Name: determination of the mating efficiency of haploids in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2022-12-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Mating Efficiency of Haploids in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door een DBT/Wellcome Trust (India Alliance) subsidie (IA/S/19/2/504632) aan S.S. P.N. is een Research Fellow ondersteund door een DBT/Wellcome Trust (India Alliance) beurs (IA/S/19/2/504632). AM wordt ondersteund door de Council of Scientific and Industrial Research (CSIR), Government of India, als Senior Research Fellow (09/087(0873)/2017-EMR-I). De auteurs bedanken Paike Jayadeva Bhat voor de discussies.

OPMERKING: Het protocol omvat in grote lijnen de volgende stappen: (1) het patchen van de haploïden in de paringsefficiëntieroosters op een YPD-plaat, (2) het mengen van de haploïden in gelijke aantallen na 24 uur incubatie en het geven van de gemengde haploïden een paar uur om te paren (7 uur in deze studie), (3) het plateren van de gemengde cellen op YPD voor het isoleren van enkele kolonies na 7 uur bij 30 °C, en ten slotte (4) het bepalen van het aantal diploïden gevormd met behulp van de auxotrofe markers. De...

<ol>
	<li>Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporulation+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).</li><li>Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+yeast+for+budding+geneticists:+A+primer+on+the+Saccharomyces+cerevisiae+model+system.">Budding yeast for budding geneticists: A primer on the Saccharomyces cerevisiae model system.</a> Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).</li><li>Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+cycle+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).</li><li>Erdman, S., Lin, L., Malczynski, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromone-regulated+genes+required+for+yeast+mating+differentiation.">Pheromone-regulated genes required for yeast mating differentiation.</a> Journal of Cell Biology. 140 (3), 461-483 (1998).</li><li>Merlini, L., Dudin, O., Martin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mate+and+fuse:+How+yeast+cells+do+it.">Mate and fuse: How yeast cells do it.</a> Open Biology. 3 (3), 130008 (2013).</li><li>Gustin, M. C., Albertyn, J., Alexander, M., Davenport, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAP+kinase+pathways+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">MAP kinase pathways in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1264-1300 (1998).</li><li>Bardwell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+walk-through+of+the+yeast+mating+pheromone+response+pathway.">A walk-through of the yeast mating pheromone response pathway.</a> Peptides. 26 (2), 339-350 (2005).</li><li>Reid, B. J., Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mating+in+the+cell+cycle+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Regulation of mating in the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Cell Biology. 75, 355-365 (1977).</li><li>Williams, T. C., Peng, B., Vickers, C. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Saccharomyces+cerevisiae+pheromone-response+is+a+metabolically+active+stationary+phase+for+bio-production.">The Saccharomyces cerevisiae pheromone-response is a metabolically active stationary phase for bio-production.</a> Metabolic Engineering Communications. 3, 142-152 (2016).</li><li>Bagnat, M., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+polarization+during+yeast+mating.">Cell surface polarization during yeast mating.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14183-14188 (2002).</li><li>Trueheart, J., Boeke, J. D., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+genes+required+for+cell+fusion+during+yeast+conjugation:+Evidence+for+a+pheromone-induced+surface+protein.">Two genes required for cell fusion during yeast conjugation: Evidence for a pheromone-induced surface protein.</a> Molecular and Cellular Biology. 7 (7), 2316-2328 (1987).</li><li>Sniegowski, P. D., Dombrowski, P. G., Fingerman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+and+Saccharomyces+paradoxus+coexist+in+a+natural+woodland+site+in+North+America+and+display+different+levels+of+reproductive+isolation+from+European+conspecifics.">Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus coexist in a natural woodland site in North America and display different levels of reproductive isolation from European conspecifics.