Name: determination of the mating efficiency of haploids in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2022-12-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Mating Efficiency of Haploids in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av et DBT / Wellcome Trust (India Alliance) tilskudd (IA / S / 19/2 / 504632) til SS PN er en forsker støttet av et DBT / Wellcome Trust (India Alliance) stipend (IA / S / 19/2 / 504632). AM støttes av Council of Scientific and Industrial Research (CSIR), Indias regjering, som seniorforsker (09/087 (0873) / 2017-EMR-I). Forfatterne takker Paike Jayadeva Bhat for diskusjoner.

MERK: Protokollen innebærer i stor grad følgende trinn: (1) patching av haploidene i parringseffektivitetsgitterene på en YPD-plate, (2) blanding av haploidene i like mange etter 24 timers inkubasjon og gi de blandede haploidene noen timer til å parre seg (7 timer i denne studien), (3) plating av blandede celler på YPD for isolering av enkeltkolonier etter 7 timer ved 30 ° C, og til slutt, (4) bestemme antall diploider dannet ved hjelp av de auxotrofiske markørene. Disse trinnene er diskutert i detalj nedenfor (s...

<ol>
	<li>Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporulation+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).</li><li>Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+yeast+for+budding+geneticists:+A+primer+on+the+Saccharomyces+cerevisiae+model+system.">Budding yeast for budding geneticists: A primer on the Saccharomyces cerevisiae model system.</a> Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).</li><li>Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+cycle+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).</li><li>Erdman, S., Lin, L., Malczynski, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromone-regulated+genes+required+for+yeast+mating+differentiation.">Pheromone-regulated genes required for yeast mating differentiation.</a> Journal of Cell Biology. 140 (3), 461-483 (1998).</li><li>Merlini, L., Dudin, O., Martin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mate+and+fuse:+How+yeast+cells+do+it.">Mate and fuse: How yeast cells do it.</a> Open Biology. 3 (3), 130008 (2013).</li><li>Gustin, M. C., Albertyn, J., Alexander, M., Davenport, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAP+kinase+pathways+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">MAP kinase pathways in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1264-1300 (1998).</li><li>Bardwell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+walk-through+of+the+yeast+mating+pheromone+response+pathway.">A walk-through of the yeast mating pheromone response pathway.</a> Peptides. 26 (2), 339-350 (2005).</li><li>Reid, B. J., Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mating+in+the+cell+cycle+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Regulation of mating in the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Cell Biology. 75, 355-365 (1977).</li><li>Williams, T. C., Peng, B., Vickers, C. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Saccharomyces+cerevisiae+pheromone-response+is+a+metabolically+active+stationary+phase+for+bio-production.">The Saccharomyces cerevisiae pheromone-response is a metabolically active stationary phase for bio-production.</a> Metabolic Engineering Communications. 3, 142-152 (2016).</li><li>Bagnat, M., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+polarization+during+yeast+mating.">Cell surface polarization during yeast mating.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14183-14188 (2002).</li><li>Trueheart, J., Boeke, J. D., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+genes+required+for+cell+fusion+during+yeast+conjugation:+Evidence+for+a+pheromone-induced+surface+protein.">Two genes required for cell fusion during yeast conjugation: Evidence for a pheromone-induced surface protein.</a> Molecular and Cellular Biology. 7 (7), 2316-2328 (1987).</li><li>Sniegowski, P. D., Dombrowski, P. G., Fingerman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+and+Saccharomyces+paradoxus+coexist+in+a+natural+woodland+site+in+North+America+and+display+different+levels+of+reproductive+isolation+from+European+conspecifics.">Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus coexist in a natural woodland site in North America and display different levels of reproductive isolation from European conspecifics.</a> FEMS Yeast Research. 1 (4), 299-306 (2002).</li><li>Replansky, T., Koufopanou, V., Greig, D., Bell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+sensu+stricto+as+a+model+system+for+evolution+and+ecology.">Saccharomyces sensu stricto as a model system for evolution and ecology.</a> Trends in Ecology and Evolution. 23 (9), 494-501 (2008).</li><li>Greig, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+isolation+in+Saccharomyces.">Reproductive isolation in Saccharomyces.</a> Heredity. 102 (1), 39-44 (2009).</li><li>Mayr, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Systematics and the Origin of Species, from the Viewpoint of a Zoologist. , (1999).</li><li>Sprague, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+yeast+mating+reaction.">Assay of yeast mating reaction.</a> Methods in Enzymology. 194, 77-93 (1991).</li><li>McCaffrey, G., Clay, F. J., Kelsay, K., Sprague, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+regulation+of+a+gene+required+for+cell+fusion+during+mating+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Identification and regulation of a gene required for cell fusion during mating of the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 7 (8), 2680-2690 (1987).</li><li>Valtz, N., Peter, M., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAR1+is+required+for+oriented+polarization+of+yeast+cells+in+response+to+mating+pheromones.">FAR1 is required for oriented polarization of yeast cells in response to mating pheromones.</a> Journal of Cell Biology. 131 (4), 863-873 (1995).</li><li>Maclean, C. J., Greig, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prezygotic+reproductive+isolation+between+Saccharomyces+cerevisiae+and+Saccharomyces+paradoxus.">Prezygotic reproductive isolation between Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus.</a> BMC Evolutionary Biology. 8, 1 (2008).</li><li>Murphy, H. A., Kuehne, H. A., Francis, C. A., Sniegowski, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mate+choice+assays+and+mating+propensity+differences+in+natural+yeast+populations.">Mate choice assays and mating propensity differences in natural yeast populations.