Name: single-cell analysis of the expression of pseudomonas syringae genes within the plant tissue
Uploaded: 2022-10-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من خلال منحة المشروع RTI2018-095069-B-I00 بتمويل من MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 / ومن قبل "ERDP طريقة لصنع أوروبا". تم تمويل JSR من قبل خطة Andaluz de Investigación و Desarrollo e Innovación (PAIDI 2020). تم تمويل N.L.P. من خلال منحة المشروع P18-RT-2398 من خطة Andaluz de Investigación و Desarrollo e Innovación.

1. إعداد النبات
<ol><li>قم بإعداد نباتات Arabidopsis Col-0 باتباع الخطوات أدناه.<ol><li>املأ أصيصا بقطر 10 سم بمزيج ركيزة نبات الفيرميكوليت 1: 3 (انظر جدول المواد) ، الذي تم سقيه مسبقا ، وقم بتغطية الوعاء بشبكة معدنية مقاس 15 سم × 15 سم بفتحات 1.6 مم × 1.6 مم. اضبط الشبكة المعدنية على التربة الرط?...

<ol>
	<li>Weigel, W. A., Dersch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity:+A+bacterial+virulence+strategy.">Phenotypic heterogeneity: A bacterial virulence strategy.</a> Microbes and Infection. 20 (9-10), 570-577 (2018).</li><li>Hare, P. J., LaGree, T. J., Byrd, B. A., DeMarco, A. M., Mok, W. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+technologies+to+study+phenotypic+heterogeneity+and+bacterial+persisters.">Single-cell technologies to study phenotypic heterogeneity and bacterial persisters.</a> Microorganisms. 9 (11), 2277 (2021).</li><li>Mansfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top+10+plant+pathogenic+bacteria+in+molecular+plant+pathology.">Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13 (6), 614-629 (2012).</li><li>Morris, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+history+of+the+plant+pathogen+Pseudomonas+syringae+is+linked+to+the+water+cycle.">The life history of the plant pathogen Pseudomonas syringae is linked to the water cycle.</a> The ISME Journal. 2 (3), 321-334 (2008).</li><li>Rufi&#225;n, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+reveals+in+planta+dynamic+interactions+between+pathogenic,+avirulent+and+non-pathogenic+Pseudomonas+syringae+strains.">Confocal microscopy reveals in planta dynamic interactions between pathogenic, avirulent and non-pathogenic Pseudomonas syringae strains.</a> Molecular Plant Pathology. 19 (3), 537-551 (2018).</li><li>Macho, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+of+plant+cellular+functions+by+bacterial+type-III+effectors:+Beyond+suppression+of+immunity.">Subversion of plant cellular functions by bacterial type-III effectors: Beyond suppression of immunity.</a> New Phytologist. 210 (1), 51-57 (2016).</li><li>Xiao, Y., Hutcheson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+promoter+sequence+recognized+by+a+newly+identified+alternate+sigma+factor+directs+expression+of+pathogenicity+and+host+range+determinants+in+Pseudomonas+syringae.">A single promoter sequence recognized by a newly identified alternate sigma factor directs expression of pathogenicity and host range determinants in Pseudomonas syringae.</a> Journal of Bacteriology. 176 (10), 3089-3091 (1994).</li><li>Rufi&#225;n, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chromosome-located+transcriptional+fusions+to+fluorescent+proteins+for+single-cell+gene+expression+analysis+in+Pseudomonas+syringae.">Generating chromosome-located transcriptional fusions to fluorescent proteins for single-cell gene expression analysis in Pseudomonas syringae.