</a> FEMS Yeast Research. 1 (4), 299-306 (2002).</li><li>Replansky, T., Koufopanou, V., Greig, D., Bell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+sensu+stricto+as+a+model+system+for+evolution+and+ecology.">Saccharomyces sensu stricto as a model system for evolution and ecology.</a> Trends in Ecology and Evolution. 23 (9), 494-501 (2008).</li><li>Greig, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+isolation+in+Saccharomyces.">Reproductive isolation in Saccharomyces.</a> Heredity. 102 (1), 39-44 (2009).</li><li>Mayr, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Systematics and the Origin of Species, from the Viewpoint of a Zoologist. , (1999).</li><li>Sprague, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+yeast+mating+reaction.">Assay of yeast mating reaction.</a> Methods in Enzymology. 194, 77-93 (1991).</li><li>McCaffrey, G., Clay, F. J., Kelsay, K., Sprague, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+regulation+of+a+gene+required+for+cell+fusion+during+mating+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Identification and regulation of a gene required for cell fusion during mating of the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 7 (8), 2680-2690 (1987).</li><li>Valtz, N., Peter, M., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAR1+is+required+for+oriented+polarization+of+yeast+cells+in+response+to+mating+pheromones.">FAR1 is required for oriented polarization of yeast cells in response to mating pheromones.</a> Journal of Cell Biology. 131 (4), 863-873 (1995).</li><li>Maclean, C. J., Greig, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prezygotic+reproductive+isolation+between+Saccharomyces+cerevisiae+and+Saccharomyces+paradoxus.">Prezygotic reproductive isolation between Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus.</a> BMC Evolutionary Biology. 8, 1 (2008).</li><li>Murphy, H. A., Kuehne, H. A., Francis, C. A., Sniegowski, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mate+choice+assays+and+mating+propensity+differences+in+natural+yeast+populations.">Mate choice assays and mating propensity differences in natural yeast populations.</a> Biology Letters. 2 (4), 553-556 (2006).</li><li>Leu, J. Y., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+evolution+of+mating+discrimination+in+budding+yeast.">Experimental evolution of mating discrimination in budding yeast.</a> Current Biology. 16 (3), 280-286 (2006).</li><li>Kim, J., Hirsch, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nucleolar+protein+that+affects+mating+efficiency+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+altering+the+morphological+response+to+pheromone.">A nucleolar protein that affects mating efficiency in Saccharomyces cerevisiae by altering the morphological response to pheromone.</a> Genetics. 149 (2), 795-805 (1998).</li><li>Jin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+dynamically+modify+their+environment+to+achieve+better+mating+efficiency.">Yeast dynamically modify their environment to achieve better mating efficiency.</a> Science Signaling. 4 (186), (2011).</li><li>Rogers, D. W., Denton, J. A., McConnell, E., Greig, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+evolution+of+species+recognition.">Experimental evolution of species recognition.</a> Current Biology. 25 (13), 1753-1758 (2015).</li><li>McClure, A. W., Jacobs, K. C., Zyla, T. R., Lew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+in+wild+yeast:+Delayed+interest+in+sex+after+spore+germination.">Mating in wild yeast: Delayed interest in sex after spore germination.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (26), 3119-3127 (2018).</li><li>Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+mating+in+yeast.">Synchronous mating in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (5), 1373-1377 (1973).</li><li>Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stationary+phase+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiology Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).</li><li>Johnston, S. A., Hopper, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+the+yeast+regulatory+gene+GAL4+and+analysis+of+its+dosage+effects+on+the+galactose/melibiose+regulon.">Isolation of the yeast regulatory gene GAL4 and analysis of its dosage effects on the galactose/melibiose regulon.