Name: determination of the mating efficiency of haploids in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2022-12-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Mating Efficiency of Haploids in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af et DBT / Wellcome Trust (India Alliance) tilskud (IA / S / 19/2 / 504632) til SS PN er en forsker støttet af et DBT / Wellcome Trust (India Alliance) tilskud (IA / S / 19 / 2 / 504632). AM støttes af Rådet for Videnskabelig og Industriel Forskning (CSIR), Indiens regering, som seniorforsker (09/087 (0873) / 2017-EMR-I). Forfatterne takker Paike Jayadeva Bhat for diskussioner.

BEMÆRK: Protokollen involverer stort set følgende trin: (1) lapning af haploider i parringseffektivitetsgitterene på en YPD-plade, (2) blanding af haploider i lige stort antal efter 24 timers inkubation og give de blandede haploider et par timer til at parre sig (7 timer i denne undersøgelse), (3) plettering af de blandede celler på YPD til isolering af enkeltkolonier efter 7 timer ved 30 °C, og endelig (4) bestemmelse af antallet af diploider dannet ved anvendelse af de auxotrofe markører. Disse trin diskuteres ...

<ol>
	<li>Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporulation+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).</li><li>Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+yeast+for+budding+geneticists:+A+primer+on+the+Saccharomyces+cerevisiae+model+system.">Budding yeast for budding geneticists: A primer on the Saccharomyces cerevisiae model system.</a> Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).</li><li>Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+cycle+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).</li><li>Erdman, S., Lin, L., Malczynski, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromone-regulated+genes+required+for+yeast+mating+differentiation.">Pheromone-regulated genes required for yeast mating differentiation.</a> Journal of Cell Biology. 140 (3), 461-483 (1998).</li><li>Merlini, L., Dudin, O., Martin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mate+and+fuse:+How+yeast+cells+do+it.">Mate and fuse: How yeast cells do it.</a> Open Biology. 3 (3), 130008 (2013).</li><li>Gustin, M. C., Albertyn, J., Alexander, M., Davenport, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAP+kinase+pathways+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">MAP kinase pathways in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1264-1300 (1998).</li><li>Bardwell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+walk-through+of+the+yeast+mating+pheromone+response+pathway.">A walk-through of the yeast mating pheromone response pathway.</a> Peptides. 26 (2), 339-350 (2005).</li><li>Reid, B. J., Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mating+in+the+cell+cycle+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Regulation of mating in the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Cell Biology. 75, 355-365 (1977).</li><li>Williams, T. C., Peng, B., Vickers, C. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Saccharomyces+cerevisiae+pheromone-response+is+a+metabolically+active+stationary+phase+for+bio-production.">The Saccharomyces cerevisiae pheromone-response is a metabolically active stationary phase for bio-production.</a> Metabolic Engineering Communications. 3, 142-152 (2016).</li><li>Bagnat, M., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+polarization+during+yeast+mating.">Cell surface polarization during yeast mating.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14183-14188 (2002).</li><li>Trueheart, J., Boeke, J. D., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+genes+required+for+cell+fusion+during+yeast+conjugation:+Evidence+for+a+pheromone-induced+surface+protein.">Two genes required for cell fusion during yeast conjugation: Evidence for a pheromone-induced surface protein.</a> Molecular and Cellular Biology. 7 (7), 2316-2328 (1987).</li><li>Sniegowski, P. D., Dombrowski, P. G., Fingerman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+and+Saccharomyces+paradoxus+coexist+in+a+natural+woodland+site+in+North+America+and+display+different+levels+of+reproductive+isolation+from+European+conspecifics.">Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus coexist in a natural woodland site in North America and display different levels of reproductive isolation from European conspecifics.</a> FEMS Yeast Research. 1 (4), 299-306 (2002).</li><li>Replansky, T., Koufopanou, V., Greig, D., Bell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+sensu+stricto+as+a+model+system+for+evolution+and+ecology.">Saccharomyces sensu stricto as a model system for evolution and ecology.</a> Trends in Ecology and Evolution. 23 (9), 494-501 (2008).</li><li>Greig, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+isolation+in+Saccharomyces.">Reproductive isolation in Saccharomyces.</a> Heredity. 102 (1), 39-44 (2009).</li><li>Mayr, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Systematics and the Origin of Species, from the Viewpoint of a Zoologist. , (1999).</li><li>Sprague, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+yeast+mating+reaction.">Assay of yeast mating reaction.</a> Methods in Enzymology. 194, 77-93 (1991).</li><li>McCaffrey, G., Clay, F. J., Kelsay, K., Sprague, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+regulation+of+a+gene+required+for+cell+fusion+during+mating+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Identification and regulation of a gene required for cell fusion during mating of the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 7 (8), 2680-2690 (1987).</li><li>Valtz, N., Peter, M., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAR1+is+required+for+oriented+polarization+of+yeast+cells+in+response+to+mating+pheromones.">FAR1 is required for oriented polarization of yeast cells in response to mating pheromones.</a> Journal of Cell Biology. 131 (4), 863-873 (1995).</li><li>Maclean, C. J., Greig, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prezygotic+reproductive+isolation+between+Saccharomyces+cerevisiae+and+Saccharomyces+paradoxus.">Prezygotic reproductive isolation between Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus.</a> BMC Evolutionary Biology. 8, 1 (2008).</li><li>Murphy, H. A., Kuehne, H. A., Francis, C. A., Sniegowski, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mate+choice+assays+and+mating+propensity+differences+in+natural+yeast+populations.">Mate choice assays and mating propensity differences in natural yeast populations.