Name: expression of transgenes in native bladder urothelium using adenovirus-mediated transduction
Uploaded: 2022-10-06T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction at JoVE.com

Detta arbete stöddes av ett pilotprojekt genom P30DK079307 (till M.G.D.), NIH-bidrag R01DK119183 (till G.A. och M.D.C.), NIH-bidrag R01DK129473 (till GA), ett American Urology Association Career Development-pris och ett Winters Foundation-bidrag (till N.M.), av Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores vid Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307), och av S10OD028596 (till G.A.), som finansierade inköpet av konfokalsystemet som användes för att fånga några av de bilder som presenteras i detta manuskript.

Experiment med generering av adenovirus, som kräver BSL2-certifiering, utfördes under godkännande från University of Pittsburgh Environmental Health and Safety kontor och Institutional Biosafety Committee. Alla djurförsök som utförts, inklusive adenoviral transduktion (som kräver ABSL2-certifiering), gjordes i enlighet med relevanta riktlinjer / föreskrifter i Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals och Animal Welfare Act, och under godkännande av University of Pittsburgh Insti...

<ol>
	<li>Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Urothelium:+Life+in+a+liquid+environment.">The Urothelium: Life in a liquid environment.</a> Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).</li><li>Truschel, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-regulated+exocytosis/endocytosis+in+bladder+umbrella+cells.">Stretch-regulated exocytosis/endocytosis in bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (3), 830-846 (2002).</li><li>Lewis, S. A., de Moura, J. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+cytoplasmic+vesicles+into+apical+membrane+of+mammalian+urinary+bladder+epthelium.">Incorporation of cytoplasmic vesicles into apical membrane of mammalian urinary bladder epthelium.</a> Nature (London). 297 (5868), 685-688 (1982).</li><li>Eaton, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+contraction+of+the+umbrella+cell+apical+junctional+ring+in+response+to+bladder+filling+and+voiding.">Expansion and contraction of the umbrella cell apical junctional ring in response to bladder filling and voiding.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (16), 2037-2052 (2019).</li><li>Yu, W., Khandelwal, P., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+apical+and+basolateral+membrane+requirements+for+stretch-induced+membrane+traffic+at+the+apical+surface+of+bladder+umbrella+cells.">Distinct apical and basolateral membrane requirements for stretch-induced membrane traffic at the apical surface of bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (1), 282-295 (2009).</li><li>Birder, L., Andersson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+signaling.">Urothelial signaling.</a> Physiological Reviews. 93 (2), 653-680 (2013).</li><li>Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+bladder,+cystitis+and+nerve/urothelial+interactions.">Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions.</a> Autonomic Neuroscience. 182, 89-94 (2014).</li><li>Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+uroepithelial-associated+sensory+web.">The uroepithelial-associated sensory web.</a> Kidney International. 72 (9), 1057-1064 (2007).</li><li>Dalghi, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+for+PIEZO1+and+PIEZO2+in+urothelial+mechanotransduction+and+lower+urinary+tract+interoception.">Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (19), 152984 (2021).</li><li>Montalbetti, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+urothelial+paracellular+transport+promotes+cystitis.">Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis.</a> American Journal of Physiology: Renal Physiology. 309 (12), 1070-1081 (2015).</li><li>Keay, S. K., Birder, L. A., Chai, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+bladder+urothelial+pathophysiology+in+functional+bladder+disorders.">Evidence for bladder urothelial pathophysiology in functional bladder disorders.</a> BioMed Research International. 2014, 865463 (2014).</li><li>Friedel, R. H., Wurst, W., Wefers, B., Kuhn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+conditional+knockout+mice.">Generating conditional knockout mice.</a> Methods in Molecular Biology. 693, 205-231 (2011).</li><li>Kashyap, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+nerve+growth+factor+expression+in+the+bladder+by+antisense+oligonucleotides+as+new+treatment+for+overactive+bladder.">Down-regulation of nerve growth factor expression in the bladder by antisense oligonucleotides as new treatment for overactive bladder.</a> Journal of Urology. 190 (2), 757-764 (2013).