</a> Biology Letters. 2 (4), 553-556 (2006).</li><li>Leu, J. Y., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+evolution+of+mating+discrimination+in+budding+yeast.">Experimental evolution of mating discrimination in budding yeast.</a> Current Biology. 16 (3), 280-286 (2006).</li><li>Kim, J., Hirsch, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nucleolar+protein+that+affects+mating+efficiency+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+altering+the+morphological+response+to+pheromone.">A nucleolar protein that affects mating efficiency in Saccharomyces cerevisiae by altering the morphological response to pheromone.</a> Genetics. 149 (2), 795-805 (1998).</li><li>Jin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+dynamically+modify+their+environment+to+achieve+better+mating+efficiency.">Yeast dynamically modify their environment to achieve better mating efficiency.</a> Science Signaling. 4 (186), (2011).</li><li>Rogers, D. W., Denton, J. A., McConnell, E., Greig, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+evolution+of+species+recognition.">Experimental evolution of species recognition.</a> Current Biology. 25 (13), 1753-1758 (2015).</li><li>McClure, A. W., Jacobs, K. C., Zyla, T. R., Lew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+in+wild+yeast:+Delayed+interest+in+sex+after+spore+germination.">Mating in wild yeast: Delayed interest in sex after spore germination.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (26), 3119-3127 (2018).</li><li>Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+mating+in+yeast.">Synchronous mating in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (5), 1373-1377 (1973).</li><li>Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stationary+phase+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiology Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).</li><li>Johnston, S. A., Hopper, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+the+yeast+regulatory+gene+GAL4+and+analysis+of+its+dosage+effects+on+the+galactose/melibiose+regulon.">Isolation of the yeast regulatory gene GAL4 and analysis of its dosage effects on the galactose/melibiose regulon.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (22), 6971-6975 (1982).</li><li>Mahilkar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Study of metabolic specialization leading to speciation, using yeast as a model system. , (2021).</li><li>Blank, T. E., Woods, M. P., Lebo, C. M., Xin, P., Hopper, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Gal3+proteins+showing+altered+Gal80p+binding+cause+constitutive+transcription+of+Gal4p-activated+genes+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Novel Gal3 proteins showing altered Gal80p binding cause constitutive transcription of Gal4p-activated genes in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 17 (5), 2566-2575 (1997).</li><li>Rice, W. R., Hostert, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+experiments+on+speciation:+What+have+we+learned+in+40+years.">Laboratory experiments on speciation: What have we learned in 40 years.</a> Evolution. 47 (6), 1637-1653 (1993).</li><li>White, N. J., Snook, R. R., Eyres, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+past+and+future+of+experimental+speciation.">The past and future of experimental speciation.</a> Trends in Ecology and Evolution. 35 (1), 10-21 (2020).</li><li>Milo, R., Jorgensen, P., Moran, U., Weber, G., Springer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioNumbers--The+database+of+key+numbers+in+molecular+and+cell+biology.">BioNumbers--The database of key numbers in molecular and cell biology.</a> Nucleic Acids Research. 38, 750-753 (2010).</li><li>Domitrovic, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+study+of+YER067W,+a+new+protein+involved+in+yeast+metabolism+control+and+drug+resistance.">Structural and functional study of YER067W, a new protein involved in yeast metabolism control and drug resistance.</a> PLoS One. 5 (6), 11163 (2010).</li><li>Lindegren, C. C., Spiegelman, S., Lindegren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mendelian+inheritance+of+adaptive+enzymes.">Mendelian inheritance of adaptive enzymes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 30 (11), 346-352 (1944).</li><li>Dettman, J. R., Sirjusingh, C., Kohn, L. M., Anderson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incipient+speciation+by+divergent+adaptation+and+antagonistic+epistasis+in+yeast.">Incipient speciation by divergent adaptation and antagonistic epistasis in yeast.</a> Nature. 447 (7144), 585-588 (2007).</li><li>Jhuang, H. Y., Lee, H. Y., Leu, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial-nuclear+co-evolution+leads+to+hybrid+incompatibility+through+pentatricopeptide+repeat+proteins.">Mitochondrial-nuclear co-evolution leads to hybrid incompatibility through pentatricopeptide repeat proteins.</a> EMBO Reports. 18 (1), 87-101 (2017).</li><li>Lee, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incompatibility+of+nuclear+and+mitochondrial+genomes+causes+hybrid+sterility+between+two+yeast+species.">Incompatibility of nuclear and mitochondrial genomes causes hybrid sterility between two yeast species.</a> Cell. 135 (6), 1065-1073 (2008).</li><li>Pronk, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxotrophic+yeast+strains+in+fundamental+and+applied+research.">Auxotrophic yeast strains in fundamental and applied research.</a> Applied and Environmental Microbiology. 68 (5), 2095-2100 (2002).</li><li>Madhani, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> From a to &#945;: Yeast as a Model for Cellular Differentiation. , (2007).</li><li>Huxley, C., Green, E. D., Dunham, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+assessment+of+S.+cerevisiae+mating+type+by+PCR.">Rapid assessment of S. cerevisiae mating type by PCR.</a> Trends in Genetics. 6 (8), 236 (1990).</li><li>Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+cost+of+the+green+fluorescent+protein+in+gastrointestinal+bacteria.">Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria.</a> Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).</li><li>Tusso, S., Nieuwenhuis, B. P. S., Weissensteiner, B., Immler, S., Wolf, J. B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+evolution+of+adaptive+divergence+under+varying+degrees+of+gene+flow.">Experimental evolution of adaptive divergence under varying degrees of gene flow.</a> Nature Ecology and Evolution. 5 (3), 338-349 (2021).</li></ol>

Kvantifiseringen av parringseffektiviteten i S. cerevisiae er avgjørende for å utføre studier relatert til gener som er involvert i parringsveier eller studere påvirkning av det ytre miljø på parringsadferd. I løpet av de siste to tiårene har S. cerevisiae også blitt en populær modell for å ta opp spørsmål knyttet til artsdannelse 14,36,37,38. Tilstedeværelsen av...

Saccharomyces cerevisiae, ofte kalt spirende gjær, er en encellet eukaryote. Den har to parringstyper, a og α, og viser både aseksuelle og seksuelle reproduktive sykluser. A- og α-parringstypene er haploider og kan dele seg mitotisk i fravær av den andre parringstypen i omgivelsene, som representerer gjærens aseksuelle syklus. Når de to parringstypene er i umiddelbar nærhet, slutter de å dele seg mitotisk og smelter sammen for å danne en diploid celle. Den diploide gjæren kan enten dele seg mitotisk når næringsstoffer er til stede eller gjennomgå meiose under betingelsene for nitrogen sult i nærvær av en dårlig karbonkilde som ikke er gjærbar, slik som acetat1. Dette resulterer i dannelse av sporer, som forblir sovende til det er gunstige vekstforhold. Livssyklusen fullføres når disse sporene spirer og de to haploide typene slippes tilbake til det haploide bassenget 2,3 (figur 1).