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (22), 6971-6975 (1982).</li><li>Mahilkar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Study of metabolic specialization leading to speciation, using yeast as a model system. , (2021).</li><li>Blank, T. E., Woods, M. P., Lebo, C. M., Xin, P., Hopper, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Gal3+proteins+showing+altered+Gal80p+binding+cause+constitutive+transcription+of+Gal4p-activated+genes+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Novel Gal3 proteins showing altered Gal80p binding cause constitutive transcription of Gal4p-activated genes in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 17 (5), 2566-2575 (1997).</li><li>Rice, W. R., Hostert, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+experiments+on+speciation:+What+have+we+learned+in+40+years.">Laboratory experiments on speciation: What have we learned in 40 years.</a> Evolution. 47 (6), 1637-1653 (1993).</li><li>White, N. J., Snook, R. R., Eyres, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+past+and+future+of+experimental+speciation.">The past and future of experimental speciation.</a> Trends in Ecology and Evolution. 35 (1), 10-21 (2020).</li><li>Milo, R., Jorgensen, P., Moran, U., Weber, G., Springer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioNumbers--The+database+of+key+numbers+in+molecular+and+cell+biology.">BioNumbers--The database of key numbers in molecular and cell biology.</a> Nucleic Acids Research. 38, 750-753 (2010).</li><li>Domitrovic, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+study+of+YER067W,+a+new+protein+involved+in+yeast+metabolism+control+and+drug+resistance.">Structural and functional study of YER067W, a new protein involved in yeast metabolism control and drug resistance.</a> PLoS One. 5 (6), 11163 (2010).</li><li>Lindegren, C. C., Spiegelman, S., Lindegren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mendelian+inheritance+of+adaptive+enzymes.">Mendelian inheritance of adaptive enzymes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 30 (11), 346-352 (1944).</li><li>Dettman, J. R., Sirjusingh, C., Kohn, L. M., Anderson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incipient+speciation+by+divergent+adaptation+and+antagonistic+epistasis+in+yeast.">Incipient speciation by divergent adaptation and antagonistic epistasis in yeast.</a> Nature. 447 (7144), 585-588 (2007).</li><li>Jhuang, H. Y., Lee, H. Y., Leu, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial-nuclear+co-evolution+leads+to+hybrid+incompatibility+through+pentatricopeptide+repeat+proteins.">Mitochondrial-nuclear co-evolution leads to hybrid incompatibility through pentatricopeptide repeat proteins.</a> EMBO Reports. 18 (1), 87-101 (2017).</li><li>Lee, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incompatibility+of+nuclear+and+mitochondrial+genomes+causes+hybrid+sterility+between+two+yeast+species.">Incompatibility of nuclear and mitochondrial genomes causes hybrid sterility between two yeast species.</a> Cell. 135 (6), 1065-1073 (2008).</li><li>Pronk, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxotrophic+yeast+strains+in+fundamental+and+applied+research.">Auxotrophic yeast strains in fundamental and applied research.</a> Applied and Environmental Microbiology. 68 (5), 2095-2100 (2002).</li><li>Madhani, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> From a to &#945;: Yeast as a Model for Cellular Differentiation. , (2007).</li><li>Huxley, C., Green, E. D., Dunham, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+assessment+of+S.+cerevisiae+mating+type+by+PCR.">Rapid assessment of S. cerevisiae mating type by PCR.</a> Trends in Genetics. 6 (8), 236 (1990).</li><li>Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+cost+of+the+green+fluorescent+protein+in+gastrointestinal+bacteria.">Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria.</a> Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).</li><li>Tusso, S., Nieuwenhuis, B. P. S., Weissensteiner, B., Immler, S., Wolf, J. B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+evolution+of+adaptive+divergence+under+varying+degrees+of+gene+flow.">Experimental evolution of adaptive divergence under varying degrees of gene flow.</a> Nature Ecology and Evolution. 5 (3), 338-349 (2021).</li></ol>

