt lett å mestre når den er lært. Demonstrere prosedyren vil være Giovanni Ruiz, en forskningsspesialist IV i laboratoriet mitt. For å begynne, plasser den bedøvede musen på en varmepute ved siden av nesekeglene.Opprettholde dyret under anestesi i løpet av protokollen. Bekreft at musen er fullstendig bedøvet med en tåklemme. For å unngå å innføre luft inn i blæren, fyll plastkateterdelen av et IV-kateter og tilhørende nav med steril PBS ved hjelp av en steril overføringspipette eller sprøyte.Med dyret i den bakre posisjonen vattpinne den ytre urinrøret meatus med 70% alkohol. Ta deretter forsiktig tak i vevet som danner den eksterne urinrøret og forleng den vertikalt bort fra dyret ved hjelp av fine tang. Sett det sterile kateteret inn i den eksterne meatusen.Bruk den andre hånden forsiktig inn kateteret vertikalt ca tre til fire millimeter inn i urinrøret meatus. Senk deretter kateteret som er satt inn i den ytre meatus mot dyrets hale, noe som letter inngangen til den delen av urinrøret som passerer under skambenet og til slutt inn i blæren. La urinen i blæren lekke ut.Fjern eventuell resturin ved å utføre Credes manøver ved å massere og forsiktig trykke ned på blærebumpen i nedre del av bukområdet. For å gjøre urotelet mottakelig for transduksjon, vask musen eller rotteblæren ved å feste en steril en milliliter sprøyte fylt med PBS til kateternavet. Injiser 100 mikroliter steril PBS i museblæren.Etter at sprøyten er løsnet fra kateterbeslaget, la PBS renne av. Instill 100 mikroliter 0,1% N-dodecyl-beta-D-maltosid oppløst i PBS og 0,2 mikrometer filter sterilisert inn i museblæren ved hjelp av en steril en-milliliter sprøyte. Behold N-dodecyl-beta-D-maltosid i blæren i 10 minutter ved å la sprøyten være på plass.Fjern N-dodecyl-beta-D-maltosid fra blæren ved å løsne sprøyten og la den renne ut. For å introdusere viruset i blæren, fest en steril en-milliliter sprøyte til kateternavet og innstill 5.000.000 til 100.000.000 IVP adenovirus fortynnet i 100 mikroliter steril PBS for mus eller 450 mikroliter for rotter i blæren. Etter 30 minutter, løsne sprøyten og la virusoppløsningen evakuere blæren på en engangspute.Blott eventuell gjenværende virusløsning med en absorberende våtserviett mens du kaster puten og tørk av biologisk farlig avfall. For å la dyret komme seg, må strømmen av isofluran opphøre. La dyret komme seg og være helt mobilt før det settes tilbake i buret, spesielt hvis dyrene er gruppert.Analyser effekten av transgenuttrykk 12 til 72 timer etter behandling ved hjelp av metoder som mRNA in situ hybridisering, Western blot eller immunfluorescens. Western blot-analyse av urotellysater viste V5-merket humant veksthormonuttrykk i urotelet i transducerte blærer, men ikke i utransducerte. Uttrykket ble også bekreftet av immunfluorescens ved bruk av antistoffer som gjenkjente humant veksthormon, eller V5-epitopmerket.Western blot-analyse bekreftet uttrykket av Claudin-2 hos rotter transducert med adenovirus, men ikke hos de som ble transdusert med et kontrollert GFP-kodende virus. Immunfluorescensanalyse bekreftet videre eksogent Claudin-2-uttrykk i uroteliale paraplyceller transdusert med viruskodende Claudin-2 cDNA. Påvisning av eksogen Claudin-2 i Tight Junction Protein 1 ved immunfluorescens og konfokal mikroskopi av helmontert eller tverrsnittet urotel avslørte tilstedeværelse av Tight Junction og intracellulære akkumuleringer av Claudin-2 i cellecytoplasma.Bildefeltet viser at telling av antall transducerte paraplyceller avslører en effektivitet som nærmer seg 95%og i hele blæreveggen blir bare urotelet transducert, og ingen andre vev er målrettet av det instillerte adenoviruset. Kateteriseringen er avgjørende for at protokollen skal fungere etter hensikten. Denne teknikken gjør det mulig for forskere å studere normal urotelbiologi, samt å forstå forhold der proteinoveruttrykk, eller underuttrykk, fører til sykdom.

Research

JoVE Journal

Biology

Targeted Expression of GFP in the Hair Follicle Using Ex Vivo Viral Transduction

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Genetisk kodet Molekylær Sonder til Study G protein-koblede reseptorer

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Proteomikk Prøvepreparering fra formalinfiksert og parafin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...