Name: expression of transgenes in native bladder urothelium using adenovirus-mediated transduction
Uploaded: 2022-10-06T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por um prêmio de projeto piloto através de P30DK079307 (para M.G.D.), NIH grant R01DK119183 (para G.A. e M.D.C.), NIH grant R01DK129473 (para G.A.), um prêmio American Urology Association Career Development e um grant Winters Foundation (para N.M.), pelo Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores do Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307), e pelo S10OD028596 (para G.A.), que financiou a compra do sistema confocal utilizado para capturar algumas das imagens apresentadas neste manuscrito.

Experimentos envolvendo a geração de adenovírus, que requer certificação BSL2, foram realizados sob aprovação dos escritórios de Saúde e Segurança Ambiental da Universidade de Pittsburgh e do Comitê Institucional de Biossegurança. Todos os experimentos com animais realizados, incluindo a transdução adenoviral (que requer a certificação ABSL2), foram feitos de acordo com as diretrizes/regulamentos relevantes da Política de Serviço de Saúde Pública sobre Cuidados Humanos e Uso de Animais de Laboratório...

<ol>
	<li>Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Urothelium:+Life+in+a+liquid+environment.">The Urothelium: Life in a liquid environment.</a> Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).</li><li>Truschel, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-regulated+exocytosis/endocytosis+in+bladder+umbrella+cells.">Stretch-regulated exocytosis/endocytosis in bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (3), 830-846 (2002).</li><li>Lewis, S. A., de Moura, J. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+cytoplasmic+vesicles+into+apical+membrane+of+mammalian+urinary+bladder+epthelium.">Incorporation of cytoplasmic vesicles into apical membrane of mammalian urinary bladder epthelium.</a> Nature (London). 297 (5868), 685-688 (1982).</li><li>Eaton, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+contraction+of+the+umbrella+cell+apical+junctional+ring+in+response+to+bladder+filling+and+voiding.">Expansion and contraction of the umbrella cell apical junctional ring in response to bladder filling and voiding.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (16), 2037-2052 (2019).</li><li>Yu, W., Khandelwal, P., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+apical+and+basolateral+membrane+requirements+for+stretch-induced+membrane+traffic+at+the+apical+surface+of+bladder+umbrella+cells.">Distinct apical and basolateral membrane requirements for stretch-induced membrane traffic at the apical surface of bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (1), 282-295 (2009).</li><li>Birder, L., Andersson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+signaling.">Urothelial signaling.</a> Physiological Reviews. 93 (2), 653-680 (2013).</li><li>Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+bladder,+cystitis+and+nerve/urothelial+interactions.">Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions.</a> Autonomic Neuroscience. 182, 89-94 (2014).</li><li>Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+uroepithelial-associated+sensory+web.">The uroepithelial-associated sensory web.</a> Kidney International. 72 (9), 1057-1064 (2007).</li><li>Dalghi, M. 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H., Wurst, W., Wefers, B., Kuhn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+conditional+knockout+mice.">Generating conditional knockout mice.</a> Methods in Molecular Biology. 693, 205-231 (2011).</li><li>Kashyap, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+nerve+growth+factor+expression+in+the+bladder+by+antisense+oligonucleotides+as+new+treatment+for+overactive+bladder.">Down-regulation of nerve growth factor expression in the bladder by antisense oligonucleotides as new treatment for overactive bladder.</a> Journal of Urology. 190 (2), 757-764 (2013).</li><li>Bolenz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+and+ex+vivo+urothelial+penetration+by+oligodeoxynucleotides+for+optimizing+treatment+of+transitional+cell+carcinoma.">Cellular uptake and ex vivo urothelial penetration by oligodeoxynucleotides for optimizing treatment of transitional cell carcinoma.</a> Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 30 (5), 265-273 (2008).</li><li>Tyagi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravesical+antisense+therapy+for+cystitis+using+TAT-peptide+nucleic+acid+conjugates.">Intravesical antisense therapy for cystitis using TAT-peptide nucleic acid conjugates.</a> Molecular Pharmaceutics. 3 (4), 398-406 (2006).