</a> Biology Letters. 2 (4), 553-556 (2006).</li><li>Leu, J. Y., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+evolution+of+mating+discrimination+in+budding+yeast.">Experimental evolution of mating discrimination in budding yeast.</a> Current Biology. 16 (3), 280-286 (2006).</li><li>Kim, J., Hirsch, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nucleolar+protein+that+affects+mating+efficiency+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+altering+the+morphological+response+to+pheromone.">A nucleolar protein that affects mating efficiency in Saccharomyces cerevisiae by altering the morphological response to pheromone.</a> Genetics. 149 (2), 795-805 (1998).</li><li>Jin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+dynamically+modify+their+environment+to+achieve+better+mating+efficiency.">Yeast dynamically modify their environment to achieve better mating efficiency.</a> Science Signaling. 4 (186), (2011).</li><li>Rogers, D. W., Denton, J. A., McConnell, E., Greig, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+evolution+of+species+recognition.">Experimental evolution of species recognition.</a> Current Biology. 25 (13), 1753-1758 (2015).</li><li>McClure, A. W., Jacobs, K. C., Zyla, T. R., Lew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+in+wild+yeast:+Delayed+interest+in+sex+after+spore+germination.">Mating in wild yeast: Delayed interest in sex after spore germination.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (26), 3119-3127 (2018).</li><li>Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+mating+in+yeast.">Synchronous mating in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (5), 1373-1377 (1973).</li><li>Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stationary+phase+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiology Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).</li><li>Johnston, S. A., Hopper, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+the+yeast+regulatory+gene+GAL4+and+analysis+of+its+dosage+effects+on+the+galactose/melibiose+regulon.">Isolation of the yeast regulatory gene GAL4 and analysis of its dosage effects on the galactose/melibiose regulon.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (22), 6971-6975 (1982).</li><li>Mahilkar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Study of metabolic specialization leading to speciation, using yeast as a model system. , (2021).</li><li>Blank, T. E., Woods, M. P., Lebo, C. M., Xin, P., Hopper, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Gal3+proteins+showing+altered+Gal80p+binding+cause+constitutive+transcription+of+Gal4p-activated+genes+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Novel Gal3 proteins showing altered Gal80p binding cause constitutive transcription of Gal4p-activated genes in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 17 (5), 2566-2575 (1997).</li><li>Rice, W. R., Hostert, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+experiments+on+speciation:+What+have+we+learned+in+40+years.">Laboratory experiments on speciation: What have we learned in 40 years.</a> Evolution. 47 (6), 1637-1653 (1993).</li><li>White, N. J., Snook, R. R., Eyres, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+past+and+future+of+experimental+speciation.">The past and future of experimental speciation.</a> Trends in Ecology and Evolution. 35 (1), 10-21 (2020).</li><li>Milo, R., Jorgensen, P., Moran, U., Weber, G., Springer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioNumbers--The+database+of+key+numbers+in+molecular+and+cell+biology.">BioNumbers--The database of key numbers in molecular and cell biology.</a> Nucleic Acids Research. 38, 750-753 (2010).</li><li>Domitrovic, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+study+of+YER067W,+a+new+protein+involved+in+yeast+metabolism+control+and+drug+resistance.">Structural and functional study of YER067W, a new protein involved in yeast metabolism control and drug resistance.</a> PLoS One. 5 (6), 11163 (2010).</li><li>Lindegren, C. C., Spiegelman, S., Lindegren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mendelian+inheritance+of+adaptive+enzymes.">Mendelian inheritance of adaptive enzymes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 30 (11), 346-352 (1944).</li><li>Dettman, J. R., Sirjusingh, C., Kohn, L. M., Anderson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incipient+speciation+by+divergent+adaptation+and+antagonistic+epistasis+in+yeast.">Incipient speciation by divergent adaptation and antagonistic epistasis in yeast.</a> Nature. 447 (7144), 585-588 (2007).</li><li>Jhuang, H. Y., Lee, H. Y., Leu, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial-nuclear+co-evolution+leads+to+hybrid+incompatibility+through+pentatricopeptide+repeat+proteins.">Mitochondrial-nuclear co-evolution leads to hybrid incompatibility through pentatricopeptide repeat proteins.</a> EMBO Reports. 18 (1), 87-101 (2017).</li><li>Lee, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incompatibility+of+nuclear+and+mitochondrial+genomes+causes+hybrid+sterility+between+two+yeast+species.">Incompatibility of nuclear and mitochondrial genomes causes hybrid sterility between two yeast species.</a> Cell. 135 (6), 1065-1073 (2008).</li><li>Pronk, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxotrophic+yeast+strains+in+fundamental+and+applied+research.">Auxotrophic yeast strains in fundamental and applied research.</a> Applied and Environmental Microbiology. 68 (5), 2095-2100 (2002).</li><li>Madhani, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> From a to &#945;: Yeast as a Model for Cellular Differentiation. , (2007).</li><li>Huxley, C., Green, E. D., Dunham, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+assessment+of+S.+cerevisiae+mating+type+by+PCR.">Rapid assessment of S. cerevisiae mating type by PCR.</a> Trends in Genetics. 6 (8), 236 (1990).</li><li>Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+cost+of+the+green+fluorescent+protein+in+gastrointestinal+bacteria.">Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria.</a> Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).</li><li>Tusso, S., Nieuwenhuis, B. P. S., Weissensteiner, B., Immler, S., Wolf, J. B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+evolution+of+adaptive+divergence+under+varying+degrees+of+gene+flow.">Experimental evolution of adaptive divergence under varying degrees of gene flow.</a> Nature Ecology and Evolution. 5 (3), 338-349 (2021).</li></ol>