De kwantificering van de paringsefficiëntie in S. cerevisiae is essentieel voor het uitvoeren van studies met betrekking tot de genen die betrokken zijn bij paringsroutes of het bestuderen van de invloed van de externe omgeving op paringsgedrag. In de afgelopen twee decennia is S. cerevisiae ook een populair model geworden om vragen met betrekking tot soortvorming 14,36,37,38 te beantwoorden.<sup cl...

Saccharomyces cerevisiae, gewoonlijk ontluikende gist genoemd, is een eencellige eukaryoot. Het heeft twee paringstypen, een en α, en vertoont zowel aseksuele als seksuele voortplantingscycli. De a- en α-paringstypen zijn haploïden en kunnen mitoïde delen in afwezigheid van het andere paringstype in de omgeving, dat de aseksuele cyclus van gist vertegenwoordigt. Wanneer de twee paringstypen dicht bij elkaar zijn, stoppen ze mitotisch met delen en fuseren ze tot een diploïde cel. De diploïde gist kan zich mitotisch delen wanneer voedingsstoffen aanwezig zijn of meiose ondergaan onder de omstandigheden van stikstofgebrek in de aanwezigheid van een slechte koolstofbron die niet-fermenteerbaar is, zoals acetaat1. Dit resulteert in de vorming van sporen, die slapend blijven totdat er gunstige groeiomstandigheden zijn. De levenscyclus is voltooid wanneer deze sporen ontkiemen en de twee haploïde typen weer worden vrijgegeven aan de haploïde pool 2,3 (figuur 1).

De paring van gistcellen omvat verschillende stappen, zoals agglutinatie, de vorming van een paringsprojectie of "shmoo", gevolgd door cel- en kernfusie 4,5. De twee paringstypen a en α produceren respectievelijk a-factor en α-factor om de paring te initiëren. Deze factoren zijn polypeptideferomonen die binden aan de receptoren (Ste2 en Ste3) die aanwezig zijn op het celoppervlak van het tegenovergestelde paringstype5. De binding van de feromonen aan de receptoren initieert de feromoonresponsroute, de mitogeen-geactiveerde proteïnekinase (MAPK) signaaltransductieroute 6,7,8. Dit resulteert in het stoppen van de celcyclus in de G1-fase, wat leidt tot een metabolisch actieve stationaire fase9. De cellen stoppen dan met mitotisch delen en de eiwitten die nodig zijn voor de paring worden gesynthetiseerd. Omdat de haploïde cellen niet naar elkaar toe kunnen bewegen, wordt een paringsprojectie of "shmoo" gericht op de paringspartner. Wanneer de cellen in contact komen, wordt de celwand afgebroken en fuseert de cytoplasmatische inhoud, wat resulteert in paring om een diploïde cel te vormen10,11. De paringsefficiëntie tussen haploïden is gebruikt als een maat voor soortvorming in laboratorium-geëvolueerde stammen, evenals tussen bestaande soorten12.

Omdat het een eenvoudig eukaryoot organisme is, is gist het model bij uitstek voor een groot aantal onderzoeksvragen die verband houden met complexe eukaryote organismen. Een dergelijke vraag houdt verband met soortvorming en de evolutie van voortplantingsbarrières13,14. Voor seksueel reproducerende organismen wordt een soort gedefinieerd door het biologische soortconcept (BSC) voorgesteld door Ernst Mayr15. Volgens dit concept wordt gezegd dat twee individuen van een populatie tot twee verschillende soorten behoren als ze niet kunnen kruisen en reproductief geïsoleerd zijn. Afbraak van de seksuele voortplantingscyclus (die de fusie van gameten omvat om een zygote te vormen, de ontwikkeling van de zygote tot een nageslacht en het bereiken van seksuele volwassenheid in het nageslacht) leidt tot reproductieve isolatie. Zoals te zien is in figuur 1, is de levenscyclus van S. cerevisiae vergelijkbaar met de seksuele voortplantingscyclus: a) de fusie van de twee paringstypen a en α is vergelijkbaar met de fusie van gameten in seksueel reproducerende organismen; b) het vermogen van de diploïde om mitotische deling te ondergaan is gelijk aan de zygote die zich ontwikkelt tot nakomelingen; en c) de diploïde die sporulatie ondergaat is vergelijkbaar met het proces van gametogenese14.

