Name: expression of transgenes in native bladder urothelium using adenovirus-mediated transduction
Uploaded: 2022-10-06T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por una adjudicación de proyecto piloto a través de P30DK079307 (a M.G.D.), subvención de los NIH R01DK119183 (a G.A. y M.D.C.), subvención de los NIH R01DK129473 (a G.A.), un premio de Desarrollo Profesional de la Asociación Americana de Urología y una subvención de la Fundación Winters (a N.M.), por los Núcleos de Imágenes Renales de Fisiología Celular y Organismos Modelo del Centro de Investigación Renal de Pittsburgh (P30DK079307), y por S10OD028596 (a G.A.), que financió la compra del sistema confocal utilizado para capturar algunas de las imágenes presentadas en este manuscrito.

Los experimentos que involucran la generación de adenovirus, que requiere certificación BSL2, se realizaron bajo la aprobación de las oficinas de Salud y Seguridad Ambiental de la Universidad de Pittsburgh y el Comité Institucional de Bioseguridad. Todos los experimentos con animales realizados, incluida la transducción adenoviral (que requiere la certificación ABSL2), se realizaron de acuerdo con las pautas / regulaciones relevantes de la Política del Servicio de Salud Pública sobre Cuidado Humanitario y Uso de ...

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	<li>Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Urothelium:+Life+in+a+liquid+environment.">The Urothelium: Life in a liquid environment.</a> Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).</li><li>Truschel, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-regulated+exocytosis/endocytosis+in+bladder+umbrella+cells.">Stretch-regulated exocytosis/endocytosis in bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (3), 830-846 (2002).</li><li>Lewis, S. A., de Moura, J. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+cytoplasmic+vesicles+into+apical+membrane+of+mammalian+urinary+bladder+epthelium.">Incorporation of cytoplasmic vesicles into apical membrane of mammalian urinary bladder epthelium.</a> Nature (London). 297 (5868), 685-688 (1982).</li><li>Eaton, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+contraction+of+the+umbrella+cell+apical+junctional+ring+in+response+to+bladder+filling+and+voiding.">Expansion and contraction of the umbrella cell apical junctional ring in response to bladder filling and voiding.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (16), 2037-2052 (2019).</li><li>Yu, W., Khandelwal, P., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+apical+and+basolateral+membrane+requirements+for+stretch-induced+membrane+traffic+at+the+apical+surface+of+bladder+umbrella+cells.">Distinct apical and basolateral membrane requirements for stretch-induced membrane traffic at the apical surface of bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (1), 282-295 (2009).</li><li>Birder, L., Andersson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+signaling.">Urothelial signaling.</a> Physiological Reviews. 93 (2), 653-680 (2013).</li><li>Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+bladder,+cystitis+and+nerve/urothelial+interactions.">Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions.</a> Autonomic Neuroscience. 182, 89-94 (2014).</li><li>Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+uroepithelial-associated+sensory+web.">The uroepithelial-associated sensory web.</a> Kidney International. 72 (9), 1057-1064 (2007).</li><li>Dalghi, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+for+PIEZO1+and+PIEZO2+in+urothelial+mechanotransduction+and+lower+urinary+tract+interoception.">Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (19), 152984 (2021).</li><li>Montalbetti, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+urothelial+paracellular+transport+promotes+cystitis.">Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis.</a> American Journal of Physiology: Renal Physiology. 309 (12), 1070-1081 (2015).</li><li>Keay, S. K., Birder, L. A., Chai, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+bladder+urothelial+pathophysiology+in+functional+bladder+disorders.">Evidence for bladder urothelial pathophysiology in functional bladder disorders.</a> BioMed Research International. 2014, 865463 (2014).</li><li>Friedel, R. H., Wurst, W., Wefers, B., Kuhn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+conditional+knockout+mice.">Generating conditional knockout mice.</a> Methods in Molecular Biology. 693, 205-231 (2011).</li><li>Kashyap, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+nerve+growth+factor+expression+in+the+bladder+by+antisense+oligonucleotides+as+new+treatment+for+overactive+bladder.">Down-regulation of nerve growth factor expression in the bladder by antisense oligonucleotides as new treatment for overactive bladder.</a> Journal of Urology. 190 (2), 757-764 (2013).