Name: expression of transgenes in native bladder urothelium using adenovirus-mediated transduction
Uploaded: 2022-10-06T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction at JoVE.com

Bu çalışma, P30DK079307 (M.G.D.'ye), NIH hibesi R01DK119183 (G.A. ve MDC'ye), NIH hibesi R01DK129473 (G.A.'ya), Amerikan Üroloji Derneği Kariyer Geliştirme ödülü ve Winters Vakfı hibesi (N.M.'ye), Pittsburgh Böbrek Araştırmaları Merkezi'nin Hücre Fizyolojisi ve Model Organizmalar Böbrek Görüntüleme Çekirdekleri (P30DK079307) tarafından bir pilot proje ödülü ile desteklenmiştir. ve bu el yazmasında sunulan görüntülerin bazılarını yakalamak için kullanılan konfokal sistemin satın alınmasını finanse eden S10OD028596 (G.A.'ya) tarafından.

BSL2 sertifikası gerektiren adenovirüslerin üretimini içeren deneyler, Pittsburgh Üniversitesi Çevre Sağlığı ve Güvenliği ofisleri ve Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi'nin onayı altında gerçekleştirildi. Adenoviral transdüksiyon (ABSL2 sertifikası gerektiren) dahil olmak üzere gerçekleştirilen tüm hayvan deneyleri, İnsancıl Bakım ve Laboratuvar Hayvanlarının Kullanımına İlişkin Halk Sağlığı Hizmeti Politikası ve Hayvan Refahı Yasası'nın ilgili yönergelerine / düzenlemelerine uygun o...

