Name: differentiation and imaging of brown adipocytes from the stromal vascular fraction of interscapular adipose tissue from newborn mice
Uploaded: 2023-02-03T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation and Imaging of Brown Adipocytes from the Stromal Vascular Fraction of Interscapular Adipose Tissue from Newborn Mice at JoVE.com

Finansiering ble gitt av FONDECYT (1181214 og 1221146) og Anillos (ACT210039) til VC og doktorgradsstipend ANID 21171743 til AMF og ANID 21150665 til FS. Vi takker Alejandro Munizaga for hjelp med behandlingen av prøvene og tekniske råd for transmisjonselektronmikroskopien. Illustrasjonene ble produsert ved hjelp av BioRender.

Dyreprosedyrene ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Pontificia Universidad Católica de Chile. P0.5 nyfødte mus av begge kjønn, avledet fra en blandet bakgrunn av C57BL/6J og 129J stammer, ble brukt til denne studien.
1. Vev ekstraksjon
<ol><li>Rengjør og desinfiser arbeidsbenken med en 70 % etanolløsning, og bruk sterilt kirurgisk materiale.</li>
	<li>Avlive P0.5 nyfødte unger ved halshugging med kirurgisk saks i henhold til institusjonelt g...

<ol>
	<li>Luo, L., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+in+control+of+metabolism.">Adipose tissue in control of metabolism.</a> Journal of Endocrinology. 231 (3), 77-99 (2016).</li><li>Gaspar, R. C., Pauli, J. R., Shulman, G. I., Mu&#241;oz, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+update+on+brown+adipose+tissue+biology:+A+discussion+of+recent+findings.">An update on brown adipose tissue biology: A discussion of recent findings.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 320 (3), 488-495 (2021).</li><li>Richard, D., Picard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+fat+biology+and+thermogenesis.">Brown fat biology and thermogenesis.</a> Frontiers in Bioscience. 16, 1233-1260 (2011).</li><li>Rosenwald, M., Wolfrum, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+definition+of+brite+versus+white+and+classical+brown+adipocytes.">The origin and definition of brite versus white and classical brown adipocytes.</a> Adipocyte. 3 (1), 4-9 (2014).</li><li>Smorlesi, A., Frontini, A., Giordano, A., Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adipose+organ:+White-brown+adipocyte+plasticity+and+metabolic+inflammation.">The adipose organ: White-brown adipocyte plasticity and metabolic inflammation.</a> Obesity Reviews. 13, 83-96 (2012).</li><li>Townsend, K., Tseng, Y. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue:+Recent+insights+into+development,+metabolic+function+and+therapeutic+potential.">Brown adipose tissue: Recent insights into development, metabolic function and therapeutic potential.</a> Adipocyte. 1 (1), 13-24 (2012).</li><li>Benador, I. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+bound+to+lipid+droplets+have+unique+bioenergetics,+composition,+and+dynamics+that+support+lipid+droplet+expansion.">Mitochondria bound to lipid droplets have unique bioenergetics, composition, and dynamics that support lipid droplet expansion.</a> Cell Metabolism. 27 (4), 869-885 (2018).</li><li>Benador, I. Y., Veliova, M., Liesa, M., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+bound+to+lipid+droplets:+Where+mitochondrial+dynamics+regulate+lipid+storage+and+utilization.">Mitochondria bound to lipid droplets: Where mitochondrial dynamics regulate lipid storage and utilization.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 827-835 (2019).</li><li>Lee, P., Swarbrick, M. M., Ho, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue+in+adult+humans:+A+metabolic+renaissance.">Brown adipose tissue in adult humans: A metabolic renaissance.</a> Endocrine Reviews. 34 (3), 413-438 (2013).</li><li>Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stromal+vascular+fraction+cells:+Update+on+clinical+utility+and+efficacy.">Adipose-derived stromal vascular fraction cells: Update on clinical utility and efficacy.</a> Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).</li><li>Klein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta(3)-adrenergic+stimulation+differentially+inhibits+insulin+signaling+and+decreases+insulin-induced+glucose+uptake+in+brown+adipocytes.">Beta(3)-adrenergic stimulation differentially inhibits insulin signaling and decreases insulin-induced glucose uptake in brown adipocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (3), 34795-34802 (1999).</li><li>Gaom, W., Kong, X., Yang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+primary+culture,+and+differentiation+of+preadipocytes+from+mouse+brown+adipose+tissue.">Isolation, primary culture, and differentiation of preadipocytes from mouse brown adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 1566, 3-8 (2017).</li><li>Rocha, A. L., Guerra, B. A., Boucher, J., Mori, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+to+induce+brown/beige+adipocyte+differentiation+from+murine+preadipocytes.">A Method to induce brown/beige adipocyte differentiation from murine preadipocytes.</a> Bio-protocol. 11 (24), 4265 (2021).</li><li>Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+primary+white+and+brown+preadipocytes+from+newborn+mice.">Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (167), e62005 (2021).</li><li>Tapia, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+AGPAT2+impairs+brown+adipogenesis,+increases+IFN+stimulated+gene+expression+and+alters+mitochondrial+morphology.">Absence of AGPAT2 impairs brown adipogenesis, increases IFN stimulated gene expression and alters mitochondrial morphology.</a> Metabolism. 111, 154341 (2020).</li><li>Gonz&#225;lez-H&#243;dar, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+caveolae+in+AGPAT2+lacking+adipocytes+is+independent+of+changes+in+cholesterol+or+sphingolipid+levels:+A+whole+cell+and+plasma+membrane+lipidomic+analysis+of+adipogenesis.">Decreased caveolae in AGPAT2 lacking adipocytes is independent of changes in cholesterol or sphingolipid levels: A whole cell and plasma membrane lipidomic analysis of adipogenesis.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1867 (9), 166167 (2021).</li><li>Fern&#225;ndez-Galilea, M., Tapia, P., Cautivo, K., Morselli, E., Cort&#233;s, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AGPAT2+deficiency+impairs+adipogenic+differentiation+in+primary+cultured+preadipocytes+in+a+non-autophagy+or+apoptosis+dependent+mechanism.">AGPAT2 deficiency impairs adipogenic differentiation in primary cultured preadipocytes in a non-autophagy or apoptosis dependent mechanism.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 467 (1), 39-45 (2015).</li><li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bicinchoninic+acid+(BCA)+assay+for+protein+quantitation.">The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation.</a> The Protein Protocols Handbook. , 11-15 (2009).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting.">Western blotting.</a> Methods. 38 (4), 283-293 (2006).</li><li>Reynolds, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+lead+citrate+at+high+pH+as+an+electron-opaque+stain+in+electron+microscopy.">The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).</li><li>Ghaben, A. L., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipogenesis+and+metabolic+health.">Adipogenesis and metabolic health.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (4), 242-258 (2019).</li><li>Ambele, M. A., Dhanraj, P., Giles, R., Pepper, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipogenesis:+A+complex+interplay+of+multiple+molecular+determinants+and+pathways.">Adipogenesis: A complex interplay of multiple molecular determinants and pathways.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 4283 (2020).</li><li>Lefterova, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPAR&#947;+and+C/EBP+factors+orchestrate+adipocyte+biology+via+adjacent+binding+on+a+genome-wide+scale.">PPAR&#947; and C/EBP factors orchestrate adipocyte biology via adjacent binding on a genome-wide scale.</a> Genes &amp; Development. 22 (21), 2941-2952 (2008).</li><li>Ntambi, J. M., Young-Cheul, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+differentiation+and+gene+expression.">Adipocyte differentiation and gene expression.</a> The Journal of Nutrition. 130 (12), (2000).</li><li>Itabe, H., Yamaguchi, T., Nimura, S., Sasabe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perilipins:+A+diversity+of+intracellular+lipid+droplet+proteins.">Perilipins: A diversity of intracellular lipid droplet proteins.</a> Lipids in Health and Disease. 16, 83 (2017).</li><li>Christiaens, V., Van Hul, M., Lijnen, H. R., Scroyen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD36+promotes+adipocyte+differentiation+and+adipogenesis.">CD36 promotes adipocyte differentiation and adipogenesis.</a> Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1820 (7), 949-956 (2012).</li><li>Carobbio, S., Rosen, B., Vidal-Puig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipogenesis:+New+insights+into+brown+adipose+tissue+differentiation.">Adipogenesis: New insights into brown adipose tissue differentiation.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 51 (3), 75-85 (2013).</li><li>Ricquier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+protein+1+of+brown+adipocytes,+the+only+uncoupler:+A+historical+perspective.">Uncoupling protein 1 of brown adipocytes, the only uncoupler: A historical perspective.</a> Frontiers in Endocrinology. 2, 85-91 (2011).</li><li>Cui, L., Mirza, A. H., Zhang, S., Liang, B., Liu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+and+mitochondria+are+anchored+during+brown+adipocyte+differentiation.">Lipid droplets and mitochondria are anchored during brown adipocyte differentiation.</a> Protein &amp; Cell. 10 (12), 921-926 (2019).</li><li>Hao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indomethacin+enhances+brown+fat+activity.">Indomethacin enhances brown fat activity.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 365 (3), 467-475 (2018).</li><li>Lehmann, J. M., Lenhard, J. M., Oliver, B. B., Ringold, G. M., Kliewer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptors+alpha+and+gamma+are+activated+by+indomethacin+and+other+non-steroidal+anti-inflammatory+drugs.">Peroxisome proliferator-activated receptors alpha and gamma are activated by indomethacin and other non-steroidal anti-inflammatory drugs.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (6), 3406-3410 (1997).</li><li>Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+methods+of+adipogenic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells.">Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).</li><li>Wilson-Fritch, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+remodeling+in+adipose+tissue+associated+with+obesity+and+treatment+with+rosiglitazone.">Mitochondrial remodeling in adipose tissue associated with obesity and treatment with rosiglitazone.</a> The Journal of Clinical Investigation. 114 (9), 1281-1289 (2004).</li><li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue:+Function+and+physiological+significance.">Brown adipose tissue: Function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).</li><li>Ohno, H., Shinoda, K., Spiegelman, B. M., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPARgamma+agonists+induce+a+white-to-brown+fat+conversion+through+stabilization+of+PRDM16+protein.">PPARgamma agonists induce a white-to-brown fat conversion through stabilization of PRDM16 protein.</a> Cell Metabolism. 15 (3), 395-404 (2012).</li><li>Merlin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosiglitazone+and+a+&#946;3-adrenoceptor+agonist+are+both+required+for+functional+browning+of+white+adipocytes+in+culture.">Rosiglitazone and a &#946;3-adrenoceptor agonist are both required for functional browning of white adipocytes in culture.</a> Frontiers in Endocrinology. 9, 249 (2018).</li><li>Fayyad, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosiglitazone+enhances+browning+adipocytes+in+association+with+MAPK+and+PI3-K+pathways+during+the+differentiation+of+telomerase-transformed+mesenchymal+stromal+cells+into+adipocytes.">Rosiglitazone enhances browning adipocytes in association with MAPK and PI3-K pathways during the differentiation of telomerase-transformed mesenchymal stromal cells into adipocytes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1618-1633 (2019).</li><li>Zennaro, M. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hibernoma+development+in+transgenic+mice+identifies+brown+adipose+tissue+as+a+novel+target+of+aldosterone+action.">Hibernoma development in transgenic mice identifies brown adipose tissue as a novel target of aldosterone action.</a> The Journal of Clinical Investigation. 101 (6), 1254-1260 (1998).</li><li>Klaus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+novel+brown+adipocyte+cell+line+HIB+1B.+Adrenergic+pathways+involved+in+regulation+of+uncoupling+protein+gene+expression.">Characterization of the novel brown adipocyte cell line HIB 1B. Adrenergic pathways involved in regulation of uncoupling protein gene expression.</a> Journal of Cell Science. 107 (1), 313-319 (1994).</li><li>Guennoun, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+molecular+characterization+of+human+adipocytes+reveals+a+transient+brown+phenotype.">Comprehensive molecular characterization of human adipocytes reveals a transient brown phenotype.</a> Journal of Translational Medicine. 13, 135 (2015).</li></ol>

Denne protokollen er en enkel og replikerbar to-fase differensieringsprosedyre (figur 2) for å generere celler med de molekylære og morfologiske egenskapene til modne brune adipocytter. Den kirurgiske høstingen av iBAT er det første kritiske trinnet fordi vevsrivning sterkt begrenser levedyktigheten til utgangsmaterialet. Vevsbehandling er også nøkkelen fordi en homogen cellesuspensjon som er fri for rusk øker mengden SVF som kan dyrkes betraktelig. I den nåværende studien ble filtr...

Hvitt og brunt fettvev er forskjellig i anatomisk plassering, cellulær opprinnelse, funksjon, morfologi og total masse. Hvitt fettvev (WAT) er det viktigste fysiologiske energireservoaret i kroppen og lagrer store mengder triacylglyserol (TAG) i høyt spesialiserte celler som har en enkelt gigantisk lipiddråpe som opptar det meste av deres cellulære volum1. TAG-lipolyse frigjør frie fettsyrer, som kommer inn i den systemiske sirkulasjonen for å møte energibehovet under faste eller andre tilstander med negativ energibalanse. I tillegg skiller WAT ut protein- og lipidprodukter, kalt henholdsvis adipokiner og lipokiner, som har metabolske, immun- og reproduktive regulerende funksjoner, og gjør dermed WAT til det største endokrine vevet i kroppen2.
Brunt fettvev (BAT) er et mye mindre organ hvis viktigste fysiologiske funksjon er ikke-skjelvende termogenese for å forhindre hypotermi. Hos mus og nyfødte mennesker er BAT et veldefinert organ som ligger i det interscapulære rommet. Voksne mennesker mangler interscapular BAT (iBAT); likevel utvikler de klynger av brune adipocyttlignende celler integrert i depoter som ellers for det meste utgjør WAT. Disse "brun-i-hvite" (brite) adipocyttene deler morfologiske og molekylære trekk med klassiske iBAT-adipocytter, men de har en annen cellulær opprinnelse 3,4.
I motsetning til hvite adipocytter har brune adipocytter flere små lipiddråper og rikelig med mitokondrier5. Frakobling av protein 1 (UCP1, også kjent som termogenin) uttrykkes unikt av brune og brite adipocytter og formidler protonlekkasje i den indre mitokondriemembranen (IMM), og kobler dermed elektrontransport fra ATP-syntese og genererer varme. Ikke-skjelvende termogenese i BAT aktiveres av noradrenalin (NE), som frigjøres fra de sympatiske terminalene i BAT som respons på kuldestimulering6. NE binder seg til beta-adrenoceptorer (for det meste beta 3) på overflaten av brune adipocytter og utløser en intracellulær cAMP-mediert signalkaskade. Dette resulterer i TAG-lipolyse, beta-oksidasjon av mitokondrielle fettsyrer og varmeutvikling ved UCP1-aktivering3. Det nære funksjonelle forholdet mellom lipiddråper og mitokondrier i brune adipocytter har strukturelle paralleller, for eksempel interaksjonen mellom disse organellene i områder som er store og har svært tett fysisk kontakt 7,8.
iBAT har rikelig med blodårer og sympatiske terminaler9. Disse strukturene, sammen med preadipocyttene, immuncellene, fibroblastene og ekstracellulære matrisemolekylene, utgjør den fettstromale vaskulære fraksjonen (SVF)10. Mange protokoller har blitt rapportert å generere modne adipocytter fra preadipocytter 11,12,13,14,15 (tilleggstabell 1); Likevel viser de ekstreme variasjoner i vevsprosessering og sammensetningen av differensieringskulturmediet. Protokollen beskrevet her tillater effektiv og reproduserbar differensiering av brune adipocytter som (1) uttrykker de viktigste adipogene transkripsjonsfaktorene peroksisomproliferatoraktivert reseptorgamma (PPARγ) og CCAAT/enhancer-bindende protein alfa (C/EBPα), (2) uttrykker de modne adipocyttmarkørene perilipin1 (PLIN1) og klyngedeterminant 36 (CD36), (3) akkumulerer rikelig med lipiddråper, (4) har høy mitokondriell masse og en høy overflod av OXPHOS-komplekser, (5) har termogent potensial, bestemt av høye nivåer av UCP1, og (6) har mitokondrielle morfologiske endringer assosiert med fenotypen til modne brune adipocytter. Denne metodikken brukes til å studere de molekylære mekanismene som ligger til grunn for generalisert lipodystrofi 15,16,17.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine Buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde Aqueous Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>410957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate&#160;</td>
			<td>SPL Life Science&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well optical black w/lid cell culture sterile</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>165305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuRuler RGB Plus Pre-stained Protein Ladder&#160;</td>
			<td>Maestrogen</td>
			<td>02102-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody&#160;&#160;</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>7074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blotting-grade blocker&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY 493/503&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C/EBP&#945; antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Calbiochem&#160;</td>
			<td>208291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD36 antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA1-16813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 100 &#181;m, nylon</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 40 &#181;m, nylon</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12500062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMBed-812 EMBEDDING KIT (Epon)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>100983&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>15023-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 25% Aqueous Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail 100X&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease Inhibitor Cocktail 100X&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF Membrane&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1620177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>I7378&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Calbiochem&#160;</td>
			<td>529552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>529568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lane Marker Reducing Sample Buffer&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>39000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water sterile&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitoprofile Total OXPHOS Rodent WB antibody Cocktail</td>
			<td>Abcam&#160;</td>
			<td>MS604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>1064041000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniPur&#160;10x PBS Liquid Concentrate</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>6505-OP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perilipin 1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPAR&#947; (81B8) antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer lysis&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>89901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>557366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacpdylate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos F200C G2</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOM20 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>42406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffered Saline (TBS-10X)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>12498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>H5152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCP1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>14670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracut R</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Westar Sun&#160;</td>
			<td>Cyanagen</td>
			<td>XLS063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Westar Supernova&#160;</td>
			<td>Cyanagen</td>
			<td>XLS3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation and imaging of brown adipocytes from the stromal vascular fraction of interscapular adipose tissue from newborn mice

Brunt fettvev (BAT) er kun tilstede hos pattedyr og har en termogen funksjon. Brune adipocytter er preget av et multilokulært cytoplasma med flere lipiddråper, en sentral kjerne, et høyt mitokondrieinnhold og ekspresjon av frakoblingsprotein 1 (UCP1). BAT har blitt foreslått som et potensielt terapeutisk mål for fedme og tilhørende metabolske forstyrrelser på grunn av dets evne til å spre metabolsk energi som varme. For å undersøke BAT-funksjon og regulering er brun adipocyttdyrking uunnværlig. Den nåværende protokollen optimaliserer vevsprosessering og celledifferensiering for dyrking av brune adipocytter fra nyfødte mus. I tillegg vises prosedyrer for avbildning av differensierte adipocytter med både konfokal immunfluorescens og transmisjonselektronmikroskopi. I de brune adipocyttene differensiert med teknikkene beskrevet her, er de viktigste definerende trekkene ved klassisk BAT bevart, inkludert høye UCP1-nivåer, økt mitokondriell masse og svært nær fysisk kontakt mellom lipiddråpene og mitokondriene, noe som gjør denne metoden til et verdifullt verktøy for BAT-studier.

Adipogenese reguleres av et nettverk av transkripsjonsfaktorer som er ansvarlige for både ekspresjon av nøkkelproteiner som induserer brun adipocyttdannelse og funksjon22, inkludert klassiske adipogene regulatorer som PPARγ og C/EBPα 23,24,25, samt markører for modne adipocytter 26,27. Gjennom å teste de forskjellige konsentrasjonene av ros...

Watch this Scientific Journal Video about Differentiation and Imaging of Brown Adipocytes from the Stromal Vascular Fraction of Interscapular Adipose Tissue from Newborn Mice at JoVE.com

Differentiation and Imaging of Brown Adipocytes from the Stromal Vascular Fraction of Interscapular Adipose Tissue from Newborn Mice

Preadipocytter isoleres fra den stromale vaskulære fraksjonen av interskapulært brunt fettvev fra nyfødte mus og differensieres til celler som akkumulerer lipiddråper, uttrykker molekylære markører og viser mitokondriell morfologi til modne brune adipocytter. Disse cellene analyseres videre ved immunfluorescens og transmisjonselektronmikroskopi.

Differensiering og avbildning av brune adipocytter fra den stromale vaskulære fraksjonen av interskapulært fettvev fra nyfødte mus

Brown adipose tissue (BAT) is only present in mammals and has a thermogenic function. Brown adipocytes are characterized by a multilocular cytoplasm with ...

Denne protokollen tillater effektiv og reproduserbar differensiering av brune adipocytter som uttrykker viktige adipogene transkripsjonsfaktorer, modne adipocyttmarkører og har termogent potensial og morfologisk fenotype av modne brune adipocytter. Dette er en enkel og replikerbar to-fase differensieringsprosedyre for å oppnå celler med egenskaper til modne brune adipocytter fra interskapulært brunt fettvev fra nyfødte mus. Denne protokollen gjør det mulig å studere aktiveringsmekanismene til brunt fettvev som et mål for behandling av fedme.Det har vært en modell for å bestemme mekanismene som er involvert i patofysiologien til lipodystrofi. Å utføre denne teknikken for første gang forventes å være utfordrende. Det er viktig å ha en detaljert protokoll og understreke kritiske punkter for å få vellykkede resultater.For å begynne, plasser den avlivede musen i en utsatt stilling og gjør et en centimeter langt hudsnitt midt på dyrets rygg med en skarp saks. Fjern huden forsiktig, løsne iBAT kirurgisk fra med en liten saks. Høst begge iBAT-ved hjelp av en tang med kurvespiss for å fjerne uavhengig av hverandre.Plasser de to i et plastrør med 1,5 ml steril PBS ved romtemperatur. Inkuber iBAT-vevet i kollagenase type to fordøyelsesbuffer i 45 minutter ved 37 grader Celsius med kontinuerlig forsiktig risting ved 800 RPM. Forstyrr vevssuspensjonen mekanisk i kollagenase type to fordøyelsesbuffer ved å pipettere opp og ned ved hjelp av en P1000 mikropipette og filterspisser.Bruk et nytt tips for hver prøve. Før det desegregerte vevet gjennom individuelle 100 mikrometer cellesiler inn i nye 1,5 milliliters rør. Tilsett 500 mikroliter ACK-buffer til de filtrerte vevsprøvene.Snu rørene fire til fem ganger og inkuber ved romtemperatur i fire minutter. Før deretter suspensjonene gjennom en 40 mikrometer cellesil inn i nye 1,5 milliliters rør ved hjelp av en P1000 mikropipette og filtrerte spisser. Sentrifusjon resuspender pelleten som beskrevet i tekstmanuskriptet.Frø deretter hver prøve i seks brønner i en 24-brønns kulturplate ved å tilsette en milliliter av suspensjonen til hver brønn. De udifferensierte preadipocyttene hadde svært lave eller upåviselige nivåer av ppar-gamma, C/ebp-alfa, perilipin 1 og CD36. Derimot var disse markørene betydelig høyere på dag syv av differensiering.Akkumulering av flere lipiddråper i de brune preadipocyttene var i samsvar med tidligere publiserte resultater. En signifikant økning ble observert i mitokondriemassemarkøren TOM 20 og de oksidative fosforyleringskompleksproteinnivåene på dag syv av differensiering. UCP1, en bonafidmarkør av denne celletypen, ble ikke påvist i udifferensierte preadipocytter, mens den ble vesentlig uttrykt i modne brune adipocytter på dag syv av differensiering.Mitokondriene utviklet seg fra en langstrakt rørformet form på dag null til en avrundet eller bønnelignende form på dag syv. Den mitokondrielle indre strukturen ble også modifisert av adipogenese, noe som resulterte i høyere tetthet av de parallellpakkede krystene. Viktigere var at mitokondriene var nært assosiert med lipiddråper i de differensierte brune adipocyttene, slik at ingen merkbar avstand mellom den ytre membranen til mitokondriene og overflatene til lipiddråpene kunne oppdages, selv med høyoppløselig transmisjonselektronmikroskopi.Kirurgisk fjerning av interskapulært fettvev er kritisk. En ineffektiv mengde vev begrenser tilgjengeligheten av celler som vil bli differensiert. Denne avbildningsteknikken hjelper til med å karakterisere morfologien til differensierte brune adipocytter in vitro.Det er mulig å utføre analyser for mitokondriell funksjon, beta-androgen aktivering og autofagisk hemming.

Research

JoVE Journal

Biology

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Funksjonell Imaging av brunt fett i Mus med FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose  tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich  vascularization and high ...

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

Isolasjon og differensiering av stromale Vaskulær Cells til beige / Brite Cells

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-Clear: En vev fjerne metoden for tredimensjonale Imaging av fettvev

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice

Isolasjon og differensiering av primærhvite og brune preadipocytter fra nyfødte mus

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white ...

Visualization and Quantification of Brown and Beige Adipose Tissues in Mice using [18F]FDG Micro-PET/MR Imaging

Visualization and Quantification of Brown and Beige Adipose Tissues in Mice using [18F]FDG Micro-PET/MR Imaging

Visualisering og kvantifisering av brunt og beige fettvev hos mus ved bruk av [18F]FDG Micro-PET/MR Imaging

Brown and beige adipocytes are now recognized as potential therapeutic targets for obesity and metabolic syndromes. Non-invasive molecular imaging methods ...

Halvautomatisk isolering av murine hvitt fettvev

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Forfatter Spotlight: Semi-automatisert isolering av den stromale vaskulære fraksjonen fra murine hvitt fettvev ved bruk av en vevsdissosiator  

Semi-automatisert isolering av den stromale vaskulære fraksjonen fra murine hvitt fettvev ved bruk av en vevsdissosiator

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...