</li><li>Bolenz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+and+ex+vivo+urothelial+penetration+by+oligodeoxynucleotides+for+optimizing+treatment+of+transitional+cell+carcinoma.">Cellular uptake and ex vivo urothelial penetration by oligodeoxynucleotides for optimizing treatment of transitional cell carcinoma.</a> Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 30 (5), 265-273 (2008).</li><li>Tyagi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravesical+antisense+therapy+for+cystitis+using+TAT-peptide+nucleic+acid+conjugates.">Intravesical antisense therapy for cystitis using TAT-peptide nucleic acid conjugates.</a> Molecular Pharmaceutics. 3 (4), 398-406 (2006).</li><li>Sadoff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interim+results+of+a+phase+1-2a+trial+of+Ad26.COV2.S+Covid-19+vaccine.">Interim results of a phase 1-2a trial of Ad26.COV2.S Covid-19 vaccine.</a> New England Journal of Medicine. 384 (19), 1824-1835 (2021).</li><li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+delivery:+Potential+applications+for+gene+and+cell-Based+therapies+in+the+new+era+of+personalized+medicine.">Adenovirus-mediated gene delivery: Potential applications for gene and cell-Based therapies in the new era of personalized medicine.</a> Genes &amp; Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).</li><li>Ramesh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+pretreatment+agents+to+enhance+adenovirus+infection+of+bladder+epithelium.">Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium.</a> Molecular Therapy. 10 (4), 697-705 (2004).</li><li>Khandelwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab11a-dependent+exocytosis+of+discoidal/fusiform+vesicles+in+bladder+umbrella+cells.">Rab11a-dependent exocytosis of discoidal/fusiform vesicles in bladder umbrella cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15773-15778 (2008).</li><li>Khandelwal, P., Ruiz, W. G., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+endocytosis+in+bladder+umbrella+cells+occurs+through+an+integrin-regulated+and+RhoA-+and+dynamin-dependent+pathway.">Compensatory endocytosis in bladder umbrella cells occurs through an integrin-regulated and RhoA- and dynamin-dependent pathway.</a> The European Molecular Biology Organization journal. 29 (12), 1961-1975 (2010).</li><li>Khandelwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rab11a-Rab8a-Myo5B+network+promotes+stretch-regulated+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells.">A Rab11a-Rab8a-Myo5B network promotes stretch-regulated exocytosis in bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 24 (7), 1007-1019 (2013).</li><li>Prakasam, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A1+adenosine+receptor-stimulated+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells+requires+phosphorylation+of+ADAM17+Ser811+and+EGF+receptor+transactivation.">A1 adenosine receptor-stimulated exocytosis in bladder umbrella cells requires phosphorylation of ADAM17 Ser811 and EGF receptor transactivation.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3798-3812 (2014).</li><li>Gallo, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAB27B+requirement+for+stretch-induced+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells.">RAB27B requirement for stretch-induced exocytosis in bladder umbrella cells.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 314 (3), 349-365 (2018).</li><li>Amasheh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-2+expression+induces+cation-selective+channels+in+tight+junctions+of+epithelial+cells.">Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 115, 4969-4976 (2002).</li><li>Yu, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+cation+selectivity+in+claudin-2-based+paracellular+pores:+identification+of+an+electrostatic+interaction+site.">Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: identification of an electrostatic interaction site.</a> The Journal of General Physiology. 133 (1), 111-127 (2009).</li><li>Kasahara, H., Aoki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+using+adenoviral+RNAi+vector+in+vascular+smooth+muscle+cells+and+cardiomyocytes.">Gene silencing using adenoviral RNAi vector in vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes.</a> Methods in Molecular Medicine. 112, 155-172 (2005).</li><li>Bolognesi, B., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaching+the+limit.">Reaching the limit.</a> eLife. 7, 39804 (2018).</li><li>Atasheva, S., Shayakhmetov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+responses+to+adenovirus+and+adenovirus+vectors.">Cytokine responses to adenovirus and adenovirus vectors.</a> Viruses. 14 (5), 888 (2022).</li><li>Sanchez Freire, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+may+mediate+the+down-regulation+of+neurokinin-1+receptor+in+chronic+bladder+pain+syndrome.">MicroRNAs may mediate the down-regulation of neurokinin-1 receptor in chronic bladder pain syndrome.</a> American Journal of Pathology. 176 (1), 288-303 (2010).</li></ol>

