Name: differentiation and imaging of brown adipocytes from the stromal vascular fraction of interscapular adipose tissue from newborn mice
Uploaded: 2023-02-03T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation and Imaging of Brown Adipocytes from the Stromal Vascular Fraction of Interscapular Adipose Tissue from Newborn Mice at JoVE.com

O financiamento foi fornecido pela FONDECYT (1181214 e 1221146) e Anillos (ACT210039) para bolsas de VC e doutorado ANID 21171743 para AMF e ANID 21150665 para FS. Agradecemos a Alejandro Munizaga pela ajuda no processamento das amostras e assessoria técnica para a microscopia eletrônica de transmissão. As ilustrações foram produzidas usando BioRender.

Os procedimentos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Pontifícia Universidade Católica do Chile. Camundongos recém-nascidos P0,5 de ambos os sexos, derivados de um fundo misto de cepas C57BL/6J e 129J, foram usados para este estudo.
1. Extração de tecido
<ol><li>Limpe e desinfete a bancada com uma solução de etanol a 70% e use material cirúrgico estéril.</li>
	<li>Eutanasiar filhotes recém-nascidos P0,5 por decapita?...

<ol>
	<li>Luo, L., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+in+control+of+metabolism.">Adipose tissue in control of metabolism.</a> Journal of Endocrinology. 231 (3), 77-99 (2016).</li><li>Gaspar, R. C., Pauli, J. R., Shulman, G. I., Mu&#241;oz, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+update+on+brown+adipose+tissue+biology:+A+discussion+of+recent+findings.">An update on brown adipose tissue biology: A discussion of recent findings.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 320 (3), 488-495 (2021).</li><li>Richard, D., Picard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+fat+biology+and+thermogenesis.">Brown fat biology and thermogenesis.</a> Frontiers in Bioscience. 16, 1233-1260 (2011).</li><li>Rosenwald, M., Wolfrum, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+definition+of+brite+versus+white+and+classical+brown+adipocytes.">The origin and definition of brite versus white and classical brown adipocytes.</a> Adipocyte. 3 (1), 4-9 (2014).</li><li>Smorlesi, A., Frontini, A., Giordano, A., Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adipose+organ:+White-brown+adipocyte+plasticity+and+metabolic+inflammation.">The adipose organ: White-brown adipocyte plasticity and metabolic inflammation.</a> Obesity Reviews. 13, 83-96 (2012).</li><li>Townsend, K., Tseng, Y. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue:+Recent+insights+into+development,+metabolic+function+and+therapeutic+potential.">Brown adipose tissue: Recent insights into development, metabolic function and therapeutic potential.</a> Adipocyte. 1 (1), 13-24 (2012).</li><li>Benador, I. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+bound+to+lipid+droplets+have+unique+bioenergetics,+composition,+and+dynamics+that+support+lipid+droplet+expansion.">Mitochondria bound to lipid droplets have unique bioenergetics, composition, and dynamics that support lipid droplet expansion.</a> Cell Metabolism. 27 (4), 869-885 (2018).</li><li>Benador, I. Y., Veliova, M., Liesa, M., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+bound+to+lipid+droplets:+Where+mitochondrial+dynamics+regulate+lipid+storage+and+utilization.">Mitochondria bound to lipid droplets: Where mitochondrial dynamics regulate lipid storage and utilization.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 827-835 (2019).</li><li>Lee, P., Swarbrick, M. M., Ho, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue+in+adult+humans:+A+metabolic+renaissance.">Brown adipose tissue in adult humans: A metabolic renaissance.</a> Endocrine Reviews. 34 (3), 413-438 (2013).</li><li>Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. 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L., Guerra, B. A., Boucher, J., Mori, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+to+induce+brown/beige+adipocyte+differentiation+from+murine+preadipocytes.">A Method to induce brown/beige adipocyte differentiation from murine preadipocytes.</a> Bio-protocol. 11 (24), 4265 (2021).</li><li>Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+primary+white+and+brown+preadipocytes+from+newborn+mice.">Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (167), e62005 (2021).</li><li>Tapia, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+AGPAT2+impairs+brown+adipogenesis,+increases+IFN+stimulated+gene+expression+and+alters+mitochondrial+morphology.">Absence of AGPAT2 impairs brown adipogenesis, increases IFN stimulated gene expression and alters mitochondrial morphology.</a> Metabolism. 111, 154341 (2020).</li><li>Gonz&#225;lez-H&#243;dar, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+caveolae+in+AGPAT2+lacking+adipocytes+is+independent+of+changes+in+cholesterol+or+sphingolipid+levels:+A+whole+cell+and+plasma+membrane+lipidomic+analysis+of+adipogenesis.">Decreased caveolae in AGPAT2 lacking adipocytes is independent of changes in cholesterol or sphingolipid levels: A whole cell and plasma membrane lipidomic analysis of adipogenesis.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1867 (9), 166167 (2021).</li><li>Fern&#225;ndez-Galilea, M., Tapia, P., Cautivo, K., Morselli, E., Cort&#233;s, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AGPAT2+deficiency+impairs+adipogenic+differentiation+in+primary+cultured+preadipocytes+in+a+non-autophagy+or+apoptosis+dependent+mechanism.">AGPAT2 deficiency impairs adipogenic differentiation in primary cultured preadipocytes in a non-autophagy or apoptosis dependent mechanism.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 467 (1), 39-45 (2015).</li><li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bicinchoninic+acid+(BCA)+assay+for+protein+quantitation.">The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation.</a> The Protein Protocols Handbook. , 11-15 (2009).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting.">Western blotting.</a> Methods. 38 (4), 283-293 (2006).</li><li>Reynolds, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+lead+citrate+at+high+pH+as+an+electron-opaque+stain+in+electron+microscopy.">The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).</li><li>Ghaben, A. L., Scherer, P. 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H., Zhang, S., Liang, B., Liu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+and+mitochondria+are+anchored+during+brown+adipocyte+differentiation.">Lipid droplets and mitochondria are anchored during brown adipocyte differentiation.</a> Protein &amp; Cell. 10 (12), 921-926 (2019).</li><li>Hao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indomethacin+enhances+brown+fat+activity.">Indomethacin enhances brown fat activity.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 365 (3), 467-475 (2018).</li><li>Lehmann, J. M., Lenhard, J. M., Oliver, B. B., Ringold, G. M., Kliewer, S. 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M., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPARgamma+agonists+induce+a+white-to-brown+fat+conversion+through+stabilization+of+PRDM16+protein.">PPARgamma agonists induce a white-to-brown fat conversion through stabilization of PRDM16 protein.</a> Cell Metabolism. 15 (3), 395-404 (2012).</li><li>Merlin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosiglitazone+and+a+&#946;3-adrenoceptor+agonist+are+both+required+for+functional+browning+of+white+adipocytes+in+culture.">Rosiglitazone and a &#946;3-adrenoceptor agonist are both required for functional browning of white adipocytes in culture.</a> Frontiers in Endocrinology. 9, 249 (2018).</li><li>Fayyad, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosiglitazone+enhances+browning+adipocytes+in+association+with+MAPK+and+PI3-K+pathways+during+the+differentiation+of+telomerase-transformed+mesenchymal+stromal+cells+into+adipocytes.">Rosiglitazone enhances browning adipocytes in association with MAPK and PI3-K pathways during the differentiation of telomerase-transformed mesenchymal stromal cells into adipocytes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1618-1633 (2019).</li><li>Zennaro, M. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hibernoma+development+in+transgenic+mice+identifies+brown+adipose+tissue+as+a+novel+target+of+aldosterone+action.">Hibernoma development in transgenic mice identifies brown adipose tissue as a novel target of aldosterone action.</a> The Journal of Clinical Investigation. 101 (6), 1254-1260 (1998).</li><li>Klaus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+novel+brown+adipocyte+cell+line+HIB+1B.+Adrenergic+pathways+involved+in+regulation+of+uncoupling+protein+gene+expression.">Characterization of the novel brown adipocyte cell line HIB 1B. Adrenergic pathways involved in regulation of uncoupling protein gene expression.</a> Journal of Cell Science. 107 (1), 313-319 (1994).</li><li>Guennoun, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+molecular+characterization+of+human+adipocytes+reveals+a+transient+brown+phenotype.">Comprehensive molecular characterization of human adipocytes reveals a transient brown phenotype.</a> Journal of Translational Medicine. 13, 135 (2015).</li></ol>

O presente protocolo é um procedimento de diferenciação bifásica simples e replicável (Figura 2) para gerar células com as características moleculares e morfológicas de adipócitos marrons maduros. A colheita cirúrgica do iBAT é o primeiro passo crítico porque a ruptura do tecido limita severamente a viabilidade do material de partida. O processamento de tecidos também é fundamental porque uma suspensão celular homogênea e livre de detritos aumenta muito a quantidade de SVF qu...