Kvantificeringen af parringseffektiviteten i S. cerevisiae er afgørende for at udføre undersøgelser relateret til de gener, der er involveret i parringsveje eller studere det ydre miljøs indflydelse på parringsadfærd. I de sidste to årtier er S. cerevisiae også blevet en populær model til at løse spørgsmål relateret til speciering 14,36,37,38. Tilstedeværelsen af ...

Saccharomyces cerevisiae, almindeligvis kaldet spirende gær, er en encellet eukaryot. Den har to parringstyper, a og α, og udviser både aseksuelle og seksuelle reproduktive cyklusser. A- og α parringstyperne er haploider og kan dele sig mitotisk i fravær af den anden parringstype i det omgivende miljø, som repræsenterer gærens aseksuelle cyklus. Når de to parringstyper er tæt på hinanden, holder de op med at dele sig mitotisk og smelter sammen for at danne en diploid celle. Den diploide gær kan enten opdele mitotisk, når næringsstoffer er til stede eller gennemgå meiose under betingelserne for kvælstofsult i nærværelse af en dårlig kulstofkilde, der ikke kan fermenteres, såsom acetat1. Dette resulterer i dannelsen af sporer, som forbliver sovende, indtil der er gunstige vækstbetingelser. Livscyklussen er afsluttet, når disse sporer spirer, og de to haploide typer frigives tilbage til den haploide pulje 2,3 (figur 1).