</li><li>Bolenz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+and+ex+vivo+urothelial+penetration+by+oligodeoxynucleotides+for+optimizing+treatment+of+transitional+cell+carcinoma.">Cellular uptake and ex vivo urothelial penetration by oligodeoxynucleotides for optimizing treatment of transitional cell carcinoma.</a> Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 30 (5), 265-273 (2008).</li><li>Tyagi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravesical+antisense+therapy+for+cystitis+using+TAT-peptide+nucleic+acid+conjugates.">Intravesical antisense therapy for cystitis using TAT-peptide nucleic acid conjugates.</a> Molecular Pharmaceutics. 3 (4), 398-406 (2006).</li><li>Sadoff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interim+results+of+a+phase+1-2a+trial+of+Ad26.COV2.S+Covid-19+vaccine.">Interim results of a phase 1-2a trial of Ad26.COV2.S Covid-19 vaccine.</a> New England Journal of Medicine. 384 (19), 1824-1835 (2021).</li><li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+delivery:+Potential+applications+for+gene+and+cell-Based+therapies+in+the+new+era+of+personalized+medicine.">Adenovirus-mediated gene delivery: Potential applications for gene and cell-Based therapies in the new era of personalized medicine.</a> Genes &amp; Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).</li><li>Ramesh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+pretreatment+agents+to+enhance+adenovirus+infection+of+bladder+epithelium.">Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium.</a> Molecular Therapy. 10 (4), 697-705 (2004).</li><li>Khandelwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab11a-dependent+exocytosis+of+discoidal/fusiform+vesicles+in+bladder+umbrella+cells.">Rab11a-dependent exocytosis of discoidal/fusiform vesicles in bladder umbrella cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15773-15778 (2008).</li><li>Khandelwal, P., Ruiz, W. G., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+endocytosis+in+bladder+umbrella+cells+occurs+through+an+integrin-regulated+and+RhoA-+and+dynamin-dependent+pathway.">Compensatory endocytosis in bladder umbrella cells occurs through an integrin-regulated and RhoA- and dynamin-dependent pathway.</a> The European Molecular Biology Organization journal. 29 (12), 1961-1975 (2010).</li><li>Khandelwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rab11a-Rab8a-Myo5B+network+promotes+stretch-regulated+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells.">A Rab11a-Rab8a-Myo5B network promotes stretch-regulated exocytosis in bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 24 (7), 1007-1019 (2013).</li><li>Prakasam, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A1+adenosine+receptor-stimulated+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells+requires+phosphorylation+of+ADAM17+Ser811+and+EGF+receptor+transactivation.">A1 adenosine receptor-stimulated exocytosis in bladder umbrella cells requires phosphorylation of ADAM17 Ser811 and EGF receptor transactivation.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3798-3812 (2014).</li><li>Gallo, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAB27B+requirement+for+stretch-induced+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells.">RAB27B requirement for stretch-induced exocytosis in bladder umbrella cells.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 314 (3), 349-365 (2018).</li><li>Amasheh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-2+expression+induces+cation-selective+channels+in+tight+junctions+of+epithelial+cells.">Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 115, 4969-4976 (2002).</li><li>Yu, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+cation+selectivity+in+claudin-2-based+paracellular+pores:+identification+of+an+electrostatic+interaction+site.">Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: identification of an electrostatic interaction site.</a> The Journal of General Physiology. 133 (1), 111-127 (2009).</li><li>Kasahara, H., Aoki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+using+adenoviral+RNAi+vector+in+vascular+smooth+muscle+cells+and+cardiomyocytes.">Gene silencing using adenoviral RNAi vector in vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes.</a> Methods in Molecular Medicine. 112, 155-172 (2005).</li><li>Bolognesi, B., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaching+the+limit.">Reaching the limit.</a> eLife. 7, 39804 (2018).</li><li>Atasheva, S., Shayakhmetov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+responses+to+adenovirus+and+adenovirus+vectors.">Cytokine responses to adenovirus and adenovirus vectors.</a> Viruses. 14 (5), 888 (2022).</li><li>Sanchez Freire, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+may+mediate+the+down-regulation+of+neurokinin-1+receptor+in+chronic+bladder+pain+syndrome.">MicroRNAs may mediate the down-regulation of neurokinin-1 receptor in chronic bladder pain syndrome.</a> American Journal of Pathology. 176 (1), 288-303 (2010).</li></ol>