Mientras que Ramesh et al. se centraron en desarrollar estrategias para utilizar la transducción adenoviral en el tratamiento del cáncer de vejiga 18, informes más recientes han demostrado la utilidad de estas técnicas en el estudio de la biología/fisiología urotelial normal y la fisiopatología 10,18,19,20,21 . Las característic...

El urotelio es el epitelio especializado que recubre la pelvis renal, los uréteres, la vejiga y la uretra proximal1. Comprende tres estratos: una capa de células paraguas a menudo binucleadas altamente diferenciadas y polarizadas, cuyas superficies apicales están bañadas en orina; una capa celular intermedia con una población de células binucleadas amplificadoras del tránsito que pueden dar lugar a células paraguas superficiales en respuesta a su pérdida aguda; y una sola capa de células basales, un subconjunto de las cuales funcionan como células madre que pueden regenerar la totalidad del urotelio en respuesta a una lesión crónica. Las células paraguas son las principales responsables de formar la barrera urotelial de alta resistencia, cuyos componentes incluyen una membrana apical (rica en colesterol y cerebrósidos) con baja permeabilidad al agua y los solutos, y un complejo de unión apical de alta resistencia (compuesto por uniones estrechas, uniones adherentes, desmosomas y un anillo de actomiosina asociado)1 . Tanto la superficie apical de la célula paraguas como su anillo de unión se expanden durante el llenado de la vejiga y vuelven a su estado precargado rápidamente después de vaciar 1,2,3,4,5. Además de su papel en la función de barrera, también se presume que el urotelio tiene funciones sensoriales y transductoras que le permiten detectar cambios en el medio extracelular (por ejemplo, estiramiento) y transmitir esta información a través de la liberación de mediadores (incluyendo ATP, adenosina y acetilcolina) a los tejidos subyacentes, incluidos los procesos nerviosos aferentes suburoteliales 6,7,8 . La evidencia reciente de este papel se encuentra en ratones que carecen de expresión urotelial tanto de Piezo1 como de Piezo2, lo que resulta en una función miccional alterada9. Además, las ratas que sobreexpresan la proteína formadora de poros de unión estrecha CLDN2 en la capa de células paraguas desarrollan inflamación y dolor análogos a los observados en pacientes con cistitis intersticial10. Se plantea la hipótesis de que la interrupción de la función sensorial/transductor urotelial o de barrera puede contribuir a varios trastornos de la vejiga 6,11.
Una mejor comprensión de la biología del urotelio en estados normales y de enfermedad depende de la disponibilidad de herramientas que permitan a los investigadores regular fácilmente a la baja la expresión génica endógena o permitir la expresión de transgenes en el tejido nativo. Si bien un enfoque para regular a la baja la expresión génica es generar ratones knockout uroteliales condicionales, este enfoque depende de la disponibilidad de ratones con alelos floxados, requiere mucho trabajo y puede tardar meses o años en completar12. No es sorprendente entonces, que los investigadores hayan desarrollado técnicas para transfectar o transducir el urotelio, lo que puede conducir a resultados en una escala de tiempo más corta. Los métodos publicados para la transfección incluyen el uso de lípidos catiónicos13, oligodesoxinucleótidos fosforotioados antisentido 14 o ácidos nucleicos antisentido atados a la proteína TAT del VIH que penetra en el péptido 11-mer15. Sin embargo, el enfoque de este protocolo está en el uso de la transducción mediada por adenovirus, una metodología bien estudiada que es eficiente en la entrega de genes a una amplia gama de células, se ha probado en numerosos ensayos clínicos y, más recientemente, se utilizó para administrar el ADNc que codifica la proteína de la cápside COVID-19 a los receptores de una variante de la vacuna COVID-1916, 17. Para una descripción más completa del ciclo de vida de los adenovirus, los vectores adenovirales y las aplicaciones clínicas de los adenovirus, se dirige al lector a la referencia17.
Un hito importante en el uso de adenovirus para transducir el urotelio fue un informe de Ramesh et al. que mostró pretratamientos cortos con detergentes, incluyendo N-dodecil-β-D-maltósido (DDM) dramáticamente mejorado transducción del urotelio por un adenovirus que codifica β-galactosidasa18. Utilizando este estudio de prueba de principio como guía, la transducción mediada por adenovirus del urotelio ahora se ha utilizado para expresar una variedad de proteínas, incluidas las GTPasas de la familia Rab, los factores de intercambio guanina-nucleótido, los fragmentos motores de miosina, las claudinas asociadas a la unión estrecha formadoras de poros y ADAM17 10,19,20,21,22 . El mismo enfoque se adaptó para expresar pequeños ARN interferentes (ARNsi), cuyos efectos fueron rescatados mediante la coexpresión de variantes resistentes al ARNip del transgen22. El protocolo aquí descrito incluye métodos generales para generar grandes cantidades de adenovirus altamente concentrados, requisito para estas técnicas, así como adaptaciones de los métodos de Ramesh et al.18 para expresar transgenes en el urotelio con alta eficiencia.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL pipette</td>