Parring af gærceller indbefatter flere trin, såsom agglutination, dannelse af en parringsprojektion eller "shmoo" efterfulgt af celle- og nuklear fusion 4,5. De to parringstyper a og α producerer henholdsvis a-faktor og α-faktor for at indlede parring. Disse faktorer er polypeptidferomoner, der binder til receptorerne (Ste2 og Ste3), der er til stede på celleoverfladen af den modsatte parringstype5. Bindingen af feromonerne til receptorerne initierer feromonresponsvejen, den mitogenaktiverede proteinkinase (MAPK) signaltransduktionsvej 6,7,8. Dette resulterer i anholdelse af cellecyklussen i G1-fasen, hvilket fører til en metabolisk aktiv stationær fase9. Cellerne holder derefter op med at dele sig mitotisk, og de proteiner, der kræves til parring, syntetiseres. Da de haploide celler ikke kan bevæge sig mod hinanden, er en parringsprojektion eller "shmoo" rettet mod parringspartneren. Når cellerne kommer i kontakt, nedbrydes cellevæggen, og det cytoplasmatiske indhold smelter sammen, hvilket resulterer i parring til dannelse af en diploid celle10,11. Parringseffektiviteten mellem haploider er blevet brugt som et mål for speciering i laboratorieudviklede stammer såvel som mellem eksisterende arter12.

At være en simpel eukaryot organisme er gær den valgte model for et stort antal forskningsspørgsmål forbundet med komplekse eukaryote organismer. Et sådant spørgsmål er forbundet med speciering og udviklingen af reproduktive barrierer13,14. For seksuelt reproducerende organismer defineres en art af det biologiske artskoncept (BSC) foreslået af Ernst Mayr15. Ifølge dette koncept siges to individer i en befolkning at tilhøre to forskellige arter, hvis de ikke kan krydse hinanden og er reproduktivt isoleret. Nedbrydning af den seksuelle reproduktive cyklus (som involverer fusion af kønsceller til dannelse af en zygote, udviklingen af zygoten til et afkom og opnåelse af seksuel modenhed hos afkommet) fører til reproduktiv isolation. Som vist i figur 1 er livscyklussen for S. cerevisiae sammenlignelig med den seksuelle reproduktionscyklus: a) fusionen af de to parringstyper a og α svarer til fusionen af kønsceller i seksuelt reproducerende organismer; b) diploidens evne til at gennemgå mitotisk opdeling svarer til, at zygoten udvikler sig til afkom; og c) den diploide, der gennemgår sporulation, er sammenlignelig med processen med gametogenese14.

Pre-zygotisk isolering opstår, når assortativ parring observeres. Givet lige mulighed for at parre sig med to genetisk forskellige a-typer , parrer en α type fortrinsvis med den ene frem for den anden eller omvendt14. I tilfælde af evolutionseksperimenter, hvor haploider er blevet udviklet i forskellige miljøer, kan tilstedeværelsen af en præparringsbarriere bestemmes ved at udføre et parringsassay. Et fald i parringseffektiviteten sammenlignet med forfaderen indikerer udviklingen af en præparringsbarriere. Postzygotisk isolation kan opstå på grund af diploidens manglende evne til at gennemgå effektiv mitotisk deling og/eller sporulation til dannelse af haploide sporer14. Disse kan kvantificeres ved at måle henholdsvis diploidernes væksthastighed og beregne sporulationseffektiviteten. For at studere udviklingen af reproduktive barrierer kræves der derfor robuste metoder til kvantificering af (a) parringseffektiviteten, (b) den mitotiske vækst af diploiden og (c) diploidens sporulationseffektivitet. I dette arbejde rapporteres en robust metode til at kvantificere gærstammernes parringseffektivitet.

I laboratorieforsøg er en af måderne, hvorpå forekomsten af parring kan detekteres, ved hjælp af auxotrofe markører, der supplerer ernæringskravene. Når de to parringstyper er auxotrofe for to forskellige aminosyrer, kan kun den diploide celle dannet ved fusion af de to parringstyper vokse på et medium, der mangler begge aminosyrer. Således er auxotrofe markører nyttige til påvisning af parring både kvalitativt og kvantitativt. En kvalitativ test vil være tilstrækkelig til at identificere parringstypen af en stamme efter meiose16. Kvantitative tests er afgørende, når man er interesseret i at identificere en reduktion i parring, mens man studerer de gener, der er involveret i parringsvejen17,18. Da gær i stigende grad anvendes i specieringsundersøgelser, er det desuden nødvendigt med et praktisk og reproducerbart parringsassay, da kvantificeringen af parringseffektiviteten er et mål for den præzygotiske barriere.