</a> Methods in Molecular Biology. 1734, 183-199 (2018).</li><li>Rufian, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+syringae+differentiates+into+phenotypically+distinct+subpopulations+during+colonization+of+a+plant+host.">Pseudomonas syringae differentiates into phenotypically distinct subpopulations during colonization of a plant host.</a> Environmental Microbiology. 18 (10), 3593-3605 (2016).</li><li>Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+thaliana-Pseudomonas+syringae+interaction.">The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction.</a> Arabidopsis Book. 1, 0039 (2002).</li><li>Fouts, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomewide+identification+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000+promoters+controlled+by+the+HrpL+alternative+sigma+factor.">Genomewide identification of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 promoters controlled by the HrpL alternative sigma factor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2275-2280 (2002).</li><li>Huber, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Robust Statistics. , (1981).</li><li>Freed, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+screen+to+identify+promoters+conferring+high+levels+of+phenotypic+noise.">A simple screen to identify promoters conferring high levels of phenotypic noise.</a> PLoS Genetics. 4 (12), 1000307 (2008).</li><li>Hirano, S. S., Upper, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+in+the+leaf+ecosystem+with+emphasis+on+Pseudomonas+syringae-a+pathogen,+ice+nucleus,+and+epiphyte.">Bacteria in the leaf ecosystem with emphasis on Pseudomonas syringae-a pathogen, ice nucleus, and epiphyte.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (3), 624-653 (2000).</li><li>Lindeberg, M., Myers, C. R., Collmer, A., Schneider, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roadmap+to+new+virulence+determinants+in+Pseudomonas+syringae:+Insights+from+comparative+genomics+and+genome+organization.">Roadmap to new virulence determinants in Pseudomonas syringae: Insights from comparative genomics and genome organization.</a> Molecular Plant Microbe Interactions. 21 (6), 685-700 (2008).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+leaf+infiltration+assay+for+fine+characterization+of+plant+defense+responses+using+the+Arabidopsis+thaliana-Pseudomonas+syringae+pathosystem.">Bacterial leaf infiltration assay for fine characterization of plant defense responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae pathosystem.</a> Journal of Visualized Experiments. (104), e53364 (2015).</li><li>O'Leary, B. M., Rico, A., McCraw, S., Fones, H. N., Preston, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+infiltration-centrifugation+technique+for+extraction+of+apoplastic+fluid+from+plant+leaves+using+Phaseolus+vulgaris+as+an+example.">The infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using Phaseolus vulgaris as an example.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), e52113 (2014).</li><li>Tornero, P., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+quantifying+growth+of+phytopathogenic+bacteria+in+Arabidopsis+thaliana.">A high-throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 28 (4), 475-481 (2001).</li></ol>