O tecido adiposo branco e marrom diferem em sua localização anatômica, origem celular, função, morfologia e massa total. O tecido adiposo branco (TAB) é o principal reservatório de energia fisiológica do corpo e armazena grandes quantidades de triacilglicerol (TAG) em células altamente especializadas que possuem uma única gotícula lipídica gigante ocupando a maior parte de seu volume celular1. A lipólise TAG libera ácidos graxos livres, que entram na circulação sistêmica para atender às demandas de energia durante o jejum ou outros estados de balanço energético negativo. Além disso, o WAT secreta produtos proteicos e lipídicos, chamados adipocinas e lipocinas, respectivamente, que possuem funções reguladoras metabólicas, imunológicas e reprodutivas, tornando o WAT o maior tecido endócrino do corpo2.
O tecido adiposo marrom (BAT) é um órgão muito menor cuja principal função fisiológica é a termogênese sem tremores para prevenir a hipotermia. Em camundongos e humanos recém-nascidos, o BAT é um órgão bem definido localizado no espaço interescapular. Humanos adultos não têm BAT interescapular (iBAT); no entanto, eles desenvolvem aglomerados de células marrons semelhantes a adipócitos integradas em depósitos que, de outra forma, compreendem principalmente o WAT. Esses adipócitos "marrom-em-branco" (brite) compartilham características morfológicas e moleculares com os adipócitos clássicos do iBAT, mas têm uma origem celular diferente 3,4.
Em contraste com os adipócitos brancos, os adipócitos marrons têm múltiplas gotículas lipídicas pequenas e mitocôndrias abundantes5. A proteína de desacoplamento 1 (UCP1, também conhecida como termogenina) é expressa exclusivamente por adipócitos marrons e brite e medeia o vazamento de prótons na membrana mitocondrial interna (IMM), desacoplando assim o transporte de elétrons da síntese de ATP e gerando calor. A termogênese sem tremores no BAT é ativada pela norepinefrina (NE), que é liberada dos terminais simpáticos no BAT em resposta à estimulação fria6. O NE se liga aos receptores beta-adrenérgicos (principalmente beta 3) na superfície dos adipócitos marrons e desencadeia uma cascata de sinalização mediada por cAMP intracelular. Isso resulta em lipólise de TAG, beta-oxidação de ácidos graxos mitocondriais e geração de calor após a ativação de UCP13. A estreita relação funcional entre gotículas lipídicas e mitocôndrias em adipócitos marrons tem paralelos estruturais, como a interação entre essas organelas em áreas grandes e com contato físico muito estreito 7,8.
O iBAT tem vasos sanguíneos abundantes e terminais simpáticos9. Essas estruturas, juntamente com os pré-adipócitos, células imunes, fibroblastos e moléculas da matriz extracelular, compõem a fração vascular estromal adiposa (FVS)10. Muitos protocolos foram relatados para gerar adipócitos maduros a partir de pré-adipócitos 11,12,13,14,15 (Tabela Suplementar 1); no entanto, eles exibem variações extremas no processamento de tecidos e na composição dos meios de cultura de diferenciação. O protocolo aqui descrito permite a diferenciação eficiente e reprodutível de adipócitos marrons que (1) expressam os principais fatores de transcrição adipogênica receptor gama ativado por proliferador de peroxissomo (PPARγ) e CCAAT/proteína alfa de ligação ao intensificador (C/EBPα), (2) expressam os marcadores de adipócitos maduros perilipina1 (PLIN1) e determinante de cluster 36 (CD36), (3) acumulam gotículas lipídicas abundantes, (4) têm alta massa mitocondrial e uma alta abundância de complexos OXPHOS, (5) têm potencial termogênico, determinado por altos níveis de UCP1, e (6) têm alterações morfológicas mitocondriais associadas ao fenótipo de adipócitos marrons maduros. Essa metodologia é utilizada para estudar os mecanismos moleculares subjacentes à lipodistrofia generalizada 15,16,17.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine Buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde Aqueous Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>410957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate&#160;</td>
			<td>SPL Life Science&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well optical black w/lid cell culture sterile</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>165305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuRuler RGB Plus Pre-stained Protein Ladder&#160;</td>
			<td>Maestrogen</td>
			<td>02102-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody&#160;&#160;</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>7074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blotting-grade blocker&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY 493/503&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C/EBP&#945; antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Calbiochem&#160;</td>
			<td>208291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD36 antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA1-16813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 100 &#181;m, nylon</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 40 &#181;m, nylon</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12500062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMBed-812 EMBEDDING KIT (Epon)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>100983&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>15023-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 25% Aqueous Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail 100X&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease Inhibitor Cocktail 100X&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF Membrane&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1620177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>I7378&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Calbiochem&#160;</td>
			<td>529552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>529568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lane Marker Reducing Sample Buffer&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>39000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water sterile&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitoprofile Total OXPHOS Rodent WB antibody Cocktail</td>
			<td>Abcam&#160;</td>
			<td>MS604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>1064041000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniPur&#160;10x PBS Liquid Concentrate</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>6505-OP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perilipin 1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPAR&#947; (81B8) antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer lysis&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>89901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>557366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacpdylate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos F200C G2</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOM20 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>42406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffered Saline (TBS-10X)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>12498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>H5152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCP1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>14670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracut R</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Westar Sun&#160;</td>
			<td>Cyanagen</td>
			<td>XLS063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Westar Supernova&#160;</td>
			<td>Cyanagen</td>
			<td>XLS3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation and imaging of brown adipocytes from the stromal vascular fraction of interscapular adipose tissue from newborn mice

