Name: determination of the mating efficiency of haploids in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2022-12-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Mating Efficiency of Haploids in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Detta arbete finansierades av ett DBT / Wellcome Trust (India Alliance) -bidrag (IA / S / 19/2 / 504632) till SS PN är en forskare som stöds av ett DBT / Wellcome Trust (India Alliance) bidrag (IA / S / 19/2 / 504632). AM stöds av Council of Scientific and Industrial Research (CSIR), Indiens regering, som Senior Research Fellow (09/087 (0873) / 2017-EMR-I). Författarna tackar Paike Jayadeva Bhat för diskussioner.

OBS: Protokollet innefattar i stort sett följande steg: (1) lappa haploiderna i parningseffektivitetsgallren på en YPD-platta, (2) blanda haploiderna i lika antal efter 24 timmars inkubation och ge de blandade haploiderna några timmar att para sig (7 timmar i denna studie), (3) plätering av de blandade cellerna på YPD för isolering av enskilda kolonier efter 7 timmar vid 30 °C, och slutligen, (4) bestämning av antalet diploider bildade med användning av auxotrofa markörer. Dessa steg diskuteras i detalj nedan ...

<ol>
	<li>Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporulation+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).</li><li>Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+yeast+for+budding+geneticists:+A+primer+on+the+Saccharomyces+cerevisiae+model+system.">Budding yeast for budding geneticists: A primer on the Saccharomyces cerevisiae model system.</a> Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).</li><li>Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+cycle+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).</li><li>Erdman, S., Lin, L., Malczynski, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromone-regulated+genes+required+for+yeast+mating+differentiation.">Pheromone-regulated genes required for yeast mating differentiation.</a> Journal of Cell Biology. 140 (3), 461-483 (1998).</li><li>Merlini, L., Dudin, O., Martin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mate+and+fuse:+How+yeast+cells+do+it.">Mate and fuse: How yeast cells do it.</a> Open Biology. 3 (3), 130008 (2013).</li><li>Gustin, M. C., Albertyn, J., Alexander, M., Davenport, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAP+kinase+pathways+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">MAP kinase pathways in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1264-1300 (1998).</li><li>Bardwell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+walk-through+of+the+yeast+mating+pheromone+response+pathway.">A walk-through of the yeast mating pheromone response pathway.</a> Peptides. 26 (2), 339-350 (2005).</li><li>Reid, B. J., Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mating+in+the+cell+cycle+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Regulation of mating in the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Cell Biology. 75, 355-365 (1977).</li><li>Williams, T. C., Peng, B., Vickers, C. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Saccharomyces+cerevisiae+pheromone-response+is+a+metabolically+active+stationary+phase+for+bio-production.">The Saccharomyces cerevisiae pheromone-response is a metabolically active stationary phase for bio-production.</a> Metabolic Engineering Communications. 3, 142-152 (2016).</li><li>Bagnat, M., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+polarization+during+yeast+mating.">Cell surface polarization during yeast mating.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14183-14188 (2002).</li><li>Trueheart, J., Boeke, J. D., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+genes+required+for+cell+fusion+during+yeast+conjugation:+Evidence+for+a+pheromone-induced+surface+protein.">Two genes required for cell fusion during yeast conjugation: Evidence for a pheromone-induced surface protein.</a> Molecular and Cellular Biology. 7 (7), 2316-2328 (1987).</li><li>Sniegowski, P. D., Dombrowski, P. G., Fingerman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+and+Saccharomyces+paradoxus+coexist+in+a+natural+woodland+site+in+North+America+and+display+different+levels+of+reproductive+isolation+from+European+conspecifics.">Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus coexist in a natural woodland site in North America and display different levels of reproductive isolation from European conspecifics.</a> FEMS Yeast Research. 1 (4), 299-306 (2002).</li><li>Replansky, T., Koufopanou, V., Greig, D., Bell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+sensu+stricto+as+a+model+system+for+evolution+and+ecology.">Saccharomyces sensu stricto as a model system for evolution and ecology.</a> Trends in Ecology and Evolution. 23 (9), 494-501 (2008).</li><li>Greig, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+isolation+in+Saccharomyces.">Reproductive isolation in Saccharomyces.</a> Heredity. 102 (1), 39-44 (2009).</li><li>Mayr, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Systematics and the Origin of Species, from the Viewpoint of a Zoologist. , (1999).</li><li>Sprague, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+yeast+mating+reaction.">Assay of yeast mating reaction.</a> Methods in Enzymology. 194, 77-93 (1991).</li><li>McCaffrey, G., Clay, F. J., Kelsay, K., Sprague, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+regulation+of+a+gene+required+for+cell+fusion+during+mating+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Identification and regulation of a gene required for cell fusion during mating of the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 7 (8), 2680-2690 (1987).</li><li>Valtz, N., Peter, M., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAR1+is+required+for+oriented+polarization+of+yeast+cells+in+response+to+mating+pheromones.">FAR1 is required for oriented polarization of yeast cells in response to mating pheromones.</a> Journal of Cell Biology. 131 (4), 863-873 (1995).</li><li>Maclean, C. J., Greig, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prezygotic+reproductive+isolation+between+Saccharomyces+cerevisiae+and+Saccharomyces+paradoxus.">Prezygotic reproductive isolation between Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus.</a> BMC Evolutionary Biology. 8, 1 (2008).</li><li>Murphy, H. A., Kuehne, H. A., Francis, C. A., Sniegowski, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mate+choice+assays+and+mating+propensity+differences+in+natural+yeast+populations.">Mate choice assays and mating propensity differences in natural yeast populations.