Pre-zygote isolatie treedt op wanneer assortatieve paring wordt waargenomen. Gegeven een gelijke kans om te paren met twee genetisch verschillende a-types , paart een α type bij voorkeur met de ene boven de andere of omgekeerd14. In het geval van evolutie-experimenten waarbij haploïden in verschillende omgevingen zijn geëvolueerd, kan de aanwezigheid van een pre-paringsbarrière worden bepaald door een paringstest uit te voeren. Een afname van de paringsefficiëntie in vergelijking met de voorouder duidt op de evolutie van een pre-paringsbarrière. Post-zygote isolatie kan ontstaan als gevolg van het onvermogen van de diploïde om effectieve mitotische deling en/of sporulatie te ondergaan om haploïde sporen te vormen14. Deze kunnen worden gekwantificeerd door respectievelijk de groeisnelheid van de diploïden te meten en de sporulatie-efficiëntie te berekenen. Om de evolutie van voortplantingsbarrières te bestuderen, zijn daarom robuuste methoden nodig voor het kwantificeren van (a) de paringsefficiëntie, (b) de mitotische groei van de diploïde en (c) de sporulatie-efficiëntie van de diploïde. In dit werk wordt een robuuste methode gerapporteerd om de paringsefficiëntie van giststammen te kwantificeren.

In laboratoriumexperimenten is een van de manieren waarop het optreden van paring kan worden gedetecteerd, door auxotrofe markers te gebruiken die de voedingsbehoeften aanvullen. Wanneer de twee paringstypen auxotroof zijn voor twee verschillende aminozuren, kan alleen de diploïde cel gevormd door de fusie van de twee paringstypen groeien op een medium met een tekort aan beide aminozuren. Aujobtrofe markers zijn dus nuttig voor het detecteren van paring, zowel kwalitatief als kwantitatief. Een kwalitatieve test volstaat om het paringstype van een stam na meiosete identificeren 16. Kwantitatieve tests zijn essentieel wanneer men geïnteresseerd is in het identificeren van een vermindering van de paring tijdens het bestuderen van de genen die betrokken zijn bij de paringsroute17,18. Bovendien, met gist die steeds vaker wordt gebruikt in soortvormingsstudies, is een handige en reproduceerbare paringstest noodzakelijk, omdat de kwantificering van de paringsefficiëntie een maat is voor de pre-zygote barrière.

De paringsefficiëntie tussen de twee gistparingstypen is eerder gekwantificeerd16,19,20. De meeste van de eerder gebruikte methoden zijn vergelijkbaar in hun ontwerp met een paar variaties 16,21,22,23,24,25. Sommigen van hen gebruiken vroege logfaseculturen, terwijl een paar anderen mid-logfaseculturen van haploïde stammen gebruiken. Er zijn variaties in de verhoudingen waarin de twee paringstypen worden gemengd. Bijna alle protocollen gebruiken een nitrocellulosemembraan. Suspensies van beide paringstypen uit eerder gekweekte culturen worden gemengd en gefilterd op een nitrocellulosemembraan dat op een YPD-plaat wordt geplaatst. In een van de varianten van het protocol wordt de haploïde suspensie direct gepatcht op een YPD-plaat21. In experimenten die zich bezighouden met de genen die betrokken zijn bij de feromoonproductie van de twee paringstypen, worden de feromonen extern toegevoegd terwijl de suspensies van de twee paringstypen24 worden gemaakt.

Na incubatie gedurende een paar uur (meestal ongeveer 5 uur) na het mengen van de haploïden, worden de cellen van het membraan afgewassen, verdund en verguld op selectieve media. In een van de eerdere methoden die in 1973 werden gerapporteerd, werd de efficiëntie van zygotevorming of paring berekend door het aantal budded cells, unbudded cells en paringsparen onder een microscoop te tellen met behulp van een hemocytometer26. De meeste later gerapporteerde methoden gebruiken echter auxotrofe markers om haploïden en diploïden te onderscheiden. Paringsefficiëntie wordt berekend als het percentage diploïde cellen ten opzichte van het aantal diploïde en haploïde cellen in de cellulaire pool 16,21,23.