Parring av gjærceller inkluderer flere trinn, for eksempel agglutinering, dannelsen av en parringsprojeksjon eller "shmoo", etterfulgt av celle- og kjernefysisk fusjon 4,5. De to parringstypene a og α produserer henholdsvis a-faktor og α-faktor for å initiere parring. Disse faktorene er polypeptidferomoner som binder seg til reseptorene (Ste2 og Ste3) som er tilstede på celleoverflaten av motsatt parringstype5. Bindingen av feromonene til reseptorene initierer feromonresponsveien, mitogenaktivert proteinkinase (MAPK) signaltransduksjonsvei 6,7,8. Dette resulterer i arrestasjon av cellesyklusen i G1-fasen, noe som fører til en metabolsk aktiv stasjonær fase9. Cellene slutter deretter å dele seg mitotisk, og proteinene som kreves for parring syntetiseres. Siden de haploide cellene ikke kan bevege seg mot hverandre, er en parringsprojeksjon eller "shmoo" rettet mot parringspartneren. Når cellene kommer i kontakt, brytes celleveggen ned, og det cytoplasmatiske innholdet smelter sammen, noe som resulterer i parring for å danne en diploid celle10,11. Parringseffektiviteten mellom haploider har blitt brukt som et mål på artsdannelse i laboratorieutviklede stammer, så vel som mellom eksisterende arter12.

Å være en enkel eukaryot organisme, er gjær den valgte modellen for et stort antall forskningsspørsmål knyttet til komplekse eukaryote organismer. Et slikt spørsmål er knyttet til artsdannelse og utviklingen av reproduktive barrierer13,14. For seksuelt reproduserende organismer er en art definert av det biologiske artskonseptet (BSC) foreslått av Ernst Mayr15. Ifølge dette konseptet sies to individer av en populasjon å tilhøre to forskjellige arter hvis de ikke kan krysse seg og er reproduktivt isolert. Nedbrytning av den seksuelle reproduktive syklusen (som involverer fusjon av gameter for å danne en zygote, utviklingen av zygoten til et avkom, og oppnåelse av seksuell modenhet i avkom) fører til reproduktiv isolasjon. Som vist i figur 1 er livssyklusen til S. cerevisiae sammenlignbar med den seksuelle reproduksjonssyklusen: a) fusjonen av de to parringstypene a og α ligner fusjonen av kjønnsceller i seksuelt reproduserende organismer; b) diploidens evne til å gjennomgå mitotisk deling er ekvivalent med zygoten som utvikler seg til avkom; og c) den diploide som gjennomgår sporulering er sammenlignbar med prosessen med gametogenese14.

Pre-zygotisk isolasjon oppstår når assortativ parring observeres. Gitt lik mulighet til å pare seg med to genetisk forskjellige a-typer , parrer en α type seg fortrinnsvis med den ene over den andre eller omvendt14. I tilfelle av evolusjonseksperimenter der haploider har blitt utviklet i forskjellige miljøer, kan tilstedeværelsen av en pre-parring barriere bestemmes ved å utføre en parringsanalyse. En reduksjon i parringseffektiviteten sammenlignet med forfederen indikerer utviklingen av en pre-parring barriere. Postzygotisk isolasjon kan oppstå på grunn av diploidens manglende evne til å gjennomgå effektiv mitotisk deling og/eller sporulering for å danne haploide sporer14. Disse kan kvantifiseres ved henholdsvis å måle veksthastigheten til diploidene og beregne sporuleringseffektiviteten. Derfor, for å studere utviklingen av reproduktive barrierer, kreves robuste metoder for å kvantifisere (a) parringseffektiviteten, (b) den mitotiske veksten av diploiden, og (c) sporuleringseffektiviteten til diploid. I dette arbeidet rapporteres en robust metode for å kvantifisere parringseffektiviteten til gjærstammer.

I laboratorieforsøk er en av måtene som forekomsten av parring kan detekteres, ved å bruke auxotrofiske markører som utfyller ernæringsbehovene. Når de to parringstypene er auxotrofiske for to forskjellige aminosyrer, kan bare den diploide cellen dannet ved fusjon av de to parringstypene vokse på et medium mangelfull i begge aminosyrene. Dermed er auxotrofiske markører nyttige for å oppdage parring både kvalitativt og kvantitativt. En kvalitativ test vil være tilstrekkelig til å identifisere parringstypen av en stamme etter meiose16. Kvantitative tester er viktige når man er interessert i å identifisere en reduksjon i parring mens man studerer genene som er involvert i parringsveien17,18. I tillegg, med gjær som i økende grad brukes i spesieringsstudier, er det nødvendig med en praktisk og reproduserbar parringsanalyse, da kvantifiseringen av parringseffektiviteten er et mål på den pre-zygotiske barrieren.