</a> Biology Letters. 2 (4), 553-556 (2006).</li><li>Leu, J. Y., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+evolution+of+mating+discrimination+in+budding+yeast.">Experimental evolution of mating discrimination in budding yeast.</a> Current Biology. 16 (3), 280-286 (2006).</li><li>Kim, J., Hirsch, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nucleolar+protein+that+affects+mating+efficiency+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+altering+the+morphological+response+to+pheromone.">A nucleolar protein that affects mating efficiency in Saccharomyces cerevisiae by altering the morphological response to pheromone.</a> Genetics. 149 (2), 795-805 (1998).</li><li>Jin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+dynamically+modify+their+environment+to+achieve+better+mating+efficiency.">Yeast dynamically modify their environment to achieve better mating efficiency.</a> Science Signaling. 4 (186), (2011).</li><li>Rogers, D. W., Denton, J. A., McConnell, E., Greig, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+evolution+of+species+recognition.">Experimental evolution of species recognition.</a> Current Biology. 25 (13), 1753-1758 (2015).</li><li>McClure, A. W., Jacobs, K. C., Zyla, T. R., Lew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+in+wild+yeast:+Delayed+interest+in+sex+after+spore+germination.">Mating in wild yeast: Delayed interest in sex after spore germination.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (26), 3119-3127 (2018).</li><li>Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+mating+in+yeast.">Synchronous mating in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (5), 1373-1377 (1973).</li><li>Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stationary+phase+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiology Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).</li><li>Johnston, S. A., Hopper, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+the+yeast+regulatory+gene+GAL4+and+analysis+of+its+dosage+effects+on+the+galactose/melibiose+regulon.">Isolation of the yeast regulatory gene GAL4 and analysis of its dosage effects on the galactose/melibiose regulon.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (22), 6971-6975 (1982).</li><li>Mahilkar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Study of metabolic specialization leading to speciation, using yeast as a model system. , (2021).</li><li>Blank, T. E., Woods, M. P., Lebo, C. M., Xin, P., Hopper, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Gal3+proteins+showing+altered+Gal80p+binding+cause+constitutive+transcription+of+Gal4p-activated+genes+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Novel Gal3 proteins showing altered Gal80p binding cause constitutive transcription of Gal4p-activated genes in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 17 (5), 2566-2575 (1997).</li><li>Rice, W. R., Hostert, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+experiments+on+speciation:+What+have+we+learned+in+40+years.">Laboratory experiments on speciation: What have we learned in 40 years.</a> Evolution. 47 (6), 1637-1653 (1993).</li><li>White, N. J., Snook, R. R., Eyres, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+past+and+future+of+experimental+speciation.">The past and future of experimental speciation.</a> Trends in Ecology and Evolution. 35 (1), 10-21 (2020).</li><li>Milo, R., Jorgensen, P., Moran, U., Weber, G., Springer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioNumbers--The+database+of+key+numbers+in+molecular+and+cell+biology.">BioNumbers--The database of key numbers in molecular and cell biology.</a> Nucleic Acids Research. 38, 750-753 (2010).</li><li>Domitrovic, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+study+of+YER067W,+a+new+protein+involved+in+yeast+metabolism+control+and+drug+resistance.">Structural and functional study of YER067W, a new protein involved in yeast metabolism control and drug resistance.</a> PLoS One. 5 (6), 11163 (2010).</li><li>Lindegren, C. C., Spiegelman, S., Lindegren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mendelian+inheritance+of+adaptive+enzymes.">Mendelian inheritance of adaptive enzymes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 30 (11), 346-352 (1944).</li><li>Dettman, J. R., Sirjusingh, C., Kohn, L. M., Anderson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incipient+speciation+by+divergent+adaptation+and+antagonistic+epistasis+in+yeast.">Incipient speciation by divergent adaptation and antagonistic epistasis in yeast.</a> Nature. 447 (7144), 585-588 (2007).</li><li>Jhuang, H. Y., Lee, H. Y., Leu, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial-nuclear+co-evolution+leads+to+hybrid+incompatibility+through+pentatricopeptide+repeat+proteins.">Mitochondrial-nuclear co-evolution leads to hybrid incompatibility through pentatricopeptide repeat proteins.</a> EMBO Reports. 18 (1), 87-101 (2017).</li><li>Lee, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incompatibility+of+nuclear+and+mitochondrial+genomes+causes+hybrid+sterility+between+two+yeast+species.">Incompatibility of nuclear and mitochondrial genomes causes hybrid sterility between two yeast species.</a> Cell. 135 (6), 1065-1073 (2008).</li><li>Pronk, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxotrophic+yeast+strains+in+fundamental+and+applied+research.">Auxotrophic yeast strains in fundamental and applied research.</a> Applied and Environmental Microbiology. 68 (5), 2095-2100 (2002).</li><li>Madhani, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> From a to &#945;: Yeast as a Model for Cellular Differentiation. , (2007).</li><li>Huxley, C., Green, E. D., Dunham, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+assessment+of+S.+cerevisiae+mating+type+by+PCR.">Rapid assessment of S. cerevisiae mating type by PCR.</a> Trends in Genetics. 6 (8), 236 (1990).</li><li>Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+cost+of+the+green+fluorescent+protein+in+gastrointestinal+bacteria.">Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria.</a> Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).</li><li>Tusso, S., Nieuwenhuis, B. P. S., Weissensteiner, B., Immler, S., Wolf, J. B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+evolution+of+adaptive+divergence+under+varying+degrees+of+gene+flow.">Experimental evolution of adaptive divergence under varying degrees of gene flow.</a> Nature Ecology and Evolution. 5 (3), 338-349 (2021).</li></ol>

Kvantifieringen av parningseffektiviteten i S. cerevisiae är avgörande för att genomföra studier relaterade till generna som är involverade i parningsvägar eller studera påverkan av den yttre miljön på parningsbeteende. Under de senaste två decennierna har S. cerevisiae också blivit en populär modell för att ta itu med frågor relaterade till artbildning 14,36,37,38.</s...

Saccharomyces cerevisiae, vanligen kallad spirande jäst, är en encellig eukaryot. Den har två parningstyper, en och α, och uppvisar både asexuella och sexuella reproduktionscykler. Parningstyperna a och α är haploider och kan dela sig mitotiskt i frånvaro av den andra parningstypen i den omgivande miljön, vilket representerar jästens asexuella cykel. När de två parningstyperna är i närheten, slutar de dela mitotiskt och smälter samman för att bilda en diploid cell. Den diploida jästen kan antingen dela mitotiskt när näringsämnen är närvarande eller genomgå meios under kvävehushållningsförhållandena i närvaro av en dålig kolkälla som inte kan jäsas, såsom acetat1. Detta resulterar i bildandet av sporer, som förblir vilande tills det finns gynnsamma tillväxtförhållanden. Livscykeln är avslutad när dessa sporer gror och de två haploida typerna släpps tillbaka till den haploida poolen 2,3 (figur 1).

Parningen av jästceller innefattar flera steg, såsom agglutination, bildandet av en parningsprojektion eller "shmoo", följt av cell- och kärnfusion 4,5. De två parningstyperna a och α producerar a-faktor respektive α-faktor för att initiera parning. Dessa faktorer är polypeptidferomoner som binder till receptorerna (Ste2 och Ste3) närvarande på cellytan av motsatt parningstyp5. Bindningen av feromonerna till receptorerna initierar feromonresponsvägen, den mitogenaktiverade proteinkinas (MAPK) signaltransduktionsvägen 6,7,8. Detta resulterar i arrestering av cellcykeln i G1-fasen, vilket leder till en metaboliskt aktiv stationär fas9. Cellerna slutar sedan dela mitotiskt, och proteinerna som krävs för parning syntetiseras. Eftersom de haploida cellerna inte kan röra sig mot varandra, riktas en parningsprojektion eller "shmoo" mot parningspartnern. När cellerna kommer i kontakt bryts cellväggen ned och det cytoplasmatiska innehållet smälter, vilket resulterar i parning för att bilda en diploid cell10,11. Parningseffektiviteten mellan haploider har använts som ett mått på artbildning i laboratorieutvecklade stammar, liksom mellan befintliga arter12.

Att vara en enkel eukaryot organism är jäst den valda modellen för ett stort antal forskningsfrågor associerade med komplexa eukaryota organismer. En sådan fråga är förknippad med artbildning och utvecklingen av reproduktionsbarriärer13,14. För sexuellt reproducerande organismer definieras en art av det biologiska artbegreppet (BSC) som föreslagits av Ernst Mayr15. Enligt detta koncept sägs två individer i en population tillhöra två olika arter om de inte kan korsas och är reproduktivt isolerade. Uppdelning av den sexuella reproduktionscykeln (som involverar fusion av gameter för att bilda en zygot, utvecklingen av zygoten till en avkomma och uppnåendet av sexuell mognad i avkomman) leder till reproduktiv isolering. Som visas i figur 1 är livscykeln för S. cerevisiae jämförbar med den sexuella reproduktionscykeln: a) sammansmältningen av de två parningstyperna a och α liknar fusionen av könsceller i sexuellt reproducerande organismer; b) Diploidens förmåga att genomgå mitotisk uppdelning motsvarar zygoten som utvecklas till avkomma; och c) den diploida som genomgår sporulering är jämförbar med processen för gametogenes14.

Pre-zygotisk isolering uppträder när assortativ parning observeras. Med lika möjligheter att para sig med två genetiskt olika a-typer parar sig en α typ företrädesvis med den ena över den andra eller vice versa14. När det gäller evolutionsexperiment där haploider har utvecklats i olika miljöer kan närvaron av en pre-parningsbarriär bestämmas genom att utföra en parningsanalys. En minskning av parningseffektiviteten jämfört med förfadern indikerar utvecklingen av en förparningsbarriär. Postzygotisk isolering kan uppstå på grund av diploidens oförmåga att genomgå effektiv mitotisk delning och / eller sporulering för att bilda haploida sporer14. Dessa kan kvantifieras genom att mäta tillväxthastigheten hos diploiderna respektive beräkna sporuleringseffektiviteten. För att studera utvecklingen av reproduktionsbarriärer krävs därför robusta metoder för att kvantifiera (a) parningseffektiviteten, (b) den mitotiska tillväxten av diploiden och (c) sporuleringseffektiviteten hos diploiden. I detta arbete rapporteras en robust metod för att kvantifiera parningseffektiviteten hos jäststammar.

I laboratorieexperiment kan ett av de sätt på vilka förekomsten av parning detekteras genom att använda auxotrofa markörer som kompletterar näringsbehovet. När de två parningstyperna är auxotrofa för två olika aminosyror kan endast den diploida cellen som bildas genom fusion av de två parningstyperna växa på ett medium som saknar båda aminosyrorna. Således är auxotrofa markörer användbara för att detektera parning både kvalitativt och kvantitativt. Ett kvalitativt test räcker för att identifiera parningstypen av en stam efter meios16. Kvantitativa tester är viktiga när man är intresserad av att identifiera en minskning av parningen medan man studerar generna som är involverade i parningsvägen17,18. Dessutom, med jäst som alltmer används i specieringsstudier, är en bekväm och reproducerbar parningsanalys nödvändig, eftersom kvantifieringen av parningseffektivitet är ett mått på den pre-zygotiska barriären.

Parningseffektiviteten mellan de två jästparningstyperna har tidigare kvantifierats16,19,20. De flesta av de tidigare använda metoderna är likartade i sin design med några variationer 16,21,22,23,24,25. Några av dem använder tidiga logfaskulturer, medan några andra använder mid-log-faskulturer av haploida stammar. Det finns variationer i förhållandena där de två parningstyperna blandas. Nästan alla protokoll använder ett nitrocellulosamembran. Suspensioner av båda parningstyperna som tas från tidigare odlade kulturer blandas och filtreras på ett nitrocellulosamembran placerat på en YPD-platta. I en av varianterna av protokollet lappas den haploida suspensionen direkt på en YPD-platta21. I experiment som behandlar generna som är involverade i feromonproduktionen av de två parningstyperna, tillsätts feromonerna externt medan suspensionerna av de två parningstyperna24 görs.

Efter inkubation i några timmar (vanligtvis cirka 5 timmar) efter blandning av haploiderna tvättas cellerna bort från membranet, späds ut och pläteras på selektiva medier. I en av de tidigare metoderna som rapporterades 1973 beräknades effektiviteten av zygotbildning eller parning genom att räkna antalet knoppade celler, unbudded celler och parning par under ett mikroskop med hjälp av en hemocytometer26. De flesta metoder som rapporteras senare använder emellertid auxotrofa markörer för att skilja haploider och diploider. Parningseffektivitet beräknas som procentandelen diploida celler i förhållande till antalet diploida och haploida celler i cellpoolen 16,21,23.

Trots ett antal rapporter som använder jäst som modellorganism för att studera artbildning, finns det inget standardiserat protokoll rapporterat i litteraturen förrän nu för att beräkna parningens effektivitet. Celler i logfasen kanske inte är idealiska för kvantifiering av parningseffektivitet. Under parning arresteras cellcykeln hos de två haploiderna, och följaktligen delar cellerna under parninginte 9. Eftersom cellcykeln också är känd för att vara på liknande sätt arresterad i celler i den stationära fas27, kan användning av sådana celler göra protokollet mer reproducerbart. Stationära fasceller kan blandas och läggas ut på YPD-plattor (dvs. en näringsrik miljö) för parning. De konventionella procedurerna kräver också ett nitrocellulosamembran och tvättning av cellerna, vilket gör processen besvärlig och utsatt för hanteringsfel. Dessutom kvantifierar de protokoll som hittills använts parningseffektiviteten i termer av en haploid. Men vid mätning av reproduktiv isolering kvantifieras parningseffektiviteten för en viss kombination av haploider snarare än en enda haploid.

För att ta itu med dessa problem rapporterar vi här en robust metod för kvantifiering av parningseffektivitet i jäst som är mycket reproducerbar och lätt att använda. Dessutom kan denna metod och de jäststammar som används här också användas i studier som undersöker effekten av genflöde på utvecklingen av parningsbarriärer.

Två olika stammar av S. cerevisiae användes i denna studie. En av stammarna härrör från SK1-bakgrunden; detta modifierades i vårt laboratorium genom att lägga till auxotrofa markörer nära MAT-locus. De resulterande genotyperna av haploiderna anges i tabell 128,29,30. I SK1-stammen hade en haploid TRP1-genen insatt nära MAT-locus, och den α haploiden hade LEU2-genen insatt nära MAT-locus. I ScAM-stammen infördes TRP1- och URA3-generna i a- respektive α haploiderna. Platsen för insättning var i ARS-regionen av kromosom III (Chr III: 197378..197609). För det protokoll som rapporteras här skulle auxotrofa markörer var som helst på genomet räcka. Att ha auxotrofa markörer nära MAT-lokus innebär dock att dessa stammar också kan användas för studier som undersöker effekten av genflöde på speciering31,32. Markörerna lades till nära MAT-platsen för att förhindra omblandning av markörerna på grund av rekombination. Därför kan detta protokoll användas för att kvantifiera parningseffektivitet i studier som involverar artbildning och även för att identifiera förändringen av parningseffektivitet när man studerar proteinerna som är involverade i parningsvägen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A8626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Powder regular grade for bacteriology</td>
			<td>SRL</td>
			<td>19661 (0140186)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulphate, Hi-AR</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>GRM1273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri plates</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>PW008</td>
			<td>&#160;90 mm x 15 mm dimension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A8094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A7219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histidine monochloride monohydrate</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>H5659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>L8912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>62840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>M5308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>P5482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Threonine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tyrosine</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>T8566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>V0513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mating efficiency grid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 cm x 1.5 cm rectangular grid drawn on the Petri plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>500010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract Powder</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Nitrogen Base w/o Amino acids and Ammonium Sulphate</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>233520</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of the mating efficiency of haploids in saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae är en allmänt använd modellorganism inom genetik, evolution och molekylärbiologi. Under de senaste åren har det också blivit en populär modellorganism för att studera problem relaterade till artbildning. Jästens livscykel involverar både asexuella och sexuella reproduktionsfaser. Lätt att utföra evolutionsexperiment och organismens korta generationstid möjliggör studier av utvecklingen av reproduktionsbarriärer. Effektiviteten med vilken de två parningstyperna (a och α) parar sig för att bilda a / α diploida kallas parningseffektivitet. Varje minskning av parningseffektiviteten mellan haploider indikerar en pre-zygotisk barriär. För att kvantifiera omfattningen av reproduktiv isolering mellan två haploider krävs därför en robust metod för att kvantifiera parningseffektiviteten. För detta ändamål presenteras ett enkelt och mycket reproducerbart protokoll här. Protokollet innefattar fyra huvudsteg, som inkluderar lappning av haploiderna på en YPD-platta, blandning av haploiderna i lika antal, utspädning och plätering för enskilda kolonier och slutligen beräkning av effektiviteten baserat på antalet kolonier på en bortfallsplatta. Auxotrofa markörer används för att tydligt skilja mellan haploider och diploider.

Kvantifiering av parningseffektiviteten hos de två parningstyperna Protokollet som beskrivs här användes för att kvantifiera parningseffektiviteten mellan två jäststammar - mellan SK1AM a och SK1AM α och mellan ScAMa och ScAM α (figur 3A). I dessa experiment upprepades parningen mellan de två haploiderna minst 12 gånger. I var och en av upprepningarna av experimentet strimlades minst 100 kolonie...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Mating Efficiency of Haploids in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Determination of the Mating Efficiency of Haploids in Saccharomyces cerevisiae

I detta arbete beskrivs en robust metod för kvantifiering av parningseffektivitet i jästen Saccharomyces cerevisiae . Denna metod är särskilt användbar för kvantifiering av prezygotiska barriärer i specieringsstudier.

Bestämning av parningseffektiviteten hos haploider i Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae is a widely used model organism in genetics, evolution, and molecular biology. In recent years, it has also become a popular ...

Detta protokoll är en enkel metod för att kvantifiera effektiviteten med vilken olika stammar och jästarter parar sig med varandra. Den föreslagna metoden är enkel, robust och effektiv. Metoden kan utvidgas till vilken jäststam som helst.Metoden som beskrivs i denna studie kan användas för att förstå hur artbildning sker i jäst. Dessutom kan de stammar som vi beskriver vara särskilt användbara för att designa experiment med genflöde. Metodens styrka är att det är väldigt enkelt.Vissa små justeringar som inkubationstiden kan behövas beroende på vilken särskild stam som används. Börja återuppliva haploiderna A och Alpha från frysta bestånd genom att strö jästinokulatet på en jästextrakt, pepton, dextros, eller YPD-agarplatta. Låt dem växa i 48 timmar vid 30 grader Celsius för att få enstaka kolonier.Efter inkubation, inokulera enstaka kolonier från YPD-plattan och fem milliliter YPD-medium och inkubera vid 30 grader Celsius i 48 timmar med 250 rpm skakning. Cellerna befinner sig i den stationära tillväxtfasen efter denna inkubationsperiod. På en ny YPD-platta, rita parningseffektivitetsnätet som en rektangel på 1 x 1,5 centimeter uppdelad i tre lådor, var och en med en dimension på 1 x 0,5 centimeter.Inokulera fem mikroliter av YPD-kulturen av de två parningstyperna på rektanglarna längst till vänster och längst till höger. Denna volym motsvarar ungefär 5 gånger 10 till de femte haploida cellerna i varje sektion. Inkubera plattorna i 24 timmar vid 30 grader Celsius.För att blanda lika många jästceller, ta bort cirka 1/3 av jästtillväxten som utvecklats i ytterlådorna med en steril tandpetare och resuspendera de borttagna cellerna i 20 mikroliter vatten i en steril 1,5 ml injektionsflaska. Följ detta för varje haploid. Späd sedan fem mikroliter av denna suspension i två milliliter vatten och mät den optiska densiteten med en spektrofotometer vid 600 nanometer.Baserat på det optiska densitetsvärdet och antalet celler per milliliter vid en optisk densitet, tillsätt de erforderliga volymerna av båda haploiderna i en ny och steril 1,5 ml injektionsflaska. Blanda det väl med en pipett. Den slutliga volymen av denna suspension är i allmänhet cirka sex till åtta mikroliter.Därefter inokulera denna suspension i mittnätet. Inkubera plattan vid 30 grader Celsius i sju timmar, så att haploiderna kan para sig. Efter sju timmars inkubation, skrapa cellerna från mittrektangeln med en tandpetare eller en pipettspets och späd i två milliliter sterilt vatten.Utför ytterligare utspädningar och sprid sedan cellsuspensionen på YPD-agar för att erhålla enstaka kolonier. Efter plätering, inkubera YPD-plattorna vid 30 grader Celsius i 36 till 48 timmar för att utveckla enskilda kolonier. Se till att några hundra enskilda kolonier erhålls från varje parningsexperiment för screening för att säkerställa den statistiska signifikansen av data.För att identifiera de diploida kolonierna på plattan, överför de enskilda kolonierna genom att strecka dem individuellt på en dubbel drop-out-platta, utan de aminosyror som stammarna är auxotrofa för. Inkubera plattorna vid 30 grader Celsius i 48 timmar och beräkna parningseffektiviteten, nu. Protokollets robusthet möjliggjorde enkel differentiering av parningseffektiviteten mellan de två stammarna, SK1AM och ScAM.Medan SK1-stammarna parade sig med en mycket hög effektivitet, parade ScAM-stammarna med en relativt lägre effektivitet. Parningseffektiviteten hos ScAM-stammarna sjönk avsevärt när miljön inte innehöll glukos som primär kolkälla, vilket indikerar att parning är en energiskt dyr process och tillväxt på alternativa kolkällor kvalitativt minskar parningens effektivitet. När man fick para sig under olika tidsperioder observerades ingen parning under de första fyra till fem timmarna.De första diploiderna uppträdde först efter fyra till fem timmar, vilket indikerar att detta är den tid som behövs för att parningsprocessen ska slutföras i den givna miljön. Därefter ökade parningseffektiviteten snabbt. Efter sju timmar påverkades parningseffektivitetsberäkningarna av det faktum att mitotisk tillväxt började på plattan.Se till att lika många av båda haploiderna blandas. Avvikelser från detta skulle leda till variationer i oberoende upprepningar av protokollet. Hur genflödet påverkar anpassning och artbildning är en öppen fråga.Eftersom de auxotrofa markörerna sätts in bredvid MAT-locus i våra stammar, hjälper detta till att ta itu med denna viktiga fråga.

Research

JoVE Journal

Biology

Determination of the Mating Efficiency of Haploids in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Dissekering av Saccharomyces cerevisiae ASCI

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Kvantitativa Phosphoproteomics i Fatty Acid Stimulerade Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray Analys för Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

En fluorescensmikroskopi-analys för övervakning Mitophagy i jästen Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression och rening av den cystisk fibros transmembran konduktans-regulator protein i Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisering och analys av mRNA-molekyler användning av fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Kopplade Analyser för övervakning Proteinåterveckningssteg i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Rening av cystisk fibros transmembran konduktansregulator Protein Uttryckt i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

EPR Övervakad Redoxtitrering av kofaktorer av<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; NÄR1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Mätning av mRNA dämpfaktorer i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Använda<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Stammar

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...