			<td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td>
			<td>CLS4488</td>
			<td>sterile, serological pipette, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mL ultracentrifuge tube</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>06-752</td>
			<td>PET thinwall ultracentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352097</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G needle</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>305196</td>
			<td>18 G x 1.5 in needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL pipette</td>
			<td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td>
			<td>CLS4489</td>
			<td>sterile, serological pipette, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352098</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipette</td>
			<td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td>
			<td>CLS4487</td>
			<td>sterile, serological pipette, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cavicide</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>6400012</td>
			<td>Anti-viral solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish - 15 cm</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>353025</td>
			<td>sterile, tissue-culture treated&#160; (150 mm x 25 mm dish)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>893.1832</td>
			<td>handle length 24 cm, blade length 1.7 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C-4306</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM culture medium (high glucose)</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11965092</td>
			<td>with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>EDS</td>
			<td>Bioiultra grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Hyclone (Cytiva)</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td>defined serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td>5.75 in glass pipette, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G-5516</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV catheter - mouse</td>
			<td>Smith Medical Jelco</td>
			<td>3063</td>
			<td>24 G x 3/4 in Safety IV catheter&#160; radiopaque</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV catheter - rat</td>
			<td>Smith Medical Jelco</td>
			<td>3060</td>
			<td>22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P-9541</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>Cell culture grade&#160; &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#8226;7 H2O</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>431478</td>
			<td>&#160;&#8805; 99.99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-dodecyl-&#946;-D-maltoside&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4641</td>
			<td>&#160;&#8805; 98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nose cone for multiple animals</td>
			<td>custom designed</td>
			<td></td>
			<td>commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-10 column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-085-01</td>
			<td>Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin antibiotic (100x)</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>15070063</td>
			<td>100x concentrated solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>BioPhotometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stand and clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-679Q and 05-769-8FQ</td>
			<td>available from numerous suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter unit</td>
			<td>Fisher Scientific (Nalgene)</td>
			<td>09-740-65B</td>
			<td>0.2 &#181;m rapid-flow filter unit (150 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter unit 0.2 &#181;m (syringe)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td>Millipore Sigma Milex 0.22 &#181;m filter unit that attaches to syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super speed centrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5810R</td>
			<td>with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1 mL)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>309628</td>
			<td>1-mL syringe Luer-lok tip - sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (3 mL)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>309656</td>
			<td>3-mL syringe slip tip - sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table-top centrifuge (low speed)</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5702</td>
			<td>with swinging bucket rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td>polyethylene 3.4 mL transfer pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>648310-M</td>
			<td>Molecular Biology grade&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE select protease solution</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>12604013</td>
			<td>TrypLE express enzyme (1x), no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-80 XP</td>
			<td>with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporizer&#160;</td>
			<td>General Anesthetic Services, Inc.</td>
			<td>Tec 3</td>
			<td>Isoflurane vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td>analog vortex mixer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of transgenes in native bladder urothelium using adenovirus-mediated transduction