Parringseffektiviteten mellom de to gjærparringstypene er kvantifisert tidligere16,19,20. De fleste av de tidligere brukte metodene er like i deres design med noen få variasjoner 16,21,22,23,24,25. Noen av dem bruker tidlige loggfasekulturer, mens noen få andre bruker midtloggfasekulturer av haploide stammer. Det er variasjoner i forholdene der de to parringstypene blandes. Nesten alle protokollene bruker en nitrocellulosemembran. Suspensjoner av begge parringstyper tatt fra tidligere dyrkede kulturer blandes og filtreres på en nitrocellulosemembran plassert på en YPD-plate. I en av variantene av protokollen er den haploide suspensjonen direkte lappet på en YPD-plate21. I eksperimenter som omhandler genene som er involvert i feromonproduksjonen av de to parringstypene, blir feromonene eksternt tilsatt mens suspensjonene av de to parringstypene24.

Etter inkubering i noen timer (vanligvis rundt 5 timer) etter blanding av haploider, vaskes cellene av fra membranen, fortynnes og belegges på selektive medier. I en av de tidligere metodene som ble rapportert i 1973, ble effektiviteten av zygotedannelse eller parring beregnet ved å telle antall budded celler, unbudded celler og parring par under et mikroskop ved hjelp av et hemocytometer26. Imidlertid bruker de fleste metoder rapportert senere auxotrofiske markører for å skille haploider og diploider. Parringseffektivitet beregnes som prosentandelen diploide celler i forhold til antall diploide og haploide celler i cellebassenget 16,21,23.

Til tross for en rekke rapporter som bruker gjær som modellorganisme for å studere artsdannelse, er det imidlertid ingen standardisert protokoll rapportert i litteraturen til nå for å beregne effektiviteten av parring. Celler i loggfasen er kanskje ikke ideelle for kvantifisering av parringseffektivitet. Under parring blir cellesyklusen til de to haploidene arrestert, og derfor deler cellene under parring ikke9. Siden cellesyklusen også er kjent for å bli arrestert på samme måte i celler i den stasjonære fase27, kan bruk av slike celler gjøre protokollen mer reproduserbar. Stasjonære faseceller kan blandes og legges ut på YPD-plater (dvs. et ernæringsrikt miljø) for parring. De konvensjonelle prosedyrene krever også en nitrocellulosemembran og vasking av cellene, noe som gjør prosessen tungvint og utsatt for håndteringsfeil. I tillegg kvantifiserer protokollene som hittil er brukt parringseffektiviteten i form av en haploid. Ved måling av reproduktiv isolasjon kvantifiseres imidlertid parringseffektiviteten for en bestemt kombinasjon av haploider i stedet for en enkelt haploid.

For å løse disse problemene, rapporterer vi her en robust metode for kvantifisering av parringseffektivitet i gjær som er svært reproduserbar og enkel å bruke. Videre kan denne metoden og gjærstammene som brukes her, også brukes i studier som undersøker effekten av genflyt på utviklingen av parringsbarrierer.