Parringseffektiviteten mellem de to gærparringstyper er tidligere blevet kvantificeret16,19,20. De fleste af de tidligere anvendte metoder er ens i deres design med nogle få variationer 16,21,22,23,24,25. Nogle af dem bruger tidlige logfasekulturer, mens nogle få andre bruger mid-log fasekulturer af haploide stammer. Der er variationer i forholdene, hvor de to parringstyper blandes. Næsten alle protokollerne bruger en nitrocellulosemembran. Suspensioner af begge parringstyper taget fra tidligere dyrkede kulturer blandes og filtreres på en nitrocellulosemembran anbragt på en YPD-plade. I en af variationerne af protokollen lappes den haploide suspension direkte på en YPD-plade21. I forsøg, der beskæftiger sig med de gener, der er involveret i feromonproduktionen af de to parringstyper, tilsættes feromonerne eksternt, mens suspensionerne af de to parringstyperfremstilles 24.

Efter inkubation i et par timer (typisk ca. 5 timer) efter blanding af haploider vaskes cellerne fra membranen, fortyndes og belægges på selektive medier. I en af de tidligere metoder, der blev rapporteret i 1973, blev effektiviteten af zygotdannelse eller parring beregnet ved at tælle antallet af spirende celler, unbudded celler og parringspar under et mikroskop ved hjælp af et hæmocytometer26. Imidlertid bruger de fleste metoder, der rapporteres senere, auxotrofiske markører til at skelne haploider og diploider. Parringseffektivitet beregnes som procentdelen af diploide celler i forhold til antallet af diploide og haploide celler i den cellulære pulje 16,21,23.

På trods af en række rapporter, der bruger gær som modelorganisme til at studere speciering, er der imidlertid ingen standardiseret protokol rapporteret i litteraturen indtil nu til beregning af effektiviteten af parring. Celler i logfasen er muligvis ikke ideelle til kvantificering af parringseffektivitet. Under parring arresteres cellecyklussen for de to haploider, og cellerne under parring deler sig derfor ikke9. Da cellecyklussen også vides at være arresteret på samme måde i celler i den stationære fase27, kan brug af sådanne celler gøre protokollen mere reproducerbar. Stationære faseceller kan blandes og lægges på YPD-plader (dvs. et ernæringsrigt miljø) til parring. De konventionelle procedurer kræver også en nitrocellulosemembran og vask af cellerne, hvilket gør processen besværlig og udsat for håndteringsfejl. Derudover kvantificerer de hidtil anvendte protokoller parringseffektiviteten i form af en haploid. Ved måling af reproduktiv isolation kvantificeres parringseffektiviteten imidlertid for en bestemt kombination af haploider snarere end en enkelt haploide.

For at løse disse problemer rapporterer vi her en robust metode til kvantificering af parringseffektivitet i gær, der er meget reproducerbar og nem at bruge. Desuden kan denne metode og de gærstammer, der anvendes her, også bruges i undersøgelser, der undersøger effekten af genflow på udviklingen af parringsbarrierer.