Medan Ramesh et al. fokuserade på att utveckla strategier för att använda adenoviral transduktion vid behandling av blåscancer 18, har nyare rapporter visat användbarheten av dessa tekniker för att studera normal urotelial biologi / fysiologi och patofysiologi 10,18,19,20,21 . De viktiga funktionerna i detta tillvägagångssätt i...

Urotelet är det specialiserade epitelet som leder njurbäckenet, urinledarna, urinblåsan och proximala urinröret1. Den består av tre skikt: ett lager av mycket differentierade och polariserade ofta bi-nukleära paraplyceller, vars apikala ytor badas i urin; Ett intermediärt cellskikt med en population av transitförstärkande bikärnceller som kan ge upphov till ytliga paraplyceller som svar på deras akuta förlust. och ett enda lager av basalceller, varav en delmängd fungerar som stamceller som kan regenerera hela urotelet som svar på kronisk skada. Paraplyceller är huvudsakligen ansvariga för att bilda urotelbarriären med hög resistans, vars komponenter innefattar ett apikalt membran (rikt på kolesterol och cerebrosider) med låg permeabilitet för vatten och lösta ämnen och ett apikalt korsningskomplex med hög resistans (bestående av snäva korsningar, vidhäftande korsningar, desmosomer och en associerad aktomyosinring)1 . Både paraplycellens apikala yta och dess korsningsring expanderar under blåsfyllning och återgår snabbt till sitt förfyllda tillstånd efter tömning 1,2,3,4,5. Förutom sin roll i barriärfunktionen antas urotelet också ha sensoriska och givarfunktioner som gör det möjligt att känna av förändringar i den extracellulära miljön (t.ex. sträcka) och överföra denna information via frisättning av mediatorer (inklusive ATP, adenosin och acetylkolin) till underliggande vävnader, inklusive suburoteliala afferenta nervprocesser 6,7,8 . Nya bevis på denna roll finns hos möss som saknar urotelial uttryck av både Piezo1 och Piezo2, vilket resulterar i förändrad tömningsfunktion9. Dessutom utvecklar råttor som överuttrycker det porbildande proteinet CLDN2 i paraplycellskiktet inflammation och smärta som är analog med den som ses hos patienter med interstitiell cystit10. Det antas att störningar i urotelial sensorisk / givare eller barriärfunktion kan bidra till flera blåsstörningar 6,11.
En bättre förståelse av urotelets biologi i normala och sjukdomstillstånd beror på tillgången på verktyg som gör det möjligt för utredare att lätt nedreglera endogent genuttryck eller möjliggöra uttryck av transgener i den ursprungliga vävnaden. Medan ett tillvägagångssätt för att nedreglera genuttryck är att generera villkorliga uroteliala knockoutmöss, beror detta tillvägagångssätt på tillgången på möss med floxed alleler, är arbetsintensiv och kan ta månader till år att slutföra12. Inte överraskande har utredare utvecklat tekniker för att transfektera eller transducera urotelet, vilket kan leda till resultat på en kortare tidsskala. Publicerade metoder för transfektion inkluderar användning av katjoniska lipider13, anti-sense fosforotierade oligodeoxinukleotider 14 eller antisensnukleinsyror bundna till HIV TAT-proteinpenetrerande 11-merpeptid15. Fokus för detta protokoll ligger dock på användningen av adenoviralmedierad transduktion, en välstuderad metod som är effektiv vid genleverans till ett brett spektrum av celler, har testats i många kliniska prövningar och användes senast för att leverera cDNA som kodar för COVID-19-kapsidproteinet till mottagare av en variant av COVID-19-vaccinet16, 17. För en mer ingående beskrivning av adenovirusets livscykel, adenovirala vektorer och kliniska tillämpningar av adenovirus hänvisas läsaren till referens17.
En viktig milstolpe i användningen av adenovirus för att transducera urotelet var en rapport av Ramesh et al. som visade korta förbehandlingar med tvättmedel, inklusive N-dodecyl-β-D-maltosid (DDM) dramatiskt förbättrad transduktion av urotelet med ett adenovirus som kodar β-galaktosidas18. Med hjälp av denna proof-of-principle-studie som vägledning har adenoviralmedierad transduktion av urotelet nu använts för att uttrycka en mängd olika proteiner, inklusive Rab-familj GTPaser, guanin-nukleotidutbytesfaktorer, myosinmotorfragment, porbildande täta korsningsassocierade kladiner och ADAM17 10,19,20,21,22 . Samma tillvägagångssätt anpassades för att uttrycka små störande RNA (siRNA), vars effekter räddades genom samuttryckande siRNA-resistenta varianter av transgenen22. Protokollet som beskrivs här innehåller allmänna metoder för att generera stora mängder högkoncentrerat adenovirus, ett krav för dessa tekniker, liksom anpassningar av metoderna för Ramesh et al.18 för att uttrycka transgener i urotelet med hög effektivitet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL pipette</td>
			<td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td>
			<td>CLS4488</td>
			<td>sterile, serological pipette, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mL ultracentrifuge tube</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>06-752</td>
			<td>PET thinwall ultracentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352097</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G needle</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>305196</td>
			<td>18 G x 1.5 in needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL pipette</td>
			<td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td>
			<td>CLS4489</td>
			<td>sterile, serological pipette, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352098</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipette</td>
			<td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td>
			<td>CLS4487</td>
			<td>sterile, serological pipette, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cavicide</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>6400012</td>
			<td>Anti-viral solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish - 15 cm</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>353025</td>
			<td>sterile, tissue-culture treated&#160; (150 mm x 25 mm dish)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>893.1832</td>
			<td>handle length 24 cm, blade length 1.7 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C-4306</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM culture medium (high glucose)</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11965092</td>
			<td>with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>EDS</td>
			<td>Bioiultra grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Hyclone (Cytiva)</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td>defined serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td>5.75 in glass pipette, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G-5516</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV catheter - mouse</td>
			<td>Smith Medical Jelco</td>
			<td>3063</td>
			<td>24 G x 3/4 in Safety IV catheter&#160; radiopaque</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV catheter - rat</td>
			<td>Smith Medical Jelco</td>
			<td>3060</td>
			<td>22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P-9541</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>Cell culture grade&#160; &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#8226;7 H2O</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>431478</td>
			<td>&#160;&#8805; 99.99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-dodecyl-&#946;-D-maltoside&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4641</td>
			<td>&#160;&#8805; 98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nose cone for multiple animals</td>
			<td>custom designed</td>
			<td></td>
			<td>commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-10 column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-085-01</td>
			<td>Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin antibiotic (100x)</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>15070063</td>
			<td>100x concentrated solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>BioPhotometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stand and clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-679Q and 05-769-8FQ</td>
			<td>available from numerous suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter unit</td>
			<td>Fisher Scientific (Nalgene)</td>
			<td>09-740-65B</td>
			<td>0.2 &#181;m rapid-flow filter unit (150 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter unit 0.2 &#181;m (syringe)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td>Millipore Sigma Milex 0.22 &#181;m filter unit that attaches to syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super speed centrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5810R</td>
			<td>with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1 mL)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>309628</td>
			<td>1-mL syringe Luer-lok tip - sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (3 mL)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>309656</td>
			<td>3-mL syringe slip tip - sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table-top centrifuge (low speed)</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5702</td>
			<td>with swinging bucket rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td>polyethylene 3.4 mL transfer pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>648310-M</td>
			<td>Molecular Biology grade&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE select protease solution</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>12604013</td>
			<td>TrypLE express enzyme (1x), no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-80 XP</td>
			<td>with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporizer&#160;</td>
			<td>General Anesthetic Services, Inc.</td>
			<td>Tec 3</td>
			<td>Isoflurane vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td>analog vortex mixer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of transgenes in native bladder urothelium using adenovirus-mediated transduction

Förutom att bilda en högresistensbarriär antas urotelet som fodrar njurbäckenet, urinledarna, urinblåsan och proximala urinröret känna av och överföra information om sin miljö till de underliggande vävnaderna, vilket främjar tömningsfunktion och beteende. Störning av urotelbarriären, eller dess sensoriska / givarfunktion, kan leda till sjukdom. Att studera dessa komplexa händelser hindras av brist på enkla strategier för att förändra gen- och proteinuttryck i urotelet. Här beskrivs metoder som gör det möjligt för utredare att generera stora mängder adenovirus med hög titer, som sedan kan användas för att transducera gnagareurotel med hög effektivitet och på ett relativt enkelt sätt. Både cDNA och små interfererande RNA kan uttryckas med adenoviral transduktion, och effekten av transgenuttryck på urotelial funktion kan bedömas 12 timmar till flera dagar senare. Dessa metoder har bred tillämpbarhet för studier av normal och onormal urotelbiologi med hjälp av mus- eller råttdjursmodeller.

Virusberedning Ett exempel på virusrening genom densitetsgradientcentrifugering visas i figur 1A. Det ljusrosa bandet, som finns vid gränssnittet mellan det laddade cellulära materialet och 1,25 g / ml CsCl-skiktet, består huvudsakligen av störda celler och deras skräp (se magentapilen i figur 1A). Den härleder sin rosa färg från den lilla mängden odlingsmedium som överförs från steg 1.5 i protokollet. Viruspartiklarna av intress...

Watch this Scientific Journal Video about Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction at JoVE.com

Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction

Metoder beskrivs för generering av stora mängder rekombinanta adenovirus, som sedan kan användas för att transducera det ursprungliga gnagarurotelet vilket möjliggör uttryck av transgener eller nedreglering av endogena genprodukter.

Uttryck av transgener i ursprungligt urinblåsurotel med adenovirusmedierad transduktion

In addition to forming a high-resistance barrier, the urothelium lining the renal pelvis, ureters, bladder, and proximal urethra is hypothesized to sense ...

Detta protokoll beskriver metoder som gör det möjligt för utredare att uttrycka CDNA eller SIRNA i det ursprungliga urinblåsans urotel. De främsta fördelarna med denna teknik är dess relativa enkelhet, förmågan att uttrycka cDNA, siRNA i urotelet med hög effektivitet och inom en relativt kort tidsperiod. Den svåraste delen av denna teknik är kateteriseringen.Den övergripande tekniken är dock relativt lätt att behärska när man väl lärt sig. Demonstrerar proceduren kommer att vara Giovanni Ruiz, en forskningsspecialist IV i mitt laboratorium. För att börja, placera den bedövade musen på en värmedyna bredvid näskottarna.Håll djuret under anestesi under protokollets varaktighet. Kontrollera att musen är helt bedövad med en tånypa. För att förhindra att luft införs i urinblåsan, fyll plastkateterdelen av en IV-kateter och tillhörande nav med steril PBS med en steril överföringspipett eller spruta.Med djuret i ryggläge swab den yttre urinröret meatus med 70% alkohol. Ta sedan försiktigt vävnaden som bildar den yttre urinrörsmeatusen och förläng den vertikalt bort från djuret med fina pincett. Sätt in den sterila katetern i den yttre meatusen.Använd den andra handen försiktigt sätt in katetern vertikalt cirka tre till fyra millimeter i urinrörets meatus. Sänk sedan katetern in i den yttre meatus mot djurets svans, vilket underlättar dess inträde i den del av urinröret som passerar under blygdbenet och slutligen in i urinblåsan. Låt urinen i urinblåsan läcka ut.Ta bort eventuell kvarvarande urin genom att utföra Credes manöver genom att massera och försiktigt trycka ner blåsstöten i nedre bukområdet. För att göra urotelet mottagligt för transduktion, tvätta mus- eller råttblåsan genom att fästa en steril en milliliter spruta fylld med PBS till kateternavet. Injicera 100 mikroliter steril PBS i musblåsan.När du har tagit bort sprutan från kateterbeslaget, låt PBS rinna av. Sätt in 100 mikroliter 0,1% N-dodecyl-beta-D-maltosid upplöst i PBS och 0,2 mikrometer filter steriliserat i musblåsan med en steril en-milliliter spruta. Behåll N-dodecyl-beta-D-maltosiden i urinblåsan i 10 minuter genom att lämna sprutan på plats.Ta bort N-dodecyl-beta-D-maltosiden från urinblåsan genom att lossa sprutan och låta den rinna ut. För att införa viruset i blåsan, fäst en steril en-milliliter spruta till kateternavet och infoga 5.000.000 till 100.000.000 IVP adenovirus utspätt i 100 mikroliter steril PBS för möss eller 450 mikroliter för råttor i blåsan. Efter 30 minuter, lossa sprutan och låt viruslösningen evakuera blåsan på en engångsdyna.Torka eventuell kvarvarande viruslösning med en absorberande servett medan du kasserar dynan och torka av biofarligt avfall. För att djuret ska kunna återhämta sig, upphöra med flödet av isofluran. Låt djuret återhämta sig och vara fullt rörligt innan det återförs till sin bur, särskilt om djuren hålls i grupp.Analysera effekterna av transgenuttryck 12 till 72 timmar efter behandling med hjälp av metoder såsom mRNA in situ hybridisering, Western blot eller immunofluorescens. Western blot-analys av uroteliala lysater avslöjade V5-märkt humant tillväxthormonuttryck i urotelet hos transducerade blåsor, men inte i otransducerade sådana. Uttrycket bekräftades också av immunofluorescens med antikroppar som kände igen humant tillväxthormon, eller V5-epitopmärket.Western blot-analys bekräftade uttrycket av Claudin-2 hos råttor transducerade med adenovirus, men inte hos de som transducerades med ett kontrollerat GFP-kodande virus. Immunofluorescensanalys bekräftade vidare exogent Claudin-2-uttryck i uroteliala paraplyceller transducerade med viruskodande Claudin-2 cDNA. Detektion av exogent Claudin-2 i Tight Junction Protein 1 genom immunofluorescens och konfokalmikroskopi av helmonterat eller tvärsnittsurotel avslöjade närvaron av Tight Junction och intracellulära ansamlingar av Claudin-2 i cellcytoplasman.Bildfältet visar att räkning av antalet transducerade paraplyceller avslöjar en effektivitet som närmar sig 95%och i hela blåsväggen transduceras endast urotelet, och ingen annan vävnad riktas mot det instillerade adenoviruset. Kateteriseringen är avgörande för att protokollet ska fungera som avsett. Denna teknik gör det möjligt för utredare att studera normal urotelbiologi, samt att förstå förhållanden där proteinöveruttryck eller underuttryck leder till sjukdom.

Research

JoVE Journal

Biology

Targeted Expression of GFP in the Hair Follicle Using Ex Vivo Viral Transduction

Riktade Redovisning av GFP i hårsäcken Använda ex vivo Viral Transduction

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Beredningen av primära hematopoietisk cell kulturer från Murine Bone Marrow för elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Detection of Protein Ubiquitination

Detektion av protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Färgning av proteinerna i geler med Coomassie G-250 utan organiska lösningsmedel och ättiksyra

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Använda Gene Pulser MXcell elektroporation System till transfektera primärceller med hög verkningsgrad

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Hjälp av ett automatiserat celltalsräknare att förenkla Studier Gene Expression: siRNA Knockdown av IL-4 beroende genuttryck i Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

Adenovirus-medierad genetisk Borttagning av signalmolekyler i odlade primära musknappen Embryonala fibroblasts

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

Produktionen av C. elegans Transgener via Recombineering med GalK Markör

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Beredning av Active T. castaneum Telomeras

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Proteomic Provberedning från formalinfixerade och paraffininbäddade vävnads

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...