Ondanks een aantal rapporten die gist als modelorganisme gebruiken om soortvorming te bestuderen, is er tot nu toe geen gestandaardiseerd protocol in de literatuur gerapporteerd voor het berekenen van de efficiëntie van paring. Cellen in de logfase zijn mogelijk niet ideaal voor de kwantificering van de paringsefficiëntie. Tijdens de paring wordt de celcyclus van de twee haploïden gestopt en daarom delen de cellen tijdens de paring niet9. Omdat ook bekend is dat de celcyclus op dezelfde manier wordt gestopt in cellen in de stationaire fase27, kan het gebruik van dergelijke cellen het protocol reproduceerbaarder maken. Stationaire fasecellen kunnen worden gemengd en op YPD-platen (d.w.z. een voedingsrijke omgeving) worden gelegd om te paren. De conventionele procedures vereisen ook een nitrocellulosemembraan en het afwassen van de cellen, waardoor het proces omslachtig is en vatbaar voor verwerkingsfouten. Bovendien kwantificeren de protocollen die tot nu toe zijn gebruikt de paringsefficiëntie in termen van één haploïde. Bij het meten van reproductieve isolatie wordt de paringsefficiëntie echter gekwantificeerd voor een bepaalde combinatie van haploïden in plaats van een enkele haploïde.

Om deze problemen aan te pakken, rapporteren we hier een robuuste methode voor de kwantificering van de paringsefficiëntie in gist die zeer reproduceerbaar en gemakkelijk te gebruiken is. Bovendien kunnen deze methode en de giststammen die hier worden gebruikt ook worden gebruikt in studies die het effect van genstroom op de evolutie van paringsbarrières onderzoeken.

In deze studie werden twee verschillende stammen van S. cerevisiae gebruikt. Een van de stammen is afgeleid van de SK1-achtergrond; dit werd in ons laboratorium aangepast door toevoeging van de auxotrofe markers in de buurt van de MAT-locus. De resulterende genotypen van de haploïden zijn weergegeven in tabel 128,29,30. In de SK1-stam had de a haploïde het TRP1-gen ingebracht in de buurt van de MAT-locus en de α haploïde had het LEU2-gen ingebracht in de buurt van de MAT-locus. In de ScAM-stam werden de TRP1- en URA3-genen ingebracht in respectievelijk de a- en α haploïden. De plaats van insertie was in het ARS-gebied van chromosoom III (Chr III: 197378..197609). Voor het hier gerapporteerde protocol zouden auxotrofe markers overal op het genoom voldoende zijn. Het hebben van de auxotrofe markers in de buurt van de MAT-locus betekent echter dat deze stammen ook kunnen worden gebruikt voor studies die het effect van genstroom op soortvorming31,32 onderzoeken. De markers werden dicht bij de MAT-locus toegevoegd om te voorkomen dat de markers opnieuw worden geherschikt als gevolg van recombinatie. Daarom kan dit protocol worden gebruikt om de paringsefficiëntie te kwantificeren in studies met soortvorming en ook om de verandering van paringsefficiëntie te identificeren bij het bestuderen van de eiwitten die betrokken zijn bij de paringsroute.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A8626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Powder regular grade for bacteriology</td>
			<td>SRL</td>
			<td>19661 (0140186)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulphate, Hi-AR</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>GRM1273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri plates</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>PW008</td>
			<td>&#160;90 mm x 15 mm dimension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A8094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A7219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histidine monochloride monohydrate</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>H5659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>L8912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>62840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>M5308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>P5482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Threonine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tyrosine</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>T8566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>V0513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mating efficiency grid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 cm x 1.5 cm rectangular grid drawn on the Petri plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>500010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract Powder</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Nitrogen Base w/o Amino acids and Ammonium Sulphate</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>233520</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of the mating efficiency of haploids in saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae is een veelgebruikt modelorganisme in de genetica, evolutie en moleculaire biologie. In de afgelopen jaren is het ook een populair modelorganisme geworden om problemen met betrekking tot soortvorming te bestuderen. De levenscyclus van gist omvat zowel aseksuele als seksuele voortplantingsfasen. Het gemak van het uitvoeren van evolutie-experimenten en de korte generatietijd van het organisme maken de studie van de evolutie van voortplantingsbarrières mogelijk. De efficiëntie waarmee de twee paringstypen (a en α) paren om de a/α diploïde te vormen, wordt de paringsefficiëntie genoemd. Elke afname van de paringsefficiëntie tussen haploïden duidt op een pre-zygote barrière. Om de mate van reproductieve isolatie tussen twee haploïden te kwantificeren, is dus een robuuste methode nodig om de paringsefficiëntie te kwantificeren. Hiertoe wordt hier een eenvoudig en zeer reproduceerbaar protocol gepresenteerd. Het protocol omvat vier hoofdstappen, waaronder het patchen van de haploïden op een YPD-plaat, het mengen van de haploïden in gelijke aantallen, verdunnen en plateren voor afzonderlijke kolonies en ten slotte het berekenen van de efficiëntie op basis van het aantal kolonies op een drop-out plaat. Auxotrofe markers worden gebruikt om duidelijk het onderscheid te maken tussen haploïden en diploïden.