</li><li>Sadoff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interim+results+of+a+phase+1-2a+trial+of+Ad26.COV2.S+Covid-19+vaccine.">Interim results of a phase 1-2a trial of Ad26.COV2.S Covid-19 vaccine.</a> New England Journal of Medicine. 384 (19), 1824-1835 (2021).</li><li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+delivery:+Potential+applications+for+gene+and+cell-Based+therapies+in+the+new+era+of+personalized+medicine.">Adenovirus-mediated gene delivery: Potential applications for gene and cell-Based therapies in the new era of personalized medicine.</a> Genes &amp; Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).</li><li>Ramesh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+pretreatment+agents+to+enhance+adenovirus+infection+of+bladder+epithelium.">Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium.</a> Molecular Therapy. 10 (4), 697-705 (2004).</li><li>Khandelwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab11a-dependent+exocytosis+of+discoidal/fusiform+vesicles+in+bladder+umbrella+cells.">Rab11a-dependent exocytosis of discoidal/fusiform vesicles in bladder umbrella cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15773-15778 (2008).</li><li>Khandelwal, P., Ruiz, W. G., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+endocytosis+in+bladder+umbrella+cells+occurs+through+an+integrin-regulated+and+RhoA-+and+dynamin-dependent+pathway.">Compensatory endocytosis in bladder umbrella cells occurs through an integrin-regulated and RhoA- and dynamin-dependent pathway.</a> The European Molecular Biology Organization journal. 29 (12), 1961-1975 (2010).</li><li>Khandelwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rab11a-Rab8a-Myo5B+network+promotes+stretch-regulated+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells.">A Rab11a-Rab8a-Myo5B network promotes stretch-regulated exocytosis in bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 24 (7), 1007-1019 (2013).</li><li>Prakasam, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A1+adenosine+receptor-stimulated+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells+requires+phosphorylation+of+ADAM17+Ser811+and+EGF+receptor+transactivation.">A1 adenosine receptor-stimulated exocytosis in bladder umbrella cells requires phosphorylation of ADAM17 Ser811 and EGF receptor transactivation.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3798-3812 (2014).</li><li>Gallo, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAB27B+requirement+for+stretch-induced+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells.">RAB27B requirement for stretch-induced exocytosis in bladder umbrella cells.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 314 (3), 349-365 (2018).</li><li>Amasheh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-2+expression+induces+cation-selective+channels+in+tight+junctions+of+epithelial+cells.">Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 115, 4969-4976 (2002).</li><li>Yu, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+cation+selectivity+in+claudin-2-based+paracellular+pores:+identification+of+an+electrostatic+interaction+site.">Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: identification of an electrostatic interaction site.</a> The Journal of General Physiology. 133 (1), 111-127 (2009).</li><li>Kasahara, H., Aoki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+using+adenoviral+RNAi+vector+in+vascular+smooth+muscle+cells+and+cardiomyocytes.">Gene silencing using adenoviral RNAi vector in vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes.</a> Methods in Molecular Medicine. 112, 155-172 (2005).</li><li>Bolognesi, B., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaching+the+limit.">Reaching the limit.</a> eLife. 7, 39804 (2018).</li><li>Atasheva, S., Shayakhmetov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+responses+to+adenovirus+and+adenovirus+vectors.">Cytokine responses to adenovirus and adenovirus vectors.</a> Viruses. 14 (5), 888 (2022).</li><li>Sanchez Freire, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+may+mediate+the+down-regulation+of+neurokinin-1+receptor+in+chronic+bladder+pain+syndrome.">MicroRNAs may mediate the down-regulation of neurokinin-1 receptor in chronic bladder pain syndrome.</a> American Journal of Pathology. 176 (1), 288-303 (2010).</li></ol>

Enquanto Ramesh e col. estavam focados no desenvolvimento de estratégias para o uso da transdução adenoviral no tratamento do câncer de bexiga18, relatos mais recentes demonstraram a utilidade dessas técnicas no estudo da biologia/fisiologia e fisiopatologia urotelial normal 10,18,19,20,21 . As características importantes dessa ab...