<ol>
	<li>Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Urothelium:+Life+in+a+liquid+environment.">The Urothelium: Life in a liquid environment.</a> Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).</li><li>Truschel, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-regulated+exocytosis/endocytosis+in+bladder+umbrella+cells.">Stretch-regulated exocytosis/endocytosis in bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (3), 830-846 (2002).</li><li>Lewis, S. A., de Moura, J. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+cytoplasmic+vesicles+into+apical+membrane+of+mammalian+urinary+bladder+epthelium.">Incorporation of cytoplasmic vesicles into apical membrane of mammalian urinary bladder epthelium.</a> Nature (London). 297 (5868), 685-688 (1982).</li><li>Eaton, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+contraction+of+the+umbrella+cell+apical+junctional+ring+in+response+to+bladder+filling+and+voiding.">Expansion and contraction of the umbrella cell apical junctional ring in response to bladder filling and voiding.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (16), 2037-2052 (2019).</li><li>Yu, W., Khandelwal, P., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+apical+and+basolateral+membrane+requirements+for+stretch-induced+membrane+traffic+at+the+apical+surface+of+bladder+umbrella+cells.">Distinct apical and basolateral membrane requirements for stretch-induced membrane traffic at the apical surface of bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (1), 282-295 (2009).</li><li>Birder, L., Andersson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+signaling.">Urothelial signaling.</a> Physiological Reviews. 93 (2), 653-680 (2013).</li><li>Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+bladder,+cystitis+and+nerve/urothelial+interactions.">Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions.</a> Autonomic Neuroscience. 182, 89-94 (2014).</li><li>Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+uroepithelial-associated+sensory+web.">The uroepithelial-associated sensory web.</a> Kidney International. 72 (9), 1057-1064 (2007).</li><li>Dalghi, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+for+PIEZO1+and+PIEZO2+in+urothelial+mechanotransduction+and+lower+urinary+tract+interoception.">Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (19), 152984 (2021).</li><li>Montalbetti, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+urothelial+paracellular+transport+promotes+cystitis.">Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis.</a> American Journal of Physiology: Renal Physiology. 309 (12), 1070-1081 (2015).</li><li>Keay, S. K., Birder, L. A., Chai, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+bladder+urothelial+pathophysiology+in+functional+bladder+disorders.">Evidence for bladder urothelial pathophysiology in functional bladder disorders.</a> BioMed Research International. 2014, 865463 (2014).</li><li>Friedel, R. H., Wurst, W., Wefers, B., Kuhn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+conditional+knockout+mice.">Generating conditional knockout mice.</a> Methods in Molecular Biology. 693, 205-231 (2011).</li><li>Kashyap, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+nerve+growth+factor+expression+in+the+bladder+by+antisense+oligonucleotides+as+new+treatment+for+overactive+bladder.">Down-regulation of nerve growth factor expression in the bladder by antisense oligonucleotides as new treatment for overactive bladder.</a> Journal of Urology. 190 (2), 757-764 (2013).</li><li>Bolenz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+and+ex+vivo+urothelial+penetration+by+oligodeoxynucleotides+for+optimizing+treatment+of+transitional+cell+carcinoma.">Cellular uptake and ex vivo urothelial penetration by oligodeoxynucleotides for optimizing treatment of transitional cell carcinoma.</a> Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 30 (5), 265-273 (2008).</li><li>Tyagi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravesical+antisense+therapy+for+cystitis+using+TAT-peptide+nucleic+acid+conjugates.">Intravesical antisense therapy for cystitis using TAT-peptide nucleic acid conjugates.</a> Molecular Pharmaceutics. 3 (4), 398-406 (2006).</li><li>Sadoff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interim+results+of+a+phase+1-2a+trial+of+Ad26.COV2.S+Covid-19+vaccine.">Interim results of a phase 1-2a trial of Ad26.COV2.S Covid-19 vaccine.</a> New England Journal of Medicine. 384 (19), 1824-1835 (2021).</li><li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+delivery:+Potential+applications+for+gene+and+cell-Based+therapies+in+the+new+era+of+personalized+medicine.">Adenovirus-mediated gene delivery: Potential applications for gene and cell-Based therapies in the new era of personalized medicine.</a> Genes &amp; Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).</li><li>Ramesh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+pretreatment+agents+to+enhance+adenovirus+infection+of+bladder+epithelium.">Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium.</a> Molecular Therapy. 10 (4), 697-705 (2004).</li><li>Khandelwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab11a-dependent+exocytosis+of+discoidal/fusiform+vesicles+in+bladder+umbrella+cells.">Rab11a-dependent exocytosis of discoidal/fusiform vesicles in bladder umbrella cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15773-15778 (2008).</li><li>Khandelwal, P., Ruiz, W. G., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+endocytosis+in+bladder+umbrella+cells+occurs+through+an+integrin-regulated+and+RhoA-+and+dynamin-dependent+pathway.">Compensatory endocytosis in bladder umbrella cells occurs through an integrin-regulated and RhoA- and dynamin-dependent pathway.</a> The European Molecular Biology Organization journal. 29 (12), 1961-1975 (2010).</li><li>Khandelwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rab11a-Rab8a-Myo5B+network+promotes+stretch-regulated+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells.">A Rab11a-Rab8a-Myo5B network promotes stretch-regulated exocytosis in bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 24 (7), 1007-1019 (2013).</li><li>Prakasam, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A1+adenosine+receptor-stimulated+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells+requires+phosphorylation+of+ADAM17+Ser811+and+EGF+receptor+transactivation.">A1 adenosine receptor-stimulated exocytosis in bladder umbrella cells requires phosphorylation of ADAM17 Ser811 and EGF receptor transactivation.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3798-3812 (2014).</li><li>Gallo, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAB27B+requirement+for+stretch-induced+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells.">RAB27B requirement for stretch-induced exocytosis in bladder umbrella cells.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 314 (3), 349-365 (2018).</li><li>Amasheh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-2+expression+induces+cation-selective+channels+in+tight+junctions+of+epithelial+cells.">Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 115, 4969-4976 (2002).</li><li>Yu, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+cation+selectivity+in+claudin-2-based+paracellular+pores:+identification+of+an+electrostatic+interaction+site.">Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: identification of an electrostatic interaction site.</a> The Journal of General Physiology. 133 (1), 111-127 (2009).</li><li>Kasahara, H., Aoki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+using+adenoviral+RNAi+vector+in+vascular+smooth+muscle+cells+and+cardiomyocytes.">Gene silencing using adenoviral RNAi vector in vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes.</a> Methods in Molecular Medicine. 112, 155-172 (2005).</li><li>Bolognesi, B., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaching+the+limit.">Reaching the limit.</a> eLife. 7, 39804 (2018).</li><li>Atasheva, S., Shayakhmetov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+responses+to+adenovirus+and+adenovirus+vectors.">Cytokine responses to adenovirus and adenovirus vectors.</a> Viruses. 14 (5), 888 (2022).</li><li>Sanchez Freire, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+may+mediate+the+down-regulation+of+neurokinin-1+receptor+in+chronic+bladder+pain+syndrome.">MicroRNAs may mediate the down-regulation of neurokinin-1 receptor in chronic bladder pain syndrome.</a> American Journal of Pathology. 176 (1), 288-303 (2010).</li></ol>