Kwantificering van de paringsefficiëntie van de twee paringstypen Het hier beschreven protocol werd gebruikt om de paringsefficiëntie tussen twee giststammen te kwantificeren - tussen SK1AM a en SK1AM α en tussen ScAMa en ScAMα (figuur 3A). In deze experimenten werd de paring tussen de twee haploïden minstens 12 keer herhaald. In elk van de herhalingen van het experiment werden minstens 100 kolonies...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Mating Efficiency of Haploids in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Determination of the Mating Efficiency of Haploids in Saccharomyces cerevisiae

In dit werk wordt een robuuste methode beschreven voor de kwantificering van de paringsefficiëntie in de gist Saccharomyces cerevisiae . Deze methode is met name nuttig voor de kwantificering van pre-zygote barrières in soortvormingsstudies.

Bepaling van de paringsefficiëntie van haploïden in Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae is a widely used model organism in genetics, evolution, and molecular biology. In recent years, it has also become a popular ...

Dit protocol is een eenvoudige methode om de efficiëntie te kwantificeren waarmee verschillende stammen en gistsoorten met elkaar paren. De voorgestelde methode is eenvoudig, robuust en efficiënt. De methode kan worden uitgebreid tot elke giststam.De methode die in deze studie wordt beschreven, kan worden gebruikt om te begrijpen hoe soortvorming optreedt in gist. Bovendien kunnen de stammen die we beschrijven bijzonder nuttig zijn om experimenten met genstroom te ontwerpen. De kracht van de methode is dat het heel eenvoudig is.Enkele kleine aanpassingen zoals de incubatietijd kunnen nodig zijn, afhankelijk van de specifieke stam die wordt gebruikt. Begin met het doen herleven van de haploïden A en Alpha uit bevroren voorraden door het gistentmateriaal op een gistextract pepton dextrose of YPD-agarplaat te strepen. Laat ze 48 uur groeien bij 30 graden Celsius om enkele kolonies te verkrijgen.Na incubatie, ent enkele kolonies van de YPD-plaat en vijf milliliter YPD-medium en incubeer bij 30 graden Celsius gedurende 48 uur met 250 RPM schudden. De cellen bevinden zich na deze incubatietijd in de stationaire groeifase. Teken op een verse YPD-plaat paringsefficiëntieraster als een rechthoek van 1 bij 1,5 centimeter, verdeeld in drie vakken, elk met een afmeting van 1 bij 0,5 centimeter.Ent vijf microliter van de YPD-cultuur van de twee paringstypen op de meest linkse en meest rechtse rechthoeken. Dit volume komt overeen met ongeveer 5 maal 10 tot de vijfde haploïde cellen in elke sectie. Incubeer de platen gedurende 24 uur bij 30 graden Celsius.Om een gelijk aantal gistcellen te mengen, verwijdert u ongeveer 1/3 van de gistgroei die in de buitenste dozen is ontwikkeld met behulp van een steriele tandenstoker en resuspenseert u de verwijderde cellen in 20 microliter water in een steriele injectieflacon van 1,5 milliliter. Volg dit voor elke haploïde. Verdun vervolgens vijf microliter van deze suspensie in twee milliliter water en meet de optische dichtheid met behulp van een spectrofotometer op 600 nanometer.Voeg op basis van de optische dichtheidswaarde en het aantal cellen per milliliter bij één optische dichtheid de vereiste volumes van beide haploïden toe in een verse en steriele injectieflacon van 1,5 milliliter. Meng het goed met een pipet. Het uiteindelijke volume van deze suspensie is over het algemeen ongeveer zes tot acht microliter.Ent vervolgens deze ophanging in het middenrooster. Incubeer de plaat zeven uur lang bij 30 graden Celsius, zodat de haploïden