O tecido adiposo marrom (BAT) está presente apenas em mamíferos e tem função termogênica. Os adipócitos marrons são caracterizados por um citoplasma multilocular com múltiplas gotículas lipídicas, um núcleo central, um alto conteúdo mitocondrial e a expressão da proteína desacopladora 1 (UCP1). O BAT foi proposto como um potencial alvo terapêutico para a obesidade e seus distúrbios metabólicos associados devido à sua capacidade de dissipar energia metabólica como calor. Para investigar a função e regulação do BAT, a cultura de adipócitos marrons é indispensável. O presente protocolo otimiza o processamento de tecidos e a diferenciação celular para a cultura de adipócitos marrons de camundongos recém-nascidos. Além disso, são mostrados procedimentos para a imagem de adipócitos diferenciados com imunofluorescência confocal e microscopia eletrônica de transmissão. Nos adipócitos marrons diferenciados com as técnicas aqui descritas, as principais características definidoras do BAT clássico são preservadas, incluindo altos níveis de UCP1, aumento da massa mitocondrial e contato físico muito próximo entre as gotículas lipídicas e as mitocôndrias, tornando este método uma ferramenta valiosa para estudos de BAT.

A adipogênese é regulada por uma rede de fatores de transcrição que são responsáveis tanto pela expressão de proteínas-chave que induzem a formação e o funcionamento dos adipócitos marrons22, incluindo reguladores adipogênicos clássicos como PPARγ e C / EBPα23 , 24 , 25 , bem como marcadores de adipócitos maduros26 , 27. Através d...

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Differentiation and Imaging of Brown Adipocytes from the Stromal Vascular Fraction of Interscapular Adipose Tissue from Newborn Mice

Os pré-adipócitos são isolados da fração vascular estromal do tecido adiposo marrom interescapular de camundongos recém-nascidos e diferenciados em células que acumulam gotículas lipídicas, expressam marcadores moleculares e mostram a morfologia mitocondrial de adipócitos marrons maduros. Essas células são posteriormente analisadas por imunofluorescência e microscopia eletrônica de transmissão.

Diferenciação e imagem de adipócitos marrons da fração vascular estromal do tecido adiposo interescapular de camundongos recém-nascidos

Brown adipose tissue (BAT) is only present in mammals and has a thermogenic function. Brown adipocytes are characterized by a multilocular cytoplasm with ...