To forskellige stammer af S. cerevisiae blev anvendt i denne undersøgelse. En af stammerne stammer fra SK1-baggrunden; dette blev ændret i vores laboratorium ved at tilføje de auxotrofiske markører nær MAT-locus. De resulterende genotyper af haploider er angivet i tabel 128,29,30. I SK1-stammen havde a-haploiden TRP1-genet indsat nær MAT-locus, og den α haploid havde LEU2-genet indsat nær MAT-locus. I ScAM-stammen blev TRP1- og URA3-generne indsat i henholdsvis a- og α-haploider. Placeringen af indsættelsen var i ARS-regionen af kromosom III (Chr III: 197378..197609). For den protokol, der er rapporteret her, ville auxotrofe markører overalt på genomet være tilstrækkelige. At have de auxotrofe markører nær MAT-locus betyder imidlertid, at disse stammer også kan bruges til undersøgelser, der undersøger effekten af genflow på speciering31,32. Markørerne blev tilføjet tæt på MAT-locus for at forhindre omrokering af markørerne på grund af rekombination. Derfor kan denne protokol bruges til at kvantificere parringseffektivitet i undersøgelser, der involverer speciering, og også til at identificere ændringen af parringseffektivitet, når man studerer proteinerne involveret i parringsvejen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A8626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Powder regular grade for bacteriology</td>
			<td>SRL</td>
			<td>19661 (0140186)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulphate, Hi-AR</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>GRM1273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri plates</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>PW008</td>
			<td>&#160;90 mm x 15 mm dimension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A8094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A7219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histidine monochloride monohydrate</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>H5659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>L8912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>62840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>M5308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>P5482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Threonine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tyrosine</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>T8566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>V0513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mating efficiency grid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 cm x 1.5 cm rectangular grid drawn on the Petri plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>500010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract Powder</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Nitrogen Base w/o Amino acids and Ammonium Sulphate</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>233520</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of the mating efficiency of haploids in saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae er en meget anvendt modelorganisme inden for genetik, evolution og molekylærbiologi. I de senere år er det også blevet en populær modelorganisme at studere problemer relateret til speciering. Gærens livscyklus involverer både aseksuelle og seksuelle reproduktive faser. Den lette udførelse af evolutionseksperimenter og organismens korte generationstid giver mulighed for undersøgelse af udviklingen af reproduktive barrierer. Den effektivitet, hvormed de to parringstyper (a og α) parrer sig for at danne a/α-diploide, kaldes parringseffektiviteten. Ethvert fald i parringseffektiviteten mellem haploider indikerer en præ-zygotisk barriere. For at kvantificere omfanget af reproduktiv isolation mellem to haploider kræves der således en robust metode til at kvantificere parringseffektiviteten. Til dette formål præsenteres en enkel og meget reproducerbar protokol her. Protokollen involverer fire hovedtrin, som inkluderer lapning af haploider på en YPD-plade, blanding af haploider i lige store mængder, fortynding og plettering for enkeltkolonier og endelig beregning af effektiviteten baseret på antallet af kolonier på en drop-out plade. Auxotrofiske markører anvendes til klart at skelne mellem haploider og diploider.

Kvantificering af parringseffektiviteten af de to parringstyper Protokollen beskrevet her blev brugt til at kvantificere parringseffektiviteten mellem to gærstammer - mellem SK1AM a og SK1AM α og mellem ScAMa og ScAMα (figur 3A). I disse eksperimenter blev parringen mellem de to haploider gentaget mindst 12 gange. I hver af gentagelserne af eksperimentet blev mindst 100 kolonier stribet på dobbelt dr...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Mating Efficiency of Haploids in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Determination of the Mating Efficiency of Haploids in Saccharomyces cerevisiae

I dette arbejde beskrives en robust metode til kvantificering af parringseffektivitet i gæren Saccharomyces cerevisiae . Denne metode er især nyttig til kvantificering af præzygotiske barrierer i specieringsundersøgelser.

Bestemmelse af haploider parringseffektivitet i Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae is a widely used model organism in genetics, evolution, and molecular biology. In recent years, it has also become a popular ...