kunnen paren. Schraap na zeven uur incubatie de cellen uit de middelste rechthoek met behulp van een tandenstoker of een pipetpunt en verdun in twee milliliter steriel water.Voer verdere verdunningen uit en verspreid vervolgens de celsuspensie op YPD-agar om enkele kolonies te verkrijgen. Na het plateren incuberen van de YPD-platen bij 30 graden Celsius gedurende 36 tot 48 uur om enkele kolonies te ontwikkelen. Zorg ervoor dat uit elk paringsexperiment een paar honderd individuele kolonies worden verkregen voor screening om de statistische significantie van de gegevens te garanderen.Om de diploïde kolonies op de plaat te identificeren, brengt u de enkele kolonies over door ze afzonderlijk op een dubbele uitvalplaat te strijken, zonder de aminozuren waarvoor de stammen auxotroof zijn. Incubeer de platen bij 30 graden Celsius gedurende 48 uur en bereken de paringsefficiëntie, nu. De robuustheid van het protocol maakte een eenvoudige differentiatie van de paringsefficiëntie tussen de twee stammen, SK1AM en ScAM, mogelijk.Terwijl de SK1-stammen gepaard gingen met een zeer hoog rendement, paren de ScAM-stammen met een relatief lagere efficiëntie. De paringsefficiëntie van de ScAM-stammen daalde aanzienlijk wanneer de omgeving geen glucose als primaire koolstofbron bevatte, wat aangeeft dat paring een energetisch duur proces is en groei op alternatieve koolstofbronnen de efficiëntie van paring kwalitatief vermindert. Wanneer het werd toegestaan om gedurende verschillende tijdsperioden te paren, werd de eerste vier tot vijf uur geen paring waargenomen.De eerste diploïden verschenen pas na vier tot vijf uur, wat aangeeft dat dit de tijd is die nodig is om het paringsproces in de gegeven omgeving te voltooien. Daarna nam de paringsefficiëntie snel toe. Na zeven uur werden de berekeningen van de paringsefficiëntie beïnvloed door het feit dat de mitotische groei op de plaat begon.Zorg ervoor dat een gelijk aantal van beide haploïden gemengd zijn. Afwijkingen hiervan zouden leiden tot variaties in onafhankelijke herhalingen van het protocol. Hoe genstroom aanpassing en soortvorming beïnvloedt, is een open vraag.Omdat de auxotrofe markers naast de MAT-locus in onze stammen worden geplaatst, helpt dit deze belangrijke vraag aan te pakken.

Research

JoVE Journal

Biology

Determination of the Mating Efficiency of Haploids in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Dissectie van Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Kwantitatieve Phosphoproteomics in Fatty Acid Gestimuleerd Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray analyse voor Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Een fluorescentie microscopie Assay voor de bewaking Mitophagy in de Gist Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expressie en zuivering van de Cystic Fibrosis transmembrane conductance regulator Eiwit in Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisatie en analyse van mRNA moleculen met behulp van fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Gekoppeld Testen voor Monitoring Protein Refolding in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Zuivering van het Cystic Fibrosis transmembrane conductance regulator eiwit dat tot expressie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

EPR Bewaakte redoxtitratie van de Cofactoren van<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Meting van mRNA Decay tarieven in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Het gebruik van<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Stammen

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...