Este protocolo permite a diferenciação eficiente e reprodutível de adipócitos marrons que expressam os principais fatores de transcrição adipogênicos, marcadores de adipócitos maduros e têm potencial termogênico e fenótipo morfológico de adipócitos marrons maduros. Este é um procedimento de diferenciação bifásica simples e replicável para obter células com características de adipócitos marrons maduros a partir de tecido adiposo marrom interescapular de camundongos recém-nascidos. Este protocolo permite estudar os mecanismos de ativação do tecido adiposo marrom como alvo para o tratamento da obesidade.Tem sido um modelo para determinar os mecanismos envolvidos na fisiopatologia da lipodistrofia. Espera-se que a execução dessa técnica pela primeira vez seja um desafio. É essencial ter um protocolo detalhado e enfatizar pontos críticos para ter resultados bem-sucedidos.Para começar, coloque o camundongo sacrificado em decúbito ventral e faça uma incisão na pele de um centímetro de comprimento no nível médio das costas do animal usando uma tesoura afiada. Remova a pele com cuidado, retire cirurgicamente o iBAT da carcaça usando uma tesoura pequena. Colha os dois lóbulos do iBAT usando um alicate de ponta curva para remover os lóbulos de forma independente.Coloque os dois lóbulos em um tubo de plástico com 1,5 mililitros de PBS estéril em temperatura ambiente. Incubar os tecidos do iBAT em tampão de digestão colagenase tipo dois por 45 minutos a 37 graus Celsius com agitação suave contínua a 800 RPM. Interrompa mecanicamente a suspensão tecidual no tampão de digestão colagenase tipo dois, pipetando para cima e para baixo usando uma micropipeta P1000 e pontas de filtro.Use uma nova ponta para cada amostra. Passe os tecidos dessegregados através de filtros de células individuais de 100 micrômetros para novos tubos de 1,5 mililitro. Adicione 500 microlitros de tampão ACK às amostras de tecido filtrado.Inverter os tubos quatro a cinco vezes e incubar à temperatura ambiente durante quatro minutos. Em seguida, passe as suspensões por um filtro de células de 40 micrômetros em novos tubos de 1,5 mililitro usando uma micropipeta P1000 e pontas filtradas. Centrifusion ressuspende o pellet conforme descrito no manuscrito do texto.Em seguida, semeie cada amostra em seis poços de uma placa de cultura de 24 poços, adicionando um mililitro da suspensão a cada poço. Os pré-adipócitos indiferenciados apresentaram níveis muito baixos ou indetectáveis de ppar-gama, C/ebp-alfa, perilipina 1 e CD36. Em contraste, esses marcadores foram significativamente maiores no sétimo dia de diferenciação.O acúmulo de múltiplas gotículas lipídicas nos pré-adipócitos marrons foi consistente com os resultados publicados anteriormente. Um aumento significativo foi observado nos níveis de proteína do marcador de massa mitocondrial TOM 20 e do complexo de fosforilação oxidativa no sétimo dia de diferenciação. UCP1, um marcador genuíno deste tipo de célula, não foi detectado em pré-adipócitos indiferenciados, enquanto foi substancialmente expresso em adipócitos marrons maduros no sétimo dia de diferenciação.As mitocôndrias evoluíram de uma forma tubular alongada no dia zero para uma forma arredondada ou semelhante a um feijão no dia sete. A estrutura interna mitocondrial também foi modificada pela adipogênese, resultando em maior densidade dos cristais compactados paralelamente. É importante ressaltar que as mitocôndrias estavam intimamente associadas a gotículas lipídicas nos adipócitos marrons diferenciados, de modo que nenhuma distância discernível entre a membrana externa da mitocôndria e as superfícies das gotículas lipídicas pôde ser detectada, mesmo com microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução.A remoção cirúrgica do tecido adiposo interescapular é crítica. Uma quantidade ineficiente de tecido limita a disponibilidade de células que serão diferenciadas. Esta técnica de imagem ajuda a caracterizar a morfologia de adipócitos marrons diferenciados in vitro.É possível realizar ensaios para função mitocondrial, ativação beta androgênica e inibição autofágica.

Research

JoVE Journal

Biology

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Imagem Funcional de gordura marrom em ratos com FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose  tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich  vascularization and high ...

Biologia

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

Isolamento e diferenciação de células estromais vasculares para Células Bege / Brite

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Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice

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The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white ...

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Visualization and Quantification of Brown and Beige Adipose Tissues in Mice using [18F]FDG Micro-PET/MR Imaging

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