Ramesh ve ark. mesane kanseri tedavisinde adenoviral transdüksiyonu kullanmak için stratejiler geliştirmeye odaklanmış olsalar da 18, daha yeni raporlar bu tekniklerin normal ürotelyal biyoloji / fizyoloji ve patofizyoloji 10,18,19,20,21 çalışmalarında yararlılığını göstermiştir . Bu yaklaşımın önemli özellikleri ?...

Ürotelyum, renal pelvis, üreterler, mesane ve proksimal üretra1'i kaplayan özel bir epiteldir. Üç tabakadan oluşur: apikal yüzeyleri idrarla yıkanan, oldukça farklılaşmış ve polarize olmuş, genellikle iki çekirdekli şemsiye hücrelerden oluşan bir tabaka; akut kayıplarına yanıt olarak yüzeysel şemsiye hücrelerine yol açabilen bi-nükleat geçiş-yükseltici hücre popülasyonuna sahip bir ara hücre tabakası; ve bir alt kümesi, kronik hasara yanıt olarak ürotelyumun tamamını yenileyebilen kök hücreler olarak işlev gören tek bir bazal hücre tabakası. Şemsiye hücreleri, bileşenleri suya ve çözünürlere karşı düşük geçirgenliğe sahip bir apikal membran (kolesterol ve serebrosidler bakımından zengin) ve yüksek dirençli apikal bileşke kompleksi (sıkı bağlantılar, aderens kavşakları, dezmozomlar ve ilişkili bir aktomiyosin halkasından oluşan) içeren yüksek dirençli ürotelyal bariyerin oluşturulmasından başlıca sorumludur.1 . Hem şemsiye hücresinin apikal yüzeyi hem de bileşke halkası mesane dolgusu sırasında genişler ve 1,2,3,4,5 işedikten sonra hızla önceden doldurulmuş hallerine geri döner. Bariyer fonksiyonundaki rolüne ek olarak, ürotelyumun ayrıca hücre dışı ortamdaki değişiklikleri (örneğin, gerilme) algılamasına ve bu bilgiyi subürotelyal afferent sinir süreçleri de dahil olmak üzere altta yatan dokulara (ATP, adenosin ve asetilkolin dahil) salınımı yoluyla iletmesine izin veren duyusal ve dönüştürücü fonksiyonlara sahip olduğu varsayılmıştır 6,7,8 . Bu rolün son kanıtları, hem Piezo1 hem de Piezo2'nin ürotelyal ekspresyonundan yoksun farelerde bulunur ve bu da işeme fonksiyonunun değişmesine neden olur9. Ek olarak, şemsiye hücre tabakasında sıkı bağlantı gözenek oluşturan protein CLDN2'yi aşırı eksprese eden sıçanlar, interstisyel sistit10 hastalarında görülene benzer inflamasyon ve ağrı geliştirir. Ürotelyal duyusal/transdüser veya bariyer fonksiyonunun bozulmasının birçok mesane bozukluğuna katkıda bulunabileceği varsayılmıştır 6,11.
Normal ve hastalık durumlarında ürotelyumun biyolojisinin daha iyi anlaşılması, araştırmacıların endojen gen ekspresyonunu kolayca aşağı regüle etmelerine veya doğal dokudaki transgenlerin ekspresyonuna izin vermelerine izin verecek araçların mevcudiyetine bağlıdır. Gen ekspresyonunu aşağı regüle etmeye yönelik bir yaklaşım, koşullu ürotelyal nakavt fareleri üretmek olsa da, bu yaklaşım flokslu alelleri olan farelerin mevcudiyetine bağlıdır, emek yoğundur ve12'nin tamamlanması aylar ila yıllar sürebilir. Şaşırtıcı olmayan bir şekilde, araştırmacılar ürotelyumu transfekte etmek veya transdübe etmek için teknikler geliştirdiler ve bu da daha kısa bir zaman ölçeğinde sonuçlara yol açabilir. Transfeksiyon için yayınlanmış yöntemler arasında katyonik lipitler 13, anti-sens fosforothioated oligodeoksinükleotidler14 veya HIV TAT proteinine nüfuz eden 11-mer peptid15'e bağlı antisens nükleik asitlerin kullanımı bulunmaktadır. Bununla birlikte, bu protokolün odak noktası, geniş bir hücre yelpazesine gen iletiminde etkili olan, çok sayıda klinik çalışmada test edilmiş ve en son COVID-19 kapsid proteinini kodlayan cDNA'yı COVID-19 aşısının bir varyantının alıcılarına iletmek için kullanılan iyi çalışılmış bir metodoloji olan adenoviral aracılı transdüksiyonun kullanılmasıdır16, 17. Adenovirüs yaşam döngüsünün, adenoviral vektörlerin ve adenovirüslerin klinik uygulamalarının daha kapsamlı bir açıklaması için, okuyucu referans17'ye yönlendirilir.
Ürotelyumu dönüştürmek için adenovirüslerin kullanımında önemli bir kilometre taşı, Ramesh ve ark. tarafından hazırlanan ve N-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) dahil olmak üzere deterjanlarla yapılan kısa ön işlemlerin, β-galaktosidaz18'i kodlayan bir adenovirüs tarafından ürotelyumun transdüksiyonunu önemli ölçüde artırdığını gösteren bir rapordu. Bu prensip kanıtı çalışmasını bir rehber olarak kullanarak, ürotelyumun adenoviral aracılı transdüksiyonu, Rab ailesi GTPazları, guanin-nükleotid değişim faktörleri, miyozin motor fragmanları, gözenek oluşturan sıkı bağlantı ile ilişkili klodinler ve ADAM17 10,19,20,21,22 dahil olmak üzere çeşitli proteinleri ifade etmek için kullanılmıştır . Aynı yaklaşım, etkileri transgen22'nin siRNA'ya dirençli varyantlarının birlikte eksprese edilmesiyle kurtarılan küçük müdahale eden RNA'ları (siRNA) ifade etmek için uyarlandı. Burada açıklanan protokol, bu teknikler için bir gereklilik olan büyük miktarlarda yüksek konsantrasyonlu adenovirüs üretmek için genel yöntemlerin yanı sıra, ürotelyumdaki transgenleri yüksek verimlilikle ifade etmek için Ramesh ve ark.18 yöntemlerinin uyarlanmasını içerir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL pipette</td>
			<td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td>
			<td>CLS4488</td>
			<td>sterile, serological pipette, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mL ultracentrifuge tube</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>06-752</td>