O urotélio é o epitélio especializado que reveste a pelve renal, ureteres, bexiga e uretra proximal1. É composto por três estratos: uma camada de células guarda-chuva altamente diferenciadas e polarizadas, muitas vezes binucleadas, cujas superfícies apicais são banhadas por urina; uma camada celular intermediária com uma população de células binucleadas de amplificação de trânsito que pode dar origem a células guarda-chuva superficiais em resposta à sua perda aguda; e uma única camada de células basais, cujo subconjunto funciona como células-tronco que podem regenerar a totalidade do urotélio em resposta à lesão crônica. As células-guarda-chuva são as principais responsáveis pela formação da barreira urotelial de alta resistência, cujos componentes incluem uma membrana apical (rica em colesterol e cerebrosídeos) com baixa permeabilidade à água e solutos, e um complexo juncional apical de alta resistência (composto por tight junctions, junções aderentes, desmossomos e um anel de actomiosina associado)1 . Tanto a superfície apical da célula guarda-chuva quanto seu anel juncional expandem-se durante o enchimento vesical e retornam ao seu estado pré-preenchido rapidamente após a micção 1,2,3,4,5. Além de seu papel na função de barreira, o urotélio também tem funções sensoriais e transdutores que lhe permitem detectar mudanças no meio extracelular (por exemplo, estiramento) e transmitir essa informação por meio da liberação de mediadores (incluindo ATP, adenosina e acetilcolina) para os tecidos subjacentes, incluindo processos nervosos aferentes suburoteliais 6,7,8 . Evidências recentes desse papel são encontradas em camundongos sem expressão urotelial de Piezo1 e Piezo2, o que resulta em alteração da função miccional9. Além disso, ratos superexpressando a proteína formadora de poros de tight-junction CLDN2 na camada de células guarda-chuva desenvolvem inflamação e dor análogas àquelas observadas em pacientes com cistite intersticial10. Hipotetiza-se que a interrupção da função sensorial/transdutor ou barreira urotelial possa contribuir para vários distúrbios vesicais 6,11.
Uma melhor compreensão da biologia do urotélio em estados normais e patológicos depende da disponibilidade de ferramentas que permitam aos investigadores prontamente desregular a expressão gênica endógena ou permitir a expressão de transgenes no tecido nativo. Enquanto uma abordagem para downregulate da expressão gênica é gerar camundongos knockout uroteliais condicionais, essa abordagem depende da disponibilidade de camundongos com alelos floxed, é trabalhosa e pode levar meses a anos para completar12. Não surpreendentemente, então, os pesquisadores desenvolveram técnicas para transfectar ou transduzir o urotélio, o que pode levar a resultados em uma escala de tempo mais curta. Os métodos publicados para transfecção incluem o uso de lipídios catiônicos13, oligodesoxinucleotídeos fosforotiotados anti-senso 14 ou ácidos nucleicos antisenso ligados à proteína TAT do HIV penetrando no peptídeo 11-mer15. No entanto, o foco deste protocolo é no uso da transdução mediada por adenovírus, uma metodologia bem estudada que é eficiente na entrega do gene a uma ampla gama de pilhas, foi testada em numerosos ensaios clínicos, e mais recentemente foi usada para entregar o cDNA que codifica a proteína do capsídeo COVID-19 aos receptores de uma variante da vacina COVID-1916, 17º. Para uma descrição mais completa do ciclo de vida dos adenovírus, vetores adenovirais e aplicações clínicas dos adenovírus, o leitor é direcionado para a referência17.
Um marco importante no uso de adenovírus para transduzir o urotélio foi o relato de Ramesh e col. que mostrou pré-tratamentos curtos com detergentes, incluindo N-dodecil-β-D-maltosídeo (DDM) que aumentaram drasticamente a transdução do urotélio por um adenovírus que codifica a β-galactosidase18. Usando este estudo de prova de princípio como guia, a transdução mediada por adenovírus do urotélio tem sido agora usada para expressar uma variedade de proteínas, incluindo GTPases da família Rab, fatores de troca de guanina-nucleotídeos, fragmentos motores de miosina, claudinas associadas à junção apertada formadora de poros e ADAM17 10,19,20,21,22 . A mesma abordagem foi adaptada para expressar pequenos RNAs interferentes (siRNA), cujos efeitos foram resgatados pela co-expressão de variantes resistentes a siRNA do transgene22. O protocolo aqui descrito inclui métodos gerais para gerar grandes quantidades de adenovírus altamente concentrados, uma exigência para essas técnicas, bem como adaptações dos métodos de Ramesh et al.18 para expressar transgenes no urotélio com alta eficiência.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL pipette</td>
			<td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td>
			<td>CLS4488</td>
			<td>sterile, serological pipette, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mL ultracentrifuge tube</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>06-752</td>