To forskjellige stammer av S. cerevisiae ble brukt i denne studien. En av stammene er avledet fra SK1-bakgrunnen; Dette ble modifisert i vårt laboratorium ved å legge til de auxotrofiske markørene nær MAT-lokuset. De resulterende genotypene av haploidene er gitt i tabell 128,29,30. I SK1-stammen hadde en haploid TRP1-genet satt inn nær MAT-lokuset, og den α haploide hadde LEU2-genet satt inn nær MAT-lokuset. I ScAM-stammen ble TRP1- og URA3-genene satt inn i henholdsvis a- og α-haploidene. Plasseringen av innsettingen var i ARS-regionen av kromosom III (Chr III: 197378..197609). For protokollen som er rapportert her, vil auxotrofe markører hvor som helst på genomet være tilstrekkelig. Å ha de auxotrofe markørene nær MAT-lokuset betyr imidlertid at disse stammene også kan brukes til studier som undersøker effekten av genstrøm på artsdannelse 31,32. Markørene ble lagt nær MAT-lokuset for å forhindre omstokking av markørene på grunn av rekombinasjon. Derfor kan denne protokollen brukes til å kvantifisere parringseffektivitet i studier som involverer spesiering og også for å identifisere endringen av parringseffektivitet når man studerer proteinene som er involvert i parringsveien.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A8626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Powder regular grade for bacteriology</td>
			<td>SRL</td>
			<td>19661 (0140186)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulphate, Hi-AR</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>GRM1273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri plates</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>PW008</td>
			<td>&#160;90 mm x 15 mm dimension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A8094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A7219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histidine monochloride monohydrate</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>H5659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>L8912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>62840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>M5308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>P5482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Threonine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tyrosine</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>T8566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>V0513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mating efficiency grid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 cm x 1.5 cm rectangular grid drawn on the Petri plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>500010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract Powder</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Nitrogen Base w/o Amino acids and Ammonium Sulphate</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>233520</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of the mating efficiency of haploids in saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae er en mye brukt modellorganisme innen genetikk, evolusjon og molekylærbiologi. I de senere år har det også blitt en populær modellorganisme for å studere problemer knyttet til artsdannelse. Livssyklusen til gjær innebærer både aseksuelle og seksuelle reproduktive faser. Den enkle å utføre evolusjonseksperimenter og den korte generasjonstiden til organismen tillater studiet av utviklingen av reproduktive barrierer. Effektiviteten som de to parringstypene (a og α) parrer seg med for å danne a/α diploide blir referert til som parringseffektiviteten. Enhver reduksjon i parringseffektiviteten mellom haploider indikerer en pre-zygotisk barriere. For å kvantifisere omfanget av reproduktiv isolasjon mellom to haploider, er det derfor nødvendig med en robust metode for å kvantifisere parringseffektiviteten. For dette formål presenteres en enkel og svært reproduserbar protokoll her. Protokollen innebærer fire hovedtrinn, som inkluderer patching av haploider på en YPD-plate, blanding av haploider i like store mengder, fortynning og plating for enkeltkolonier, og til slutt beregning av effektiviteten basert på antall kolonier på en drop-out plate. Auxotrofe markører brukes for å tydelig skille mellom haploider og diploider.

Kvantifisering av parringseffektiviteten til de to parringstypene Protokollen beskrevet her ble brukt til å kvantifisere parringseffektiviteten mellom to gjærstammer - mellom SK1AM a og SK1AM α og mellom ScAMa og ScAMα (figur 3A). I disse forsøkene ble parringen mellom de to haploidene gjentatt minst 12 ganger. I hver av gjentakelsene av eksperimentet ble minst 100 kolonier streket på doble frafall...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Mating Efficiency of Haploids in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Determination of the Mating Efficiency of Haploids in Saccharomyces cerevisiae

I dette arbeidet beskrives en robust metode for kvantifisering av parringseffektivitet i gjæren Saccharomyces cerevisiae . Denne metoden er spesielt nyttig for kvantifisering av pre-zygotiske barrierer i spesieringsstudier.

Bestemmelse av parringseffektiviteten til haploider i Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae is a widely used model organism in genetics, evolution, and molecular biology. In recent years, it has also become a popular ...