تصف الطريقة المعروضة هنا إجراء غير جراحي يسمح بتسلل البكتيريا إلى الأنسجة الورقية النباتية ، مما يسمح بالتلقيح السريع لكميات كبيرة مع تقليل اضطراب الأنسجة. واحدة من خصائص مجمع أنواع P. syringae هي القدرة على البقاء والتكاثر داخل apoplast النبات وعلى سطح النبات كما epiphyte14. وبالتال...

تظهر البكتيريا المسببة للأمراض اختلافات في الأنماط الظاهرية المتنوعة ، مما يؤدي إلى تكوين مجموعات فرعية داخل مجموعات متطابقة وراثيا. تعرف هذه الظاهرة باسم عدم التجانس الظاهري وقد تم اقتراحها كاستراتيجية تكيف أثناء التفاعلات بين البكتيرياوالمضيف 1. عززت التطورات الحديثة في الدقة البصرية للمجاهر متحدة البؤر ، وقياس التدفق الخلوي ، والموائع الدقيقة ، جنبا إلى جنب مع البروتينات الفلورية ، تحليلات الخلية الواحدة لمجموعات البكتيريا2.
حقنة Pseudomonas سالبة الجرام هي بكتيريا ممرضة نباتية نموذجية نظرا لأهميتها الأكاديمية والاقتصادية3. ترتبط دورة حياة P. syringae بدورة المياه4. تدخل P. syringae إلى الفراغات بين الخلايا بين خلايا الميزوفيل ، وهي أبوبلاست أوراق النبات ، من خلال فتحات طبيعية مثل الثغور أو الجروح5. بمجرد دخول P. syringae إلى apoplast ، يعتمد على نظام إفراز النوع الثالث (T3SS) والمستجيبات المنقولة من النوع الثالث (T3E) لقمع مناعة النبات والتعامل مع الوظائف الخلوية للنبات لصالح العامل الممرض6. يعتمد التعبير عن T3SS و T3E على المنظم الرئيسي HrpL ، وهو عامل سيجما بديل يرتبط بزخارف صندوق hrp في منطقة المروج للجينات المستهدفة7. 
من خلال توليد اندماجات نسخية موجودة بالكروموسوم إلى جينات البروتين الفلوري في اتجاه مجرى الجين محل الاهتمام ، يمكن للمرء مراقبة التعبير الجيني بناء على مستويات التألق المنبعثة على مستوى الخليةالواحدة 8. باستخدام هذه الطريقة ، ثبت أن التعبير عن hrpL غير متجانس داخل كل من الثقافات البكتيرية المزروعة في المختبر وداخل المجموعات البكتيرية المستعادة من نبات apoplast 8,9. على الرغم من أن تحليل التعبير الجيني على مستوى الخلية الواحدة يتم إجراؤه عادة في المزارع البكتيرية المزروعة في الوسائط المختبرية ، إلا أنه يمكن أيضا إجراء مثل هذه التحليلات على المجموعات البكتيرية التي تنمو داخل النبات ، وبالتالي توفير معلومات قيمة عن تكوين مجموعات فرعية في السياق الطبيعي. أحد القيود المحتملة لتحليل المجموعات البكتيرية المستخرجة من النبات هو أن طرق التلقيح الكلاسيكية عن طريق تسلل ضغط الحقن إلى الأبوبلاست ، يليها الاستخراج البكتيري عن طريق نقع أنسجة الأوراق ، عادة ما تولد كمية كبيرة من حطام النبات الخلوي الذي يتداخل مع تحليل المصب10. يتكون معظم الحطام الخلوي من شظايا الفلورسنت الذاتي من البلاستيدات الخضراء التي تتداخل مع مضان GFP ، مما يؤدي إلى نتائج مضللة.
يصف البروتوكول الحالي عملية تحليل عدم تجانس التعبير الجيني أحادي الخلية في نظامين مرضيين نموذجيين: النظام الذي تشكله P. syringae pv. سلالة الطماطم DC3000 و Arabidopsis thaliana (Col-0) ، والآخر بواسطة P. syringae الكهروضوئية. سلالة فاسوليكولا 1448A ونباتات الفاصوليا (صنف Phaseolus vulgaris الكندي العجائب). يقترح طريقة التلقيح على أساس التسلل الفراغي باستخدام غرفة فراغ ومضخة ، مما يؤدي إلى طريقة سريعة وخالية من التلف للتسلل إلى الأوراق الكاملة. علاوة على ذلك ، كتحسين للبروتوكولات التقليدية ، يتم استخدام طريقة ألطف لاستخراج البكتيريا من apoplast التي تقلل بشكل كبير من اضطراب الأنسجة ، بناء على استخراج السائل apoplastic عن طريق تطبيق دورات من الضغط الإيجابي والسلبي باستخدام كمية صغيرة من الحجم داخل حقنة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.17 mm coverslip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.6 x 1.6 mm metal mesh</td>
			<td>Buzifu</td>
			<td></td>
			<td>Fiberglass screen mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm diameter pots</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>140 mm Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological agar</td>
			<td>Roko</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope Stellaris</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSVerse cell analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin sulfate</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>G-0124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
			<td>Phytotechnology</td>
			<td>K378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant substrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet L-77</td>
			<td>Cromton Europe Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum chamber 25 cm diameter</td>
			<td>Kartell</td>
			<td>554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>GAST</td>
			<td>DOA-P504-BN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell analysis of the expression of pseudomonas syringae genes within the plant tissue

عدد كبير من الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض تهاجم النباتات باستمرار. يشمل مجمع أنواع Pseudomonas syringae البكتيريا المسببة للأمراض النباتية سالبة الجرام ذات الأهمية الخاصة لعدد كبير من المضيفين. تدخل P. syringae النبات من سطح الