Name: differentiation and imaging of brown adipocytes from the stromal vascular fraction of interscapular adipose tissue from newborn mice
Uploaded: 2023-02-03T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation and Imaging of Brown Adipocytes from the Stromal Vascular Fraction of Interscapular Adipose Tissue from Newborn Mice at JoVE.com

자금은 FONDECYT (1181214 및 1221146)와 Anillos (ACT210039)가 VC 및 박사 장학금, ANID 21171743는 AMF에, ANID는 FS에 21150665 제공했습니다. Alejandro Munizaga에게 샘플 처리에 도움을 주고 투과 전자 현미경에 대한 기술적 조언을 해준 것에 대해 감사드립니다. 일러스트레이션은 BioRender를 사용하여 제작되었습니다.

동물 시술은 Pontificia Universidad Católica de Chile의 Institutional Animal Care and Use Committee에서 승인했습니다. C57BL/6J 및 129J 균주의 혼합 배경에서 파생된 남녀 모두의 P0.5 신생아 마우스가 이 연구에 사용되었습니다.
1. 조직 추출
<ol><li>70% 에탄올 용액으로 작업대를 청소 및 소독하고 멸균 수술 재료를 사용하십시오.</li>
	<li>P0.5 갓 태어난 새끼를 기관적으로 승인된 프로토...

<ol>
	<li>Luo, L., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+in+control+of+metabolism.">Adipose tissue in control of metabolism.</a> Journal of Endocrinology. 231 (3), 77-99 (2016).</li><li>Gaspar, R. C., Pauli, J. R., Shulman, G. I., Mu&#241;oz, V. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+bound+to+lipid+droplets:+Where+mitochondrial+dynamics+regulate+lipid+storage+and+utilization.">Mitochondria bound to lipid droplets: Where mitochondrial dynamics regulate lipid storage and utilization.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 827-835 (2019).</li><li>Lee, P., Swarbrick, M. M., Ho, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue+in+adult+humans:+A+metabolic+renaissance.">Brown adipose tissue in adult humans: A metabolic renaissance.</a> Endocrine Reviews. 34 (3), 413-438 (2013).</li><li>Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. 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L., Guerra, B. A., Boucher, J., Mori, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+to+induce+brown/beige+adipocyte+differentiation+from+murine+preadipocytes.">A Method to induce brown/beige adipocyte differentiation from murine preadipocytes.</a> Bio-protocol. 11 (24), 4265 (2021).</li><li>Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+primary+white+and+brown+preadipocytes+from+newborn+mice.">Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (167), e62005 (2021).</li><li>Tapia, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+AGPAT2+impairs+brown+adipogenesis,+increases+IFN+stimulated+gene+expression+and+alters+mitochondrial+morphology.">Absence of AGPAT2 impairs brown adipogenesis, increases IFN stimulated gene expression and alters mitochondrial morphology.</a> Metabolism. 111, 154341 (2020).</li><li>Gonz&#225;lez-H&#243;dar, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+caveolae+in+AGPAT2+lacking+adipocytes+is+independent+of+changes+in+cholesterol+or+sphingolipid+levels:+A+whole+cell+and+plasma+membrane+lipidomic+analysis+of+adipogenesis.">Decreased caveolae in AGPAT2 lacking adipocytes is independent of changes in cholesterol or sphingolipid levels: A whole cell and plasma membrane lipidomic analysis of adipogenesis.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1867 (9), 166167 (2021).</li><li>Fern&#225;ndez-Galilea, M., Tapia, P., Cautivo, K., Morselli, E., Cort&#233;s, V. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting.">Western blotting.</a> Methods. 38 (4), 283-293 (2006).</li><li>Reynolds, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+lead+citrate+at+high+pH+as+an+electron-opaque+stain+in+electron+microscopy.">The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).</li><li>Ghaben, A. L., Scherer, P. 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H., Zhang, S., Liang, B., Liu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+and+mitochondria+are+anchored+during+brown+adipocyte+differentiation.">Lipid droplets and mitochondria are anchored during brown adipocyte differentiation.</a> Protein &amp; Cell. 10 (12), 921-926 (2019).</li><li>Hao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indomethacin+enhances+brown+fat+activity.">Indomethacin enhances brown fat activity.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 365 (3), 467-475 (2018).</li><li>Lehmann, J. M., Lenhard, J. M., Oliver, B. B., Ringold, G. M., Kliewer, S. 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M., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPARgamma+agonists+induce+a+white-to-brown+fat+conversion+through+stabilization+of+PRDM16+protein.">PPARgamma agonists induce a white-to-brown fat conversion through stabilization of PRDM16 protein.</a> Cell Metabolism. 15 (3), 395-404 (2012).</li><li>Merlin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosiglitazone+and+a+&#946;3-adrenoceptor+agonist+are+both+required+for+functional+browning+of+white+adipocytes+in+culture.">Rosiglitazone and a &#946;3-adrenoceptor agonist are both required for functional browning of white adipocytes in culture.</a> Frontiers in Endocrinology. 9, 249 (2018).</li><li>Fayyad, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosiglitazone+enhances+browning+adipocytes+in+association+with+MAPK+and+PI3-K+pathways+during+the+differentiation+of+telomerase-transformed+mesenchymal+stromal+cells+into+adipocytes.">Rosiglitazone enhances browning adipocytes in association with MAPK and PI3-K pathways during the differentiation of telomerase-transformed mesenchymal stromal cells into adipocytes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1618-1633 (2019).</li><li>Zennaro, M. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hibernoma+development+in+transgenic+mice+identifies+brown+adipose+tissue+as+a+novel+target+of+aldosterone+action.">Hibernoma development in transgenic mice identifies brown adipose tissue as a novel target of aldosterone action.</a> The Journal of Clinical Investigation. 101 (6), 1254-1260 (1998).</li><li>Klaus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+novel+brown+adipocyte+cell+line+HIB+1B.+Adrenergic+pathways+involved+in+regulation+of+uncoupling+protein+gene+expression.">Characterization of the novel brown adipocyte cell line HIB 1B. Adrenergic pathways involved in regulation of uncoupling protein gene expression.</a> Journal of Cell Science. 107 (1), 313-319 (1994).</li><li>Guennoun, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+molecular+characterization+of+human+adipocytes+reveals+a+transient+brown+phenotype.">Comprehensive molecular characterization of human adipocytes reveals a transient brown phenotype.</a> Journal of Translational Medicine. 13, 135 (2015).</li></ol>

본 프로토콜은 성숙한 갈색 지방세포의 분자 및 형태학적 특성을 가진 세포를 생성하기 위한 간단하고 복제 가능한 2상 분화 절차(그림 2)입니다. 조직 파괴는 시작 물질의 생존력을 심각하게 제한하기 때문에 iBAT의 외과적 채취는 첫 번째 중요한 단계입니다. 조직 처리도 중요한데, 이물질이 없는 균질한 세포 현탁액은 배양할 수 있는 SVF의 양을 크게 증가시키기 때문입니다...

백색과 갈색 지방 조직은 해부학적 위치, 세포 기원, 기능, 형태 및 총 질량이 다릅니다. 백색 지방 조직(WAT)은 신체의 주요 생리적 에너지 저장소이며, 세포 부피의 대부분을 차지하는 단일 거대 지질 방울이 있는 고도로 전문화된 세포에 다량의 트리아실글리세롤(TAG)을 저장합니다1. TAG 지방 분해는 유리 지방산을 방출하여 단식 또는 기타 음의 에너지 균형 상태에서 에너지 수요를 충족시키기 위해 전신 순환에 들어갑니다. 또한 WAT는 대사, 면역 및 생식 조절 기능을 가진 아디포카인과 리포카인이라고 하는 단백질 및 지질 제품을 각각 분비하므로 WAT는 신체에서 가장 큰 내분비 조직입니다2.
갈색 지방 조직(BAT)은 저체온증을 예방하기 위해 떨리지 않는 열발생을 주요 생리적 기능으로 하는 훨씬 작은 장기입니다. 생쥐와 신생아에서 BAT는 견갑간 공간에 위치한 잘 정의된 장기입니다. 성인은 견갑간 BAT(iBAT)가 없습니다. 그럼에도 불구하고, 그들은 대부분 WAT를 구성하는 저장소에 통합된 갈색 지방세포와 같은 세포의 클러스터를 발달시킵니다. 이러한 "갈색-백색"(brite) 지방세포는 기존의 iBAT 지방세포와 형태학적 및 분자적 특징을 공유하지만 세포 기원은 다릅니다 3,4.
백색 지방세포와 대조적으로, 갈색 지방세포는 여러 개의 작은 지질 방울과 풍부한 미토콘드리아를 가지고있다 5. 분리 단백질 1(UCP1, 열원소라고도 함)은 갈색 및 영국산 지방 세포에 의해 고유하게 발현되며 내부 미토콘드리아 막(IMM)에서 양성자 누출을 매개하여 ATP 합성에서 전자 수송을 분리하고 열을 생성합니다. BAT에서 떨리지 않는 열발생은 노르에피네프린(NE)에 의해 활성화되며, 노르에피네프린은 차가운 자극에 대한 반응으로 BAT의 교감신경 말단에서 방출된다6. NE는 갈색 지방세포 표면의 베타 아드레날린 수용체(대부분 베타 3)에 결합하여 세포 내 cAMP 매개 신호 전달 캐스케이드를 유발합니다. 그 결과 TAG 지방 분해, 미토콘드리아 지방산의 베타 산화 및 UCP1 활성화시 열 생성이 발생합니다3. 갈색 지방세포에서 지질 방울과 미토콘드리아 사이의 밀접한 기능적 관계는 크고 매우 밀접한 물리적 접촉을 갖는 영역에서 이러한 소기관 간의 상호 작용과 같은 구조적 유사성을 가지고 있습니다 7,8.
아이밧은 풍부한 혈관과 교감신경 말단을 가지고 있다9. 이러한 구조는 지방세포, 면역세포, 섬유아세포 및 세포외 기질 분자와 함께 지방이 풍부한 기질 혈관 분획(SVF)을 구성합니다10. 많은 프로토콜이 지방세포(preadipocyte) 11,12,13,14,15로부터 성숙한 지방세포를 생성하는 것으로 보고되었다(보충 표 1); 그럼에도 불구하고, 그들은 조직 처리 및 분화 배양 배지의 구성에서 극단적인 변화를 나타냅니다. 본원에 기술된 프로토콜은 (1) 주요 지방생성 전사 인자인 과산화시좀 증식제 활성화 수용체 감마(PPARγ) 및 CCAAT/인핸서-결합 단백질 알파(C/EBPα)를 발현하고, (2) 성숙한 지방세포 마커인 페리리핀1(PLIN1) 및 클러스터 결정인자 36(CD36)을 발현하고, (3) 풍부한 지질 방울을 축적하고, (4) 높은 미토콘드리아 질량 및 높은 풍부의 OXPHOS 복합체를 갖는 갈색 지방세포의 효율적이고 재현 가능한 분화를 가능하게 하며, (5) 높은 수준의 UCP1에 의해 결정되는 열발생 전위가 있고 (6) 성숙한 갈색 지방세포의 표현형과 관련된 미토콘드리아 형태학적 변화가 있습니다. 이 방법론은 일반화된 지방이영양증 15,16,17의 기초가 되는 분자 메커니즘을 연구하는 데 사용됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine Buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde Aqueous Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>410957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate&#160;</td>
			<td>SPL Life Science&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well optical black w/lid cell culture sterile</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>165305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuRuler RGB Plus Pre-stained Protein Ladder&#160;</td>
			<td>Maestrogen</td>
			<td>02102-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody&#160;&#160;</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>7074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blotting-grade blocker&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY 493/503&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C/EBP&#945; antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Calbiochem&#160;</td>
			<td>208291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD36 antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA1-16813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 100 &#181;m, nylon</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 40 &#181;m, nylon</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12500062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMBed-812 EMBEDDING KIT (Epon)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>100983&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>15023-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 25% Aqueous Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail 100X&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease Inhibitor Cocktail 100X&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF Membrane&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1620177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>I7378&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Calbiochem&#160;</td>
			<td>529552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>529568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lane Marker Reducing Sample Buffer&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>39000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water sterile&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitoprofile Total OXPHOS Rodent WB antibody Cocktail</td>
			<td>Abcam&#160;</td>
			<td>MS604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>1064041000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniPur&#160;10x PBS Liquid Concentrate</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>6505-OP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perilipin 1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPAR&#947; (81B8) antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer lysis&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>89901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>557366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacpdylate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos F200C G2</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOM20 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>42406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffered Saline (TBS-10X)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>12498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>H5152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCP1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>14670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracut R</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Westar Sun&#160;</td>
			<td>Cyanagen</td>
			<td>XLS063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Westar Supernova&#160;</td>
			<td>Cyanagen</td>
			<td>XLS3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation and imaging of brown adipocytes from the stromal vascular fraction of interscapular adipose tissue from newborn mice

갈색 지방 조직(BAT)은 포유류에만 존재하며 발열 기능이 있습니다. 갈색 지방세포는 여러 개의 지질 방울이 있는 다엽 세포질, 중심핵, 높은 미토콘드리아 함량 및 결합 해제 단백질 1(UCP1)의 발현을 특징으로 합니다. BAT는 대사 에너지를 열로 발산하는 능력으로 인해 비만 및 관련 대사 장애에 대한 잠재적인 치료 대상으로 제안되었습니다. BAT 기능 및 조절을 연구하기 위해서는 갈색 지방세포 배양이 필수적입니다. 본 프로토콜은 신생아 마우스에서 갈색 지방 세포를 배양하기 위해 조직 처리 및 세포 분화를 최적화합니다. 또한 confocal immunofluorescence 및 transmission electron microscopy를 사용하여 분화된 지방세포를 이미징하는 절차를 보여줍니다. 본 명세서에 기술된 기법으로 분화된 갈색 지방세포에서는 높은 UCP1 수준, 미토콘드리아 질량 증가, 지질 방울과 미토콘드리아 사이의 매우 밀접한 물리적 접촉을 포함하여 기존 BAT의 주요 특징이 보존되어 이 방법을 BAT 연구에 유용한 도구로 만듭니다.

지방 형성은 갈색 지방 세포 형성을 유도하고 기능하는 주요 단백질의 발현을 담당하는 전사 인자 네트워크에 의해 조절됩니다22 PPARγ 및 C/EBPα 23,24,25와 같은 고전적인 지방 생성 조절제와 성숙한 지방 세포의 마커를 포함합니다 26,27. 열발생 갈색 지방 표현형의 ?...

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Differentiation and Imaging of Brown Adipocytes from the Stromal Vascular Fraction of Interscapular Adipose Tissue from Newborn Mice

지방세포는 갓 태어난 마우스의 견갑골 간 갈색 지방 조직의 기질 혈관 분획에서 분리하여 지질 방울을 축적하고 분자 마커를 발현하며 성숙한 갈색 지방세포의 미토콘드리아 형태를 보여주는 세포로 분화합니다. 이러한 세포는 면역 형광 및 투과 전자 현미경으로 추가로 분석됩니다.

Differentiation and Imaging of brown adipocytes from the Stromal Vascular Fraction of Interscapular Adipose Tissue from Newborn Mice(신생아 마우스의 견갑간 지방 조직의 기질 혈관 분획에서 갈색 지방세포의 분화 및 이미징)

Brown adipose tissue (BAT) is only present in mammals and has a thermogenic function. Brown adipocytes are characterized by a multilocular cytoplasm with ...

이 프로토콜은 주요 지방형성 전사 인자, 성숙한 지방세포 마커를 발현하고 성숙한 갈색 지방세포의 열발생 전위 및 형태학적 표현형을 갖는 갈색 지방세포의 효율적이고 재현성 있는 분화를 가능하게 합니다. 이것은 신생아 마우스의 견갑골 간 갈색 지방 조직에서 성숙한 갈색 지방 세포의 특성을 가진 세포를 얻기 위한 간단하고 복제 가능한 2상 분화 절차입니다. 이 프로토콜은 비만 치료를 위한 표적으로 갈색 지방 조직의 활성화 메커니즘을 연구할 수 있도록 합니다.그것은 지방이영양증의 병태생리학에 관련된 메커니즘을 결정하기 위한 모델이었습니다. 이 기술을 처음 수행하는 것은 어려울 것으로 예상됩니다. 성공적인 결과를 얻기 위해서는 상세한 프로토콜을 갖고 중요한 점을 강조하는 것이 중요합니다.먼저 안락사된 쥐를 엎드린 자세로 놓고 날카로운 가위를 사용하여 동물의 등 중간 부분을 1cm 길이의 피부를 절개합니다. 피부를 조심스럽게 제거하고 작은 가위를 사용하여 시체에서 iBAT를 외과적으로 분리합니다. 커브 팁 플라이어를 사용하여 두 iBAT 로브를 모두 수확하여 로브를 독립적으로 제거합니다.실온에서 1.5ml의 멸균 PBS가 들어 있는 플라스틱 튜브에 두 개의 로브를 넣습니다. 콜라겐분해효소 2형 분해 완충액에서 iBAT 조직을 섭씨 37도에서 45분 동안 800RPM으로 지속적으로 부드럽게 흔들어 배양합니다. P1000 마이크로피펫과 필터 팁을 사용하여 위아래로 피펫팅하여 콜라겐분해효소 유형 2 분해 완충액의 조직 현탁액을 기계적으로 파괴합니다.각 샘플에 대해 새 팁을 사용하십시오. 분리되지 않은 조직을 개별 100마이크로미터 세포 여과기를 통해 새로운 1.5밀리리터 튜브에 통과시킵니다. 500 마이크로리터의 ACK 완충액을 여과된 조직 샘플에 추가합니다.튜브를 4-5회 뒤집어 놓고 실온에서 4분 동안 배양합니다. 그런 다음 P1000 마이크로피펫과 여과된 팁을 사용하여 40마이크로미터 세포 여과기를 통해 현탁액을 새로운 1.5밀리리터 튜브에 통과시킵니다. 원심 융합은 텍스트 원고에 설명 된대로 펠릿을 재현탁시킵니다.그런 다음 각 웰에 현탁액 1m리터를 추가하여 각 샘플을 24웰 배양 플레이트의 6개 웰에 파종합니다. 미분화 지방세포는 매우 낮거나 검출할 수 없는 수준의 ppar-gamma, C/ebp-alpha, perilipin 1 및 CD36을 나타냈습니다. 대조적으로, 이러한 마커는 분화 7일째에 유의하게 높았습니다.갈색 지방세포에 여러 지질 방울이 축적된 것은 이전에 발표된 결과와 일치했습니다. 미토콘드리아 질량 마커 TOM 20과 산화적 인산화 복합체 단백질 수준이 분화 7일째에 유의한 증가가 관찰되었습니다. 이 세포 유형의 선의의 마커인 UCP1은 분화 7일째에 성숙한 갈색 지방세포에서 실질적으로 발현된 반면, 미분화 지방세포에서는 검출되지 않았습니다.미토콘드리아는 0일째에 길쭉한 관 모양에서 7일째에 둥글거나 콩 같은 모양으로 진화했습니다. 미토콘드리아 내부 구조는 또한 지방 형성에 의해 수정되어 평행하게 포장된 크리스타의 밀도가 높아졌습니다. 중요한 것은 미토콘드리아가 분화된 갈색 지방세포의 지질 방울과 밀접하게 연관되어 있었기 때문에 미토콘드리아의 외막과 지질 방울의 표면 사이의 식별 가능한 거리는 고해상도 투과 전자 현미경으로도 감지할 수 없었다는 것입니다.견갑골 간 지방 조직의 수술적 제거는 매우 중요합니다. 비효율적인 조직의 양은 분화될 세포의 가용성을 제한합니다. 이 이미징 기법은 in vitro에서 분화된 갈색 지방세포의 형태를 특성화하는 데 도움이 됩니다.미토콘드리아 기능, 베타 안드로겐 활성화 및 자가포식 억제에 대한 분석을 수행할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

FDG micro-PET/CT와 마우스의 브라운 지방의 기능 영상

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose  tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich  vascularization and high ...

연구

생물학

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

베이지 / Brite 셀에 Stromal 혈관 세포의 분리와 차별화

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-지우기: 조직 지방 조직의 3 차원 이미징 방법 삭제

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice

신생아 마우스에서 기본 백색및 갈색 프레드포스세포의 격리 및 분화

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white ...

Visualization and Quantification of Brown and Beige Adipose Tissues in Mice using [18F]FDG Micro-PET/MR Imaging

Visualization and Quantification of Brown and Beige Adipose Tissues in Mice using [18F]FDG Micro-PET/MR Imaging

[18F]FDG 마이크로 PET/MR 이미징을 사용한 마우스의 갈색 및 베이지 지방 조직의 시각화 및 정량화

Brown and beige adipocytes are now recognized as potential therapeutic targets for obesity and metabolic syndromes. Non-invasive molecular imaging methods ...

murine white 지방 조직의 반자동 분리

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

저자 스포트라이트: 조직 해리제를 사용하여 Murine White 지방 조직에서 기질 혈관 분획의 반자동 분리  

조직 해리기를 사용하여 쥐 백색 지방 조직에서 기질 혈관 분획의 반자동 분리

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...

Murine Perivascular Adipose Tissue에서 분리된 지방세포(preadipocytes) 배양

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Stromal Vascular Fraction-derived Preadipocytes from Mouse Periaortic Adipose Tissue

저자 스포트라이트: 마우스 혈관 주위 지방 조직에서 SVF 유래 지방세포의 분리, 배양 및 지방형성 유도의 중요성 

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Stromal Vascular Fraction-derived Preadipocytes from Mouse Periaortic Adipose Tissue(마우스 대동맥 주위 지방 조직에서 기질 혈관 분획 유래 지방세포의 분리, 배양 및 지방 유도)