Además de formar una barrera de alta resistencia, se plantea la hipótesis de que el urotelio que recubre la pelvis renal, los uréteres, la vejiga y la uretra proximal detecta y transmite información sobre su entorno a los tejidos subyacentes, promoviendo la función miccional y el comportamiento. La interrupción de la barrera urotelial, o su función sensorial/transductora, puede conducir a la enfermedad. El estudio de estos eventos complejos se ve obstaculizado por la falta de estrategias simples para alterar la expresión génica y proteica en el urotelio. Aquí se describen métodos que permiten a los investigadores generar grandes cantidades de adenovirus de alto título, que luego se pueden usar para transducir urotelio de roedores con alta eficiencia y de una manera relativamente sencilla. Tanto los ADNc como los ARN interferentes pequeños pueden expresarse mediante transducción adenoviral, y el impacto de la expresión transgénica en la función urotelial se puede evaluar de 12 h a varios días después. Estos métodos tienen una amplia aplicabilidad a estudios de biología urotelial normal y anormal utilizando modelos animales de ratón o rata.

Preparación del virus Un ejemplo de purificación de virus por centrifugación por gradiente de densidad se muestra en la Figura 1A. La banda de color rosa claro, que se encuentra en la interfaz del material celular cargado y la capa de CsCl de 1,25 g/ml, está compuesta principalmente de células interrumpidas y sus restos (ver flecha magenta en la Figura 1A). Deriva su color rosado de la pequeña cantidad de medio de cultivo que se transfi...

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Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction

Se describen métodos para la generación de grandes cantidades de adenovirus recombinantes, que luego se pueden utilizar para transducir el urotelio nativo de roedores permitiendo la expresión de transgenes o la regulación a la baja de productos génicos endógenos.

Expresión de transgenes en urotelio de vejiga nativa mediante transducción mediada por adenovirus

In addition to forming a high-resistance barrier, the urothelium lining the renal pelvis, ureters, bladder, and proximal urethra is hypothesized to sense ...