Denne protokol er en simpel metode til at kvantificere effektiviteten, hvormed forskellige stammer og arter af gær parrer sig med hinanden. Den foreslåede metode er enkel, robust og effektiv. Metoden kan udvides til enhver gærstamme.Metoden beskrevet i denne undersøgelse kan bruges til at forstå, hvordan speciering forekommer i gær. Desuden kan de stammer, vi beskriver, være særligt nyttige til at designe eksperimenter med genflow. Metodens styrke er, at den er meget enkel.Nogle små justeringer som inkubationstidspunktet kan være nødvendige afhængigt af den anvendte stamme. Begynd at genoplive haploider A og Alpha fra frosne bestande ved at stribe gærinokulum på en gærekstrakt peptone dextrose eller YPD agarplade. Lad dem vokse i 48 timer ved 30 grader Celsius for at opnå enkeltkolonier.Efter inkubation podes enkeltkolonier fra YPD-pladen og fem ml YPD-medium og inkuberes ved 30 grader Celsius i 48 timer med 250 RPM omrystning. Cellerne er i den stationære vækstfase efter denne inkubationsperiode. På en frisk YPD-plade tegnes parringseffektivitetsgitter som et rektangel på 1 x 1,5 centimeter opdelt i tre kasser, hver med en dimension på 1 x 0,5 centimeter.Pod fem mikroliter af YPD-kulturen af de to parringstyper på rektanglerne længst til venstre og højre. Dette volumen svarer til ca. 5 gange 10 til de femte haploide celler i hver sektion. Inkuber pladerne i 24 timer ved 30 grader Celsius.For at blande et lige antal gærceller skal du fjerne ca. 1/3 af gærvæksten, der er udviklet i de ydre kasser ved hjælp af en steril tandstikker, og resuspendere de fjernede celler i 20 mikroliter vand i et sterilt 1,5 ml hætteglas. Følg dette for hver haploid. Fortynd derefter fem mikroliter af denne suspension i to ml vand og mål den optiske densitet ved hjælp af et spektrofotometer ved 600 nanometer.Baseret på den optiske densitetsværdi og antallet af celler pr. milliliter ved en optisk densitet tilsættes de nødvendige volumener af begge haploider i et frisk og sterilt hætteglas på 1,5 ml. Bland det godt ved hjælp af en pipette. Det endelige volumen af denne suspension er generelt omkring seks til otte mikroliter.Derefter inokuleres denne suspension i midtergitteret. Inkuber pladen ved 30 grader Celsius i syv timer, så haploiderne kan parre sig. Efter syv timers inkubation skrabes cellerne fra midterrektanglet ved hjælp af et tandstikker eller en pipettespids og fortyndes i to ml sterilt vand.Udfør yderligere fortyndinger, og spred derefter cellesuspensionen på YPD-agar for at opnå enkeltkolonier. Efter plettering inkuberes YPD-pladerne ved 30 grader Celsius i 36 til 48 timer for at udvikle enkeltkolonier. Sørg for, at der opnås et par hundrede individuelle kolonier fra hvert parringsforsøg til screening for at sikre dataenes statistiske signifikans.For at identificere de diploide kolonier på pladen overføres de enkelte kolonier ved at stribe dem individuelt på en dobbelt drop-out plade, der mangler de aminosyrer, som stammerne er auxotrofe for. Inkuber pladerne ved 30 grader Celsius i 48 timer og beregn parringseffektiviteten, nu. Protokollens robusthed muliggjorde let differentiering af parringseffektiviteten mellem de to stammer, SK1AM og ScAM.Mens SK1-stammerne parrede sig med en meget høj effektivitet, parrede ScAM-stammerne sig med en relativt lavere effektivitet. ScAM-stammernes parringseffektivitet faldt betydeligt, når miljøet ikke indeholdt glukose som primær kulstofkilde, hvilket indikerer, at parring er en energisk dyr proces, og vækst på alternative kulstofkilder reducerer effektiviteten af parring kvalitativt. Når man fik lov til at parre sig i forskellige tidsperioder, blev der ikke observeret parring i de første fire til fem timer.De første diploider optrådte først efter fire til fem timer, hvilket indikerer, at dette er den tid, der er nødvendig for parringsprocessen, der skal afsluttes i det givne miljø. Derefter steg parringseffektiviteten hurtigt. Ud over syv timer blev parringseffektivitetsberegninger påvirket af, at mitotisk vækst startede på pladen.Sørg for, at lige mange af begge haploider blandes. Afvigelser herfra ville føre til variationer i uafhængige gentagelser af protokollen. Hvordan genflow påvirker tilpasning og speciering er et åbent spørgsmål.Da de auxotrofiske markører indsættes ved siden af MAT-locus i vores stammer, hjælper dette med at løse dette vigtige spørgsmål.

Research

JoVE Journal

Biology

Determination of the Mating Efficiency of Haploids in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Ekspression og oprensning af cystisk fibrose-transmembrankonduktans-regulator protein i Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisering og analyse af mRNA molekyler under anvendelse Fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Koblede Analyser for Monitoring Proteingenfoldningstrin i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Oprensning af cystisk fibrose Ledningsevne regulator protein udtrykt i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

EPJ Overvåget Redox Titrering af cofaktorerne af<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Måling af mRNA henfaldskurver i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Brug<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Stammer

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...