			<td>PET thinwall ultracentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352097</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G needle</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>305196</td>
			<td>18 G x 1.5 in needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL pipette</td>
			<td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td>
			<td>CLS4489</td>
			<td>sterile, serological pipette, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352098</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipette</td>
			<td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td>
			<td>CLS4487</td>
			<td>sterile, serological pipette, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cavicide</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>6400012</td>
			<td>Anti-viral solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish - 15 cm</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>353025</td>
			<td>sterile, tissue-culture treated&#160; (150 mm x 25 mm dish)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>893.1832</td>
			<td>handle length 24 cm, blade length 1.7 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C-4306</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM culture medium (high glucose)</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11965092</td>
			<td>with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>EDS</td>
			<td>Bioiultra grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Hyclone (Cytiva)</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td>defined serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td>5.75 in glass pipette, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G-5516</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV catheter - mouse</td>
			<td>Smith Medical Jelco</td>
			<td>3063</td>
			<td>24 G x 3/4 in Safety IV catheter&#160; radiopaque</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV catheter - rat</td>
			<td>Smith Medical Jelco</td>
			<td>3060</td>
			<td>22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P-9541</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>Cell culture grade&#160; &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#8226;7 H2O</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>431478</td>
			<td>&#160;&#8805; 99.99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-dodecyl-&#946;-D-maltoside&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4641</td>
			<td>&#160;&#8805; 98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nose cone for multiple animals</td>
			<td>custom designed</td>
			<td></td>
			<td>commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-10 column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-085-01</td>
			<td>Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin antibiotic (100x)</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>15070063</td>
			<td>100x concentrated solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>BioPhotometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stand and clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-679Q and 05-769-8FQ</td>
			<td>available from numerous suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter unit</td>
			<td>Fisher Scientific (Nalgene)</td>
			<td>09-740-65B</td>
			<td>0.2 &#181;m rapid-flow filter unit (150 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter unit 0.2 &#181;m (syringe)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td>Millipore Sigma Milex 0.22 &#181;m filter unit that attaches to syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super speed centrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5810R</td>
			<td>with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1 mL)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>309628</td>
			<td>1-mL syringe Luer-lok tip - sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (3 mL)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>309656</td>
			<td>3-mL syringe slip tip - sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table-top centrifuge (low speed)</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5702</td>
			<td>with swinging bucket rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td>polyethylene 3.4 mL transfer pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>648310-M</td>
			<td>Molecular Biology grade&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE select protease solution</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>12604013</td>
			<td>TrypLE express enzyme (1x), no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-80 XP</td>
			<td>with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporizer&#160;</td>
			<td>General Anesthetic Services, Inc.</td>
			<td>Tec 3</td>
			<td>Isoflurane vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td>analog vortex mixer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of transgenes in native bladder urothelium using adenovirus-mediated transduction

Além de formar uma barreira de alta resistência, o urotélio que reveste a pelve renal, ureteres, bexiga e uretra proximal é hipotetizado para detectar e transmitir informações sobre seu ambiente aos tecidos subjacentes, promovendo a função e o comportamento miccional. A ruptura da barreira urotelial, ou sua função sensorial/transdutor, pode levar à doença. O estudo desses eventos complexos é dificultado pela falta de estratégias simples para alterar a expressão gênica e proteica no urotélio. São descritos métodos que permitem aos investigadores gerar grandes quantidades de adenovírus de alto título, que podem então ser usados para transduzir urotélio de roedores com alta eficiência e de maneira relativamente simples. Tanto cDNAs quanto pequenos RNAs interferentes podem ser expressos usando transdução adenoviral, e o impacto da expressão de transgênicos na função urotelial pode ser avaliado 12 h a vários dias depois. Estes métodos têm ampla aplicabilidade em estudos de biologia urotelial normal e anormal utilizando modelos animais de camundongos ou ratos.

Preparação do vírus Um exemplo de purificação do vírus por centrifugação por gradiente de densidade é mostrado na Figura 1A. A faixa rosa claro, encontrada na interface do material celular carregado com a camada de CsCl de 1,25 g/mL, é composta principalmente por células rompidas e seus detritos (ver seta magenta na Figura 1A). Deriva sua cor rosada da pequena quantidade de meio de cultura que é transportada da etapa 1.5 do protoc...

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Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction

São descritos métodos para a geração de grandes quantidades de adenovírus recombinantes, que podem então ser usados para transduzir o urotélio nativo de roedores, permitindo a expressão de transgenes ou downregulation de produtos gênicos endógenos.

Expressão de Transgenes no Urotélio da Bexiga Nativa utilizando Transdução Mediada por Adenovírus

In addition to forming a high-resistance barrier, the urothelium lining the renal pelvis, ureters, bladder, and proximal urethra is hypothesized to sense ...