Denne protokollen er en enkel metode for å kvantifisere effektiviteten som forskjellige stammer og arter av gjær parrer seg med hverandre. Den foreslåtte metoden er enkel, robust og effektiv. Metoden kan utvides til enhver gjærstamme.Metoden beskrevet i denne studien kan brukes til å forstå hvordan artsdannelse oppstår i gjær. Videre kan stammene som vi beskriver være spesielt nyttige for å designe eksperimenter med genstrøm. Metodens styrke er at den er veldig enkel.Noen små justeringer som tidspunktet for inkubasjon kan være nødvendig, avhengig av den spesielle belastningen som brukes. Begynn å gjenopplive haploidene A og Alpha fra frosne bestander ved å stripe gjærinokulumet på et gjærekstrakt, pepton, dextrose eller YPD-agarplate. La dem vokse i 48 timer ved 30 grader Celsius for å oppnå enkeltkolonier.Etter inkubering, inokuler enkeltkolonier fra YPD-platen og fem milliliter YPD-medium, og inkuber ved 30 grader Celsius i 48 timer med 250 RPM risting. Cellene er i den stasjonære vekstfasen etter denne inkubasjonsperioden. På en fersk YPD-plate tegner du parringseffektivitetsgitter som et rektangel på 1 x 1,5 centimeter delt inn i tre bokser, hver med en dimensjon på 1 x 0,5 centimeter.Inokuler fem mikroliter av YPD-kulturen av de to parringstypene på venstre og høyre rektangler. Dette volumet tilsvarer omtrent 5 ganger 10 til de femte haploide cellene i hver seksjon. Inkuber platene i 24 timer ved 30 grader Celsius.For å blande like mange gjærceller, fjern ca. 1/3 av gjærveksten utviklet i de ytre boksene ved hjelp av en steril tannpirker og resuspender de fjernede cellene i 20 mikroliter vann i et sterilt 1,5 milliliter hetteglass. Følg dette for hver haploid. Deretter fortynner du fem mikroliter av denne suspensjonen i to milliliter vann og måler den optiske tettheten ved hjelp av et spektrofotometer ved 600 nanometer.Basert på den optiske tetthetsverdien og antall celler per milliliter ved en optisk tetthet, tilsett de nødvendige volumene av begge haploider i et friskt og sterilt 1,5 milliliter hetteglass. Bland det godt med en pipette. Det endelige volumet av denne suspensjonen er vanligvis rundt seks til åtte mikroliter.Deretter inokulerer du denne fjæringen i midtgitteret. Inkuber platen ved 30 grader Celsius i syv timer, slik at haploidene kan mate. Etter syv timers inkubasjon, skrap cellene fra midtrektangelet ved hjelp av en tannpirker eller en pipettespiss og fortynn i to milliliter sterilt vann.Utfør ytterligere fortynninger, og spre deretter cellesuspensjonen på YPD-agar for å oppnå enkeltkolonier. Etter plating, inkuber YPD-platene ved 30 grader Celsius i 36 til 48 timer for å utvikle enkeltkolonier. Sørg for at noen hundre individuelle kolonier hentes fra hvert parringseksperiment for screening for å sikre den statistiske signifikansen av dataene.For å identifisere de diploide koloniene på platen, overfør de enkelte koloniene ved å streke dem individuelt på en dobbel drop-out-plate, som mangler aminosyrene som stammene er auxotrofiske for. Inkuber platene ved 30 grader Celsius i 48 timer og beregne parringseffektiviteten, nu. Den robuste protokollen muliggjorde enkel differensiering av parringseffektiviteten mellom de to stammene, SK1AM og ScAM.Mens SK1-stammene parret seg med en svært høy effektivitet, parret ScAM-stammene seg med en relativt lavere effektivitet. Parringseffektiviteten til ScAM-stammene falt betydelig når miljøet ikke inneholdt glukose som en primær karbonkilde, noe som indikerer at parring er en energisk kostbar prosess og vekst på alternative karbonkilder kvalitativt reduserer effektiviteten av parring. Når det fikk lov til å parre seg i forskjellige tidsperioder, ble det ikke observert parring de første fire til fem timene.De første diploidene dukket opp først etter fire til fem timer, noe som indikerer at dette er tiden som trengs for at parringsprosessen skal fullføres i det gitte miljøet. Etter det økte parringseffektiviteten raskt. Utover syv timer ble parringseffektivitetsberegningene påvirket av at mitotisk vekst startet på platen.Sørg for at like mange av begge haploidene blandes. Avvik fra dette vil føre til variasjoner i uavhengige gjentakelser av protokollen. Hvordan genflyt påvirker tilpasning og artsdannelse er et åpent spørsmål.Siden de auxotrofiske markørene er satt inn ved siden av MAT-lokuset i stammene våre, bidrar dette til å løse dette viktige spørsmålet.

Research

JoVE Journal

Biology

Determination of the Mating Efficiency of Haploids in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Uttrykk og rensing av Cystisk fibrose transmembrane Conduktans Regulator Protein i Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisering og analyse av mRNA molekyler med fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Sammen Analyser for Monitoring Protein Refolding i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Rensing av Cystisk fibrose transmembrane konduktans Regulator Protein Uttrykt i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

EPJ Overvåket Redokstitrering av kofaktorer i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Måling av mRNA Decay priser i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Bruke<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Stammer

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...