Name: differentiation and imaging of brown adipocytes from the stromal vascular fraction of interscapular adipose tissue from newborn mice
Uploaded: 2023-02-03T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation and Imaging of Brown Adipocytes from the Stromal Vascular Fraction of Interscapular Adipose Tissue from Newborn Mice at JoVE.com

Le financement a été apporté par FONDECYT (1181214 et 1221146) et Anillos (ACT210039) à des bourses de VC et de doctorat, ANID 21171743 à l’AMF et ANID 21150665 à FS. Nous remercions Alejandro Munizaga pour son aide dans le traitement des échantillons et ses conseils techniques pour la microscopie électronique à transmission. Les illustrations ont été produites à l’aide de BioRender.

Les procédures pour les animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de la Pontificia Universidad Católica de Chile. Des souris nouveau-nées P0,5 des deux sexes, issues d’un mélange de souches C57BL/6J et 129J, ont été utilisées pour cette étude.
1. Extraction tissulaire
<ol><li>Nettoyez et désinfectez l’établi avec une solution d’éthanol à 70 % et utilisez du matériel chirurgical stérile.</li>
	<li>Eu...

<ol>
	<li>Luo, L., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+in+control+of+metabolism.">Adipose tissue in control of metabolism.</a> Journal of Endocrinology. 231 (3), 77-99 (2016).</li><li>Gaspar, R. C., Pauli, J. R., Shulman, G. I., Mu&#241;oz, V. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+bound+to+lipid+droplets:+Where+mitochondrial+dynamics+regulate+lipid+storage+and+utilization.">Mitochondria bound to lipid droplets: Where mitochondrial dynamics regulate lipid storage and utilization.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 827-835 (2019).</li><li>Lee, P., Swarbrick, M. M., Ho, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue+in+adult+humans:+A+metabolic+renaissance.">Brown adipose tissue in adult humans: A metabolic renaissance.</a> Endocrine Reviews. 34 (3), 413-438 (2013).</li><li>Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. 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L., Guerra, B. A., Boucher, J., Mori, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+to+induce+brown/beige+adipocyte+differentiation+from+murine+preadipocytes.">A Method to induce brown/beige adipocyte differentiation from murine preadipocytes.</a> Bio-protocol. 11 (24), 4265 (2021).</li><li>Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+primary+white+and+brown+preadipocytes+from+newborn+mice.">Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (167), e62005 (2021).</li><li>Tapia, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+AGPAT2+impairs+brown+adipogenesis,+increases+IFN+stimulated+gene+expression+and+alters+mitochondrial+morphology.">Absence of AGPAT2 impairs brown adipogenesis, increases IFN stimulated gene expression and alters mitochondrial morphology.</a> Metabolism. 111, 154341 (2020).</li><li>Gonz&#225;lez-H&#243;dar, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+caveolae+in+AGPAT2+lacking+adipocytes+is+independent+of+changes+in+cholesterol+or+sphingolipid+levels:+A+whole+cell+and+plasma+membrane+lipidomic+analysis+of+adipogenesis.">Decreased caveolae in AGPAT2 lacking adipocytes is independent of changes in cholesterol or sphingolipid levels: A whole cell and plasma membrane lipidomic analysis of adipogenesis.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1867 (9), 166167 (2021).</li><li>Fern&#225;ndez-Galilea, M., Tapia, P., Cautivo, K., Morselli, E., Cort&#233;s, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AGPAT2+deficiency+impairs+adipogenic+differentiation+in+primary+cultured+preadipocytes+in+a+non-autophagy+or+apoptosis+dependent+mechanism.">AGPAT2 deficiency impairs adipogenic differentiation in primary cultured preadipocytes in a non-autophagy or apoptosis dependent mechanism.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 467 (1), 39-45 (2015).</li><li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bicinchoninic+acid+(BCA)+assay+for+protein+quantitation.">The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation.</a> The Protein Protocols Handbook. , 11-15 (2009).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting.">Western blotting.</a> Methods. 38 (4), 283-293 (2006).</li><li>Reynolds, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+lead+citrate+at+high+pH+as+an+electron-opaque+stain+in+electron+microscopy.">The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).</li><li>Ghaben, A. L., Scherer, P. 