Este protocolo descreve métodos que permitem aos investigadores expressar CDNAs ou SIRNAs no urotélio vesical nativo. As principais vantagens desta técnica são sua relativa simplicidade, a capacidade de expressar cDNAs, siRNAs no urotélio com alta eficiência, e dentro de um período relativamente curto de tempo. A parte mais difícil dessa técnica é o cateterismo.No entanto, a técnica geral é relativamente fácil de dominar uma vez aprendida. Quem demonstrará o procedimento será Giovanni Ruiz, Especialista em Pesquisa IV em meu laboratório. Para começar, coloque o mouse anestesiado em uma almofada de aquecimento ao lado dos cones nasais.Manter o animal sob anestesia durante todo o protocolo. Confirme se o rato está completamente anestesiado com uma pinça do dedo do pé. Para evitar a introdução de ar na bexiga, preencha a porção plástica do cateter de um cateter intravenoso e o cubo associado com PBS estéril usando uma pipeta ou seringa de transferência estéril.Com o animal em decúbito dorsal swab do meato uretral externo com álcool a 70%. Em seguida, pegue suavemente o tecido que forma o meato uretral externo e estenda-o verticalmente para longe do animal usando pinças finas. Inserir o cateter estéril no meato externo.Com a outra mão, insira cuidadosamente o cateter verticalmente cerca de três a quatro milímetros no meato uretral. Em seguida, abaixe o cateter inserido no meato externo em direção à cauda do animal, o que facilita sua entrada na porção da uretra que passa abaixo do osso púbico e, por fim, na bexiga. Deixe a urina na bexiga vazar.Remova qualquer urina residual realizando a manobra de Crede massageando e pressionando suavemente a bexiga na área abdominal inferior. Para tornar o urotélio receptivo à transdução, lave a bexiga de camundongo ou rato anexando uma seringa estéril de um mililitro preenchida com PBS ao cubo do cateter. Injete 100 microlitros de PBS estéril na bexiga do rato.Depois de retirar a seringa do encaixe do cateter, deixe o PBS drenar. Instilar 100 microlitros de N-dodecil-beta-D-maltosídeo 0,1% dissolvido em PBS e filtro de 0,2 micrômetro esterilizado na bexiga de camundongo usando uma seringa estéril de um mililitro. Retenha o N-dodecil-beta-D-maltosídeo na bexiga durante 10 minutos, deixando a seringa no lugar.Retire o N-dodecil-beta-D-maltosídeo da bexiga desprendendo a seringa e deixando-a escorrer. Para introduzir o vírus na bexiga, conecte uma seringa estéril de um mililitro ao cubo do cateter e instile 5.000.000 a 100.000.000 IVP de adenovírus diluídos em 100 microlitros de PBS estéril para camundongos, ou 450 microlitros para ratos na bexiga. Após 30 minutos, retire a seringa e deixe a solução do vírus evacuar a bexiga para uma almofada descartável.Limpe qualquer solução de vírus residual com um lenço absorvente enquanto descarta a almofada e limpe os resíduos bioperigosos. Para permitir que o animal se recupere, cesse o fluxo de isoflurano. Permita que o animal se recupere e fique totalmente móvel antes de devolvê-lo à sua gaiola, especialmente se os animais estiverem alojados em grupo.Analisar os efeitos da expressão de transgenes 12 a 72 horas após o tratamento usando métodos como hibridização in situ de mRNA, Western blot ou imunofluorescência. A análise por Western blot de lisados uroteliais revelou expressão do hormônio do crescimento humano marcado com V5 no urotélio de bexigas transduzidas, mas não em bexigas não transduzidas. A expressão também foi confirmada por imunofluorescência usando anticorpos que reconheceram o hormônio do crescimento humano, ou a etiqueta do epítopo V5.A análise de Western blot confirmou a expressão de Claudin-2 em ratos transduzidos com adenovírus, mas não naqueles transduzidos com um vírus codificador de GFP controlado. A análise de imunofluorescência confirmou ainda a expressão exógena de Claudin-2 em células uroteliais do guarda-chuva transduzidas com cDNA Claudin-2 codificador de vírus. A detecção de Claudin-2 exógeno na Tight Junction Protein 1 por imunofluorescência e microscopia confocal de urotélio montado ou seccionado transversalmente revelou a presença de Tight Junction e acúmulos intracelulares de Claudin-2 no citoplasma celular.O campo da imagem mostra que a contagem do número de células transduzidas revela uma eficiência que se aproxima de 95% e em toda a parede da bexiga apenas o urotélio é transduzido, e nenhum outro tecido é alvo do adenovírus instilado. O cateterismo é fundamental para que o protocolo funcione como pretendido. Esta técnica permite aos investigadores estudar a biologia urotelial normal, bem como compreender as condições em que a superexpressão de proteínas, ou subexpressão, leva à doença.

Research

JoVE Journal

Biology

Targeted Expression of GFP in the Hair Follicle Using Ex Vivo Viral Transduction

Expressão alvo de GFP no folículo piloso Usando Transdução Vivo Ex Viral

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft ...

Biologia

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para Eletroporação

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Detection of Protein Ubiquitination

Detecção de Ubiquitinação Protein

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Usando o Sistema de Eletroporação Gene Pulser MXcell para transfectar pilhas com Alta Eficiência

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Usando um contador de células automatizadas para simplificar Estudos da Expressão Gênica: Knockdown siRNA de Expressão IL-4 Gene Dependente em células NAMALWA

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

Adenovírus mediada por remoção genética das moléculas de sinalização em fibroblastos de rato cultivadas Primária embrionárias

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

Produção de C. elegans Transgenes via Recombineering com o GalK Marcador selecionável

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Na reconstituição in vitro da atividade T. Telomerase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Preparação de Amostras de proteômica fixados em formalina e embebidos em parafina Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...