Este protocolo describe métodos que permiten a los investigadores expresar CDNA o SIRNA en el urotelio de la vejiga nativa. Las principales ventajas de esta técnica son su relativa simplicidad, la capacidad de expresar ADNc, ARNip en el urotelio con alta eficiencia y en un período de tiempo relativamente corto. La parte más difícil de esta técnica es el cateterismo.Sin embargo, la técnica general es relativamente fácil de dominar una vez aprendida. Demostrando el procedimiento estará Giovanni Ruiz, un especialista en investigación IV en mi laboratorio. Para comenzar, coloque el mouse anestesiado en una almohadilla térmica junto a los conos nasales.Mantener al animal bajo anestesia durante la duración del protocolo. Confirme que el ratón está completamente anestesiado con un pellizco en el dedo del pie. Para evitar la introducción de aire en la vejiga, llene la porción plástica del catéter de un catéter intravenoso y el cubo asociado con PBS estéril usando una pipeta o jeringa de transferencia estéril.Con el animal en posición supina frotamos el meato uretral externo con 70% de alcohol. Luego agarre suavemente el tejido que forma el meato uretral externo y extiéndalo verticalmente lejos del animal usando fórceps finos. Inserte el catéter estéril en el meato externo.Con la otra mano, inserte cuidadosamente el catéter verticalmente de tres a cuatro milímetros en el meato uretral. Luego baje el catéter insertado en el meato externo hacia la cola del animal, lo que facilita su entrada en la porción de la uretra que pasa por debajo del hueso púbico y finalmente a la vejiga. Permita que la orina en la vejiga se escape.Elimine cualquier orina residual realizando la maniobra de Crede masajeando y presionando suavemente hacia abajo sobre la protuberancia de la vejiga en el área abdominal inferior. Para hacer que el urotelio sea receptivo a la transducción, lave la vejiga del ratón o rata conectando una jeringa estéril de un mililitro llena de PBS al cubo del catéter. Inyecte 100 microlitros de PBS estéril en la vejiga del ratón.Después de separar la jeringa del accesorio del catéter, permita que el PBS drene. Instilar 100 microlitros de 0,1% N-dodecil-beta-D-maltósido disuelto en PBS y filtro de 0,2 micrómetros esterilizado en la vejiga del ratón utilizando una jeringa estéril de un mililitro. Retenga el N-dodecil-beta-D-maltósido en la vejiga durante 10 minutos dejando la jeringa en su lugar.Retire el N-dodecil-beta-D-maltósido de la vejiga desprendiendo la jeringa y dejando que drene. Para introducir el virus en la vejiga, conecte una jeringa estéril de un mililitro al cubo del catéter e instilar 5, 000, 000 a 100, 000, 000 IVP de adenovirus diluido en 100 microlitros de PBS estéril para ratones, o 450 microlitros para ratas en la vejiga. Después de 30 minutos, separe la jeringa y permita que la solución de virus evacue la vejiga a una almohadilla desechable.Seque cualquier solución de virus residual con una toallita absorbente mientras desecha la almohadilla y limpie los desechos biopeligrosos. Para permitir que el animal se recupere, detenga el flujo de isoflurano. Permita que el animal se recupere y esté completamente móvil antes de devolverlo a su jaula, especialmente si los animales están alojados en grupos.Analizar los efectos de la expresión transgénica de 12 a 72 horas después del tratamiento utilizando métodos como la hibridación in situ de ARNm, Western blot o inmunofluorescencia. El análisis Western blot de lisados uroteliales reveló expresión de hormona de crecimiento humana marcada con V5 en el urotelio de vejigas transducidas, pero no en las no transducidas. La expresión también fue confirmada por inmunofluorescencia utilizando anticuerpos que reconocieron la hormona del crecimiento humano, o la etiqueta de epítopo V5.El análisis de Western blot confirmó la expresión de Claudin-2 en ratas transducidas con adenovirus, pero no en aquellas transducidas con un virus controlado que codifica GFP. El análisis de inmunofluorescencia confirmó además la expresión exógena de claudina-2 en células paraguas uroteliales transducidas con ADNc de claudina-2 que codifica el virus. La detección de claudina-2 exógena en la proteína de unión estrecha 1 por inmunofluorescencia y microscopía confocal de urotelio montado entero o seccionado transversalmente reveló la presencia de acumulación de unión estrecha e intracelular de claudina-2 en el citoplasma celular.El campo de imagen muestra que contar el número de células paraguas transducidas revela una eficiencia que se acerca al 95% y en la totalidad de la pared de la vejiga solo se transduce el urotelio, y ningún otro tejido es atacado por el adenovirus instilado. El cateterismo es crítico para que el protocolo funcione según lo previsto. Esta técnica permite a los investigadores estudiar la biología urotelial normal, así como comprender las condiciones en las que la sobreexpresión de proteínas, o la subexpresión, conduce a la enfermedad.

Research

JoVE Journal

Biology

Targeted Expression of GFP in the Hair Follicle Using Ex Vivo Viral Transduction

Expresión específica de las buenas prácticas agrarias en el folículo del pelo usando Ex Vivo transducción viral

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft ...

Investigación

Biología

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

La preparación de cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina por electroporación

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Detection of Protein Ubiquitination

La detección de ubiquitinación de proteínas

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Tinción de las proteínas en geles con Coomassie G-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Utilizando el sistema de electroporación Gene Emisores MXcell para transfectar células primarias con alta eficiencia

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

El uso de un contador de células automatizado para simplificar estudios de expresión génica: siRNA Derribo de IL-4 la expresión génica en células dependientes Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

Mediada por adenovirus eliminación de moléculas de señalización genética en cultivos de fibroblastos de embriones de ratón primaria

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

En la reconstitución in vitro de los activos T. castaneum telomerasa

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Codificados genéticamente-sondas moleculares para Estudiar G receptores acoplados a proteínas

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Proteómica Preparación de muestras de formol fija y embebidos en parafina de tejidos

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...