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H., Zhang, S., Liang, B., Liu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+and+mitochondria+are+anchored+during+brown+adipocyte+differentiation.">Lipid droplets and mitochondria are anchored during brown adipocyte differentiation.</a> Protein &amp; Cell. 10 (12), 921-926 (2019).</li><li>Hao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indomethacin+enhances+brown+fat+activity.">Indomethacin enhances brown fat activity.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 365 (3), 467-475 (2018).</li><li>Lehmann, J. M., Lenhard, J. M., Oliver, B. B., Ringold, G. M., Kliewer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptors+alpha+and+gamma+are+activated+by+indomethacin+and+other+non-steroidal+anti-inflammatory+drugs.">Peroxisome proliferator-activated receptors alpha and gamma are activated by indomethacin and other non-steroidal anti-inflammatory drugs.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (6), 3406-3410 (1997).</li><li>Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+methods+of+adipogenic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells.">Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).</li><li>Wilson-Fritch, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+remodeling+in+adipose+tissue+associated+with+obesity+and+treatment+with+rosiglitazone.">Mitochondrial remodeling in adipose tissue associated with obesity and treatment with rosiglitazone.</a> The Journal of Clinical Investigation. 114 (9), 1281-1289 (2004).</li><li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue:+Function+and+physiological+significance.">Brown adipose tissue: Function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).</li><li>Ohno, H., Shinoda, K., Spiegelman, B. M., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPARgamma+agonists+induce+a+white-to-brown+fat+conversion+through+stabilization+of+PRDM16+protein.">PPARgamma agonists induce a white-to-brown fat conversion through stabilization of PRDM16 protein.</a> Cell Metabolism. 15 (3), 395-404 (2012).</li><li>Merlin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosiglitazone+and+a+&#946;3-adrenoceptor+agonist+are+both+required+for+functional+browning+of+white+adipocytes+in+culture.">Rosiglitazone and a &#946;3-adrenoceptor agonist are both required for functional browning of white adipocytes in culture.</a> Frontiers in Endocrinology. 9, 249 (2018).</li><li>Fayyad, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosiglitazone+enhances+browning+adipocytes+in+association+with+MAPK+and+PI3-K+pathways+during+the+differentiation+of+telomerase-transformed+mesenchymal+stromal+cells+into+adipocytes.">Rosiglitazone enhances browning adipocytes in association with MAPK and PI3-K pathways during the differentiation of telomerase-transformed mesenchymal stromal cells into adipocytes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1618-1633 (2019).</li><li>Zennaro, M. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hibernoma+development+in+transgenic+mice+identifies+brown+adipose+tissue+as+a+novel+target+of+aldosterone+action.">Hibernoma development in transgenic mice identifies brown adipose tissue as a novel target of aldosterone action.</a> The Journal of Clinical Investigation. 101 (6), 1254-1260 (1998).</li><li>Klaus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+novel+brown+adipocyte+cell+line+HIB+1B.+Adrenergic+pathways+involved+in+regulation+of+uncoupling+protein+gene+expression.">Characterization of the novel brown adipocyte cell line HIB 1B. Adrenergic pathways involved in regulation of uncoupling protein gene expression.</a> Journal of Cell Science. 107 (1), 313-319 (1994).</li><li>Guennoun, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+molecular+characterization+of+human+adipocytes+reveals+a+transient+brown+phenotype.">Comprehensive molecular characterization of human adipocytes reveals a transient brown phenotype.</a> Journal of Translational Medicine. 13, 135 (2015).</li></ol>

Le protocole actuel est une procédure de différenciation en deux phases simple et reproductible (Figure 2) pour générer des cellules présentant les caractéristiques moléculaires et morphologiques des adipocytes bruns matures. Le prélèvement chirurgical de l’iBAT est la première étape critique, car la déchirure tissulaire limite considérablement la viabilité du matériau de départ. Le traitement des tissus est également essentiel, car une suspension cellulaire homogène et e...

Les tissus adipeux blancs et bruns diffèrent par leur emplacement anatomique, leur origine cellulaire, leur fonction, leur morphologie et leur masse totale. Le tissu adipeux blanc (WAT) est le principal réservoir d’énergie physiologique du corps et stocke de grandes quantités de triacylglycérol (TAG) dans des cellules hautement spécialisées qui ont une seule gouttelette lipidique géante occupant la majeure partie de leur volume cellulaire1. La lipolyse TAG libère des acides gras libres, qui entrent dans la circulation systémique pour répondre aux besoins énergétiques pendant le jeûne ou d’autres états de bilan énergétique négatif. De plus, le WAT sécrète des protéines et des produits lipidiques, appelés respectivement adipokines et lipokines, qui ont des fonctions régulatrices métaboliques, immunitaires et reproductives, faisant ainsi du WAT le plus grand tissu endocrinien du corps2.
Le tissu adipeux brun (MTD) est un organe beaucoup plus petit dont la fonction physiologique principale est la thermogenèse sans frissons pour prévenir l’hypothermie. Chez les souris et les nouveau-nés, la MTD est un organe bien défini situé dans l’espace interscapulaire. Les humains adultes n’ont pas de BAT interscapulaire (iBAT) ; néanmoins, ils développent des amas de cellules brunes de type adipocytaire intégrées dans des dépôts qui comprennent autrement principalement du WAT. Ces adipocytes « brun en blanc » (brite) partagent des caractéristiques morphologiques et moléculaires avec les adipocytes iBAT classiques, mais ils ont une origine cellulaire différente 3,4.
Contrairement aux adipocytes blancs, les adipocytes bruns ont plusieurs petites gouttelettes lipidiques et des mitochondries abondantes5. La protéine de découplage 1 (UCP1, également connue sous le nom de thermogénine) est exprimée de manière unique par les adipocytes bruns et brites et médie la fuite de protons dans la membrane mitochondriale interne (IMM), découplant ainsi le transport d’électrons de la synthèse de l’ATP et générant de la chaleur. La thermogenèse non frissonnante dans la MTD est activée par la noradrénaline (NE), qui est libérée par les terminaisons sympathiques de la MTD en réponse à la stimulation par le froid6. L’NE se lie aux récepteurs bêta-adrénergiques (principalement bêta-3) à la surface des adipocytes bruns et déclenche une cascade de signalisation intracellulaire médiée par l’AMPc. Il en résulte une lipolyse TAG, la bêta-oxydation des acides gras mitochondriaux et une génération de chaleur lors de l’activation d’UCP13. La relation fonctionnelle étroite entre les gouttelettes lipidiques et les mitochondries dans les adipocytes bruns présente des parallèles structurels, tels que l’interaction entre ces organites dans des zones qui sont grandes et ont un contact physique très étroit 7,8.
iBAT a des vaisseaux sanguins abondants et des terminaisons sympathiques9. Ces structures, ainsi que les préadipocytes, les cellules immunitaires, les fibroblastes et les molécules de la matrice extracellulaire, composent la fraction vasculaire stromale adipeuse (SVF)10. De nombreux protocoles ont permis de générer des adipocytes matures à partir des préadipocytes 11,12,13,14,15 (tableau supplémentaire 1) ; Néanmoins, ils présentent des variations extrêmes dans le traitement des tissus et la composition des milieux de culture de différenciation. Le protocole décrit ici permet la différenciation efficace et reproductible des adipocytes bruns qui (1) expriment les facteurs de transcription adipogéniques clés PPARγ (PPARγ) et la protéine alpha de liaison à l’amplificateur (C/EBPα), (2) expriment les marqueurs adipocytaires matures périlipine1 (PLIN1) et le déterminant du cluster 36 (CD36), (3) accumulent des gouttelettes lipidiques abondantes, (4) ont une masse mitochondriale élevée et une grande abondance de complexes OXPHOS, (5) ont un potentiel thermogénique, tel que déterminé par des niveaux élevés d’UCP1, et (6) présentent des changements morphologiques mitochondriaux associés au phénotype des adipocytes bruns matures. Cette méthodologie est utilisée pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents à la lipodystrophie généralisée 15,16,17.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine Buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde Aqueous Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>410957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate&#160;</td>
			<td>SPL Life Science&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well optical black w/lid cell culture sterile</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>165305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuRuler RGB Plus Pre-stained Protein Ladder&#160;</td>
			<td>Maestrogen</td>
			<td>02102-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody&#160;&#160;</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>7074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blotting-grade blocker&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY 493/503&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C/EBP&#945; antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Calbiochem&#160;</td>
			<td>208291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD36 antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA1-16813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 100 &#181;m, nylon</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 40 &#181;m, nylon</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12500062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMBed-812 EMBEDDING KIT (Epon)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>100983&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>15023-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 25% Aqueous Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail 100X&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease Inhibitor Cocktail 100X&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF Membrane&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1620177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>I7378&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Calbiochem&#160;</td>
			<td>529552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>529568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lane Marker Reducing Sample Buffer&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>39000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water sterile&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitoprofile Total OXPHOS Rodent WB antibody Cocktail</td>
			<td>Abcam&#160;</td>
			<td>MS604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>1064041000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniPur&#160;10x PBS Liquid Concentrate</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>6505-OP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perilipin 1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPAR&#947; (81B8) antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer lysis&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>89901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>557366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacpdylate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos F200C G2</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOM20 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>42406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffered Saline (TBS-10X)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>12498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>H5152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCP1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>14670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracut R</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Westar Sun&#160;</td>
			<td>Cyanagen</td>
			<td>XLS063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Westar Supernova&#160;</td>
			<td>Cyanagen</td>
			<td>XLS3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation and imaging of brown adipocytes from the stromal vascular fraction of interscapular adipose tissue from newborn mice

Le tissu adipeux brun (MTD) n’est présent que chez les mammifères et a une fonction thermogénique. Les adipocytes bruns sont caractérisés par un cytoplasme multiloculaire avec de multiples gouttelettes lipidiques, un noyau central, un contenu mitochondrial élevé et l’expression de la protéine de découplage 1 (UCP1). La MTD a été proposée comme une cible thérapeutique potentielle pour l’obésité et ses troubles métaboliques associés en raison de sa capacité à dissiper l’énergie métabolique sous forme de chaleur. Pour étudier la fonction et la régulation des MTD, la culture des adipocytes bruns est indispensable. Le protocole actuel optimise le traitement des tissus et la différenciation cellulaire pour la culture d’adipocytes bruns à partir de souris nouveau-nées. De plus, des procédures d’imagerie d’adipocytes différenciés par immunofluorescence confocale et microscopie électronique à transmission sont présentées. Dans les adipocytes bruns différenciés avec les techniques décrites ici, les principales caractéristiques déterminantes de la BAT classique sont préservées, notamment des niveaux élevés d’UCP1, une augmentation de la masse mitochondriale et un contact physique très étroit entre les gouttelettes lipidiques et les mitochondries, faisant de cette méthode un outil précieux pour les études de BAT.

L’adipogenèse est régulée par un réseau de facteurs de transcription qui sont responsables à la fois de l’expression de protéines clés qui induisent la formation et le fonctionnement des adipocytes bruns22, y compris les régulateurs adipogéniques classiques tels que PPARγ et C/EBPα 23,24,25, ainsi que les marqueurs des adipocytes matures 26,27<sup class="x...

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Differentiation and Imaging of Brown Adipocytes from the Stromal Vascular Fraction of Interscapular Adipose Tissue from Newborn Mice

Les préadipocytes sont isolés de la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux brun interscapulaire de souris nouveau-nées et différenciés en cellules qui accumulent des gouttelettes lipidiques, expriment des marqueurs moléculaires et montrent la morphologie mitochondriale des adipocytes bruns matures. Ces cellules sont analysées par immunofluorescence et microscopie électronique à transmission.

Différenciation et imagerie des adipocytes bruns de la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux interscapulaire de souris nouveau-nées

Brown adipose tissue (BAT) is only present in mammals and has a thermogenic function. Brown adipocytes are characterized by a multilocular cytoplasm with ...

Ce protocole permet la différenciation efficace et reproductible des adipocytes bruns qui expriment les principaux facteurs de transcription adipogéniques, les marqueurs adipocytaires matures, et qui ont un potentiel thermogénique et un phénotype morphologique des adipocytes bruns matures. Il s’agit d’une procédure de différenciation en deux phases simple et reproductible permettant d’obtenir des cellules présentant des caractéristiques d’adipocytes bruns matures à partir de tissu adipeux brun interscapulaire de souris nouveau-nées. Ce protocole permet d’étudier les mécanismes d’activation du tissu adipeux brun comme cible pour le traitement de l’obésité.Il a été un modèle pour déterminer les mécanismes impliqués dans la physiopathologie de la lipodystrophie. Effectuer cette technique pour la première fois s’annonce difficile. Il est essentiel d’avoir un protocole détaillé et de mettre l’accent sur les points critiques pour avoir des résultats réussis.Pour commencer, placez la souris euthanasiée en position couchée et faites une incision cutanée d’un centimètre de long au milieu du dos de l’animal à l’aide de ciseaux tranchants. Retirez la peau avec précaution, détachez chirurgicalement l’iBAT de la carcasse à l’aide de petits ciseaux. Récoltez les deux lobes iBAT à l’aide d’une pince à pointe incurvée pour retirer les lobes indépendamment.Placez les deux lobes dans un tube en plastique avec 1,5 millilitre de PBS stérile à température ambiante. Incuber les tissus iBAT dans un tampon de digestion de type collagénase deux pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius avec une légère agitation continue à 800 tr/min. Perturber mécaniquement la suspension tissulaire dans le tampon de digestion de la collagénase de type deux en pipetant de haut en bas à l’aide d’une micropipette P1000 et d’embouts filtrants.Utilisez une nouvelle astuce pour chaque échantillon. Faites passer les tissus désagrégés à travers des crépines individuelles de 100 micromètres dans de nouveaux tubes de 1,5 millilitre. Ajoutez 500 microlitres de tampon ACK aux échantillons de tissus filtrés.Retournez les tubes quatre à cinq fois et incubez à température ambiante pendant quatre minutes. Ensuite, passez les suspensions à travers une crépine à cellules de 40 micromètres dans de nouveaux tubes de 1,5 millilitre à l’aide d’une micropipette P1000 et d’embouts filtrés. Centrifusion remet la pastille en suspension comme décrit dans le manuscrit du texte.Ensuite, ensemencez chaque échantillon dans six puits d’une plaque de culture de 24 puits en ajoutant un millilitre de suspension dans chaque puits. Les préadipocytes indifférenciés présentaient des niveaux très faibles ou indétectables de ppar-gamma, C/ebp-alpha, perilipin 1 et CD36. En revanche, ces marqueurs étaient significativement plus élevés au septième jour de différenciation.L’accumulation de plusieurs gouttelettes lipidiques dans les préadipocytes bruns était cohérente avec les résultats précédemment publiés. Une augmentation significative a été observée des niveaux de marqueur de masse mitochondriale TOM 20 et de protéine du complexe de phosphorylation oxydative au septième jour de la différenciation. UCP1, un marqueur de bonne foi de ce type de cellule, n’a pas été détecté dans les préadipocytes indifférenciés alors qu’il était substantiellement exprimé dans les adipocytes bruns matures au septième jour de la différenciation.Les mitochondries ont évolué d’une forme tubulaire allongée au jour zéro à une forme arrondie ou semblable à un haricot au septième jour. La structure interne mitochondriale a également été modifiée par l’adipogenèse, ce qui a entraîné une densité plus élevée des cristaux empilés parallèles. Il est important de noter que les mitochondries étaient intimement associées aux gouttelettes lipidiques dans les adipocytes bruns différenciés, de sorte qu’aucune distance discernable entre la membrane externe des mitochondries et les surfaces des gouttelettes lipidiques n’a pu être détectée, même avec la microscopie électronique à transmission à haute résolution.L’ablation chirurgicale du tissu adipeux interscapulaire est essentielle. Une quantité inefficace de tissu limite la disponibilité des cellules qui seront différenciées. Cette technique d’imagerie permet de caractériser la morphologie des adipocytes bruns différenciés in vitro.Il est possible d’effectuer des tests pour la fonction mitochondriale, l’activation bêta-androgène et l’inhibition autophagique.

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JoVE Journal

Biology

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