			<td>PET thinwall ultracentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352097</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G needle</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>305196</td>
			<td>18 G x 1.5 in needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL pipette</td>
			<td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td>
			<td>CLS4489</td>
			<td>sterile, serological pipette, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352098</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipette</td>
			<td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td>
			<td>CLS4487</td>
			<td>sterile, serological pipette, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cavicide</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>6400012</td>
			<td>Anti-viral solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish - 15 cm</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>353025</td>
			<td>sterile, tissue-culture treated&#160; (150 mm x 25 mm dish)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>893.1832</td>
			<td>handle length 24 cm, blade length 1.7 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C-4306</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM culture medium (high glucose)</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11965092</td>
			<td>with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>EDS</td>
			<td>Bioiultra grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Hyclone (Cytiva)</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td>defined serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td>5.75 in glass pipette, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G-5516</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV catheter - mouse</td>
			<td>Smith Medical Jelco</td>
			<td>3063</td>
			<td>24 G x 3/4 in Safety IV catheter&#160; radiopaque</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV catheter - rat</td>
			<td>Smith Medical Jelco</td>
			<td>3060</td>
			<td>22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P-9541</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>Cell culture grade&#160; &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#8226;7 H2O</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>431478</td>
			<td>&#160;&#8805; 99.99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Molecular Biology grade &#8805; 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-dodecyl-&#946;-D-maltoside&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4641</td>
			<td>&#160;&#8805; 98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nose cone for multiple animals</td>
			<td>custom designed</td>
			<td></td>
			<td>commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-10 column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-085-01</td>
			<td>Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin antibiotic (100x)</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>15070063</td>
			<td>100x concentrated solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>BioPhotometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stand and clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-679Q and 05-769-8FQ</td>
			<td>available from numerous suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter unit</td>
			<td>Fisher Scientific (Nalgene)</td>
			<td>09-740-65B</td>
			<td>0.2 &#181;m rapid-flow filter unit (150 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter unit 0.2 &#181;m (syringe)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td>Millipore Sigma Milex 0.22 &#181;m filter unit that attaches to syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super speed centrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5810R</td>
			<td>with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1 mL)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>309628</td>
			<td>1-mL syringe Luer-lok tip - sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (3 mL)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>309656</td>
			<td>3-mL syringe slip tip - sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table-top centrifuge (low speed)</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5702</td>
			<td>with swinging bucket rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td>polyethylene 3.4 mL transfer pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>648310-M</td>
			<td>Molecular Biology grade&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE select protease solution</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>12604013</td>
			<td>TrypLE express enzyme (1x), no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-80 XP</td>
			<td>with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporizer&#160;</td>
			<td>General Anesthetic Services, Inc.</td>
			<td>Tec 3</td>
			<td>Isoflurane vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td>analog vortex mixer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of transgenes in native bladder urothelium using adenovirus-mediated transduction

Yüksek dirençli bir bariyer oluşturmanın yanı sıra, renal pelvis, üreterler, mesane ve proksimal üretrayı kaplayan ürotelyumun, çevresi hakkındaki bilgileri altta yatan dokulara algılamak ve iletmek, işeme fonksiyonunu ve davranışını teşvik etmek için varsayılmıştır. Ürotelyal bariyerin veya duyusal / dönüştürücü fonksiyonunun bozulması hastalığa yol açabilir. Bu karmaşık olayları incelemek, ürotelyumdaki gen ve protein ekspresyonunu değiştirmek için basit stratejilerin eksikliği nedeniyle engellenmektedir. Burada, araştırmacıların kemirgen ürotelyumunu yüksek verimlilikle ve nispeten basit bir şekilde dönüştürmek için kullanılabilecek büyük miktarlarda yüksek titreli adenovirüs üretmelerine izin veren yöntemler açıklanmaktadır. Hem cDNA'lar hem de küçük müdahale eden RNA'lar adenoviral transdüksiyon kullanılarak eksprese edilebilir ve transgen ekspresyonunun ürotelyal fonksiyon üzerindeki etkisi 12 saat ila birkaç gün sonra değerlendirilebilir. Bu yöntemler, fare veya sıçan hayvan modellerini kullanan normal ve anormal ürotelyal biyoloji çalışmalarına geniş uygulanabilirliğe sahiptir.

Virüs hazırlığı Yoğunluk gradyanı santrifüjleme ile virüs saflaştırmanın bir örneği Şekil 1A'da gösterilmiştir. Yüklenen hücresel malzemenin ve 1.25 g / mL CsCl tabakasının arayüzünde bulunan açık pembe bant, esas olarak bozulmuş hücrelerden ve kalıntılarından oluşur ( Şekil 1A'daki macenta okuna bakınız). Pembemsi rengini, protokoldeki adım 1.5'ten taşınan az miktarda kültür ortamından alır. Süt beya...

Watch this Scientific Journal Video about Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction at JoVE.com

Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction

Büyük miktarlarda rekombinant adenovirüslerin üretimi için yöntemler tanımlanmıştır, bu daha sonra transgenlerin ekspresyonuna veya endojen gen ürünlerinin aşağı regülasyonuna izin veren doğal kemirgen ürotelyumunu dönüştürmek için kullanılabilir.

Adenovirüs Aracılı Transdüksiyon Kullanılarak Doğal Mesane Urothelyumunda Transgenlerin Ekspresyonu

In addition to forming a high-resistance barrier, the urothelium lining the renal pelvis, ureters, bladder, and proximal urethra is hypothesized to sense ...

Bu protokol, araştırmacıların doğal mesane ürotelyumunda CDNA'ları veya SIRNA'ları eksprese etmelerine izin veren yöntemleri açıklar. Bu tekniğin temel avantajları, göreceli basitliği, cDNA'ları, siRNA'ları ürotelyumda yüksek verimlilikle ve nispeten kısa bir süre içinde ifade etme yeteneğidir. Bu tekniğin en zor kısmı kateterizasyondur.Bununla birlikte, genel tekniğin öğrenildikten sonra ustalaşması nispeten kolaydır. Prosedürü gösteren, laboratuvarımda Araştırma Uzmanı IV olan Giovanni Ruiz olacak. Başlamak için, anestezi uygulanan fareyi burun konilerinin yanındaki bir ısıtma yastığına yerleştirin.Protokol süresince hayvanı anestezi altında tutun. Farenin bir parmak tutamağı tutamıyla tamamen uyuşturulduğunu onaylayın. Mesaneye hava girmesini önlemek için, bir IV kateterinin plastik kateter kısmını ve ilişkili göbeği steril bir transfer pipeti veya şırınga kullanarak steril PBS ile doldurun.Hayvan sırtüstü pozisyondayken, dış üretral meatusu% 70 alkol ile sürün. Daha sonra dış üretral meatusu oluşturan dokuyu yavaşça tutun ve ince forsepsler kullanarak hayvandan dikey olarak uzatın. Steril kateteri dış meatusa yerleştirin.Diğer elinizi dikkatlice kullanarak kateteri üretral meatusa dikey olarak yaklaşık üç ila dört milimetre yerleştirin. Daha sonra dış meatusa yerleştirilen kateteri hayvanın kuyruğuna doğru indirin, bu da üretranın kasık kemiğinin altından geçen kısmına ve nihayetinde mesaneye girişini kolaylaştırır. Mesanedeki idrarın dışarı sızmasına izin verin.Crede'in manevrasını yaparak kalan idrarı masaj yaparak ve alt karın bölgesindeki mesane yumruğuna hafifçe bastırarak çıkarın. Ürotelyumu transdüksiyona duyarlı hale getirmek için, kateter göbeğine PBS ile doldurulmuş steril bir mililitrelik bir şırınga takarak fare veya sıçan mesanesini yıkayın. Fare kesesine 100 mikrolitre steril PBS enjekte edin.Şırıngayı kateter bağlantısından ayırdıktan sonra, PBS'nin boşalmasına izin verin. PBS'de çözünmüş% 0.1 N-dodesil-beta-D-maltosid 100 mikrolitre ve steril bir mililitrelik bir şırınga kullanılarak fare kesesine sterilize edilmiş 0.2 mikrometre filtre aşılayın. Şırıngayı yerinde bırakarak N-dodecyl-beta-D-maltoside'i mesanede 10 dakika tutun.N-dodecyl-beta-D-maltoside'ı, şırıngayı ayırarak ve boşalmasına izin vererek mesaneden çıkarın. Virüsü mesaneye sokmak için kateter göbeğine steril bir mililitrelik bir şırınga takın ve fareler için 100 mikrolitre steril PBS'de seyreltilmiş 5.000.000 ila 100.000.000 IVP adenovirüs veya sıçanlar için 450 mikrolitre adenovirüsü mesaneye aşılayın. 30 dakika sonra, şırıngayı ayırın ve virüs çözeltisinin mesaneyi tek kullanımlık bir ped üzerine boşaltmasına izin verin.Kalan virüs çözeltilerini pedi atarken emici bir mendille lekeleyin ve biyolojik olarak tehlikeli atıkları silin. Hayvanın iyileşmesine izin vermek için, izofluran akışını durdurun. Hayvanın kafesine geri dönmeden önce, özellikle de hayvanlar grup halinde barındırılıyorsa, iyileşmesine ve tamamen hareketli olmasına izin verin.Transgen ekspresyonunun etkilerini, mRNA in situ hibridizasyon, Western lekesi veya immünofloresan gibi yöntemleri kullanarak tedaviden 12 ila 72 saat sonra analiz edin. Ürotelyal lizatların Batı leke analizi, transdüe edilmiş mesanelerin ürotelyumunda V5 etiketli insan büyüme hormonu ekspresyonunu ortaya çıkardı, ancak transdüne edilmemiş olanlarda değil. İfade ayrıca, insan büyüme hormonunu veya V5 epitop etiketini tanıyan antikorlar kullanılarak immünofloresan ile doğrulandı.Western blot analizi, adenovirüs ile transdübe edilen sıçanlarda Claudin-2 ekspresyonunu doğruladı, ancak kontrollü bir GFP kodlayan virüs ile dönüştürülenlerde değil. İmmünofloresan analizi, virüs kodlayan Claudin-2 cDNA ile dönüştürülen ürotelyal şemsiye hücrelerinde eksojen Claudin-2 ekspresyonunu daha da doğruladı. İmmünofloresan ve tüm monte edilmiş veya kesitli urothelyumun konfokal mikroskopisi ile Sıkı Bağlantı Proteini 1'de eksojen Claudin-2'nin saptanması, hücre sitoplazmasında Sıkı Kavşak ve hücre içi Claudin-2 birikimlerinin varlığını ortaya koymuştur.Görüntü alanı, transdüe edilmiş şemsiye hücrelerinin sayısını saymanın% 95'e yaklaşan bir verimlilik ortaya koyduğunu ve mesane duvarının tamamında sadece ürotelyumun dönüştürüldüğünü ve aşılanan adenovirüs tarafından başka hiçbir dokunun hedeflenmediğini göstermektedir. Kateterizasyon, protokolün amaçlandığı gibi çalışması için kritik öneme sahiptir. Bu teknik, araştırmacıların normal ürotelyal biyolojiyi incelemelerine ve ayrıca protein aşırı ekspresyonunun veya az ekspresyonunun hastalığa yol açtığı koşulları anlamalarına olanak tanır.

Research

JoVE Journal

Biology

Targeted Expression of GFP in the Hair Follicle Using Ex Vivo Viral Transduction

Ex Vivo Viral İletimi Saç Folikül GFP Hedeflenen İfade

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft ...

Biyoloji

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Detection of Protein Ubiquitination

Protein Ubikitinasyon Tespiti

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Yüksek Verimli Primer Hücre Transfect Gen Verici MXcell Elektroporasyon Sistemi

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Gen İfadesi Çalışmaları basitleştirin Otomatik Hücre Sayıcı kullanma: Namalwa Hücreler IL-4 Bağımlı Gen İfadesi siRNA demonte

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

Kültür İlköğretim Fare Embriyonik Fibroblastlar Sinyal Molekülleri Adenovirüs aracılı Genetik Kaldırma

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Active T. in vitro Sulandırma castaneum Telomeraz

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Genetik olarak kodlanmış Molecular Probes G protein-bağlanmış alıcılar Çalışması için

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Formalin gelen Proteomic Numune Hazırlama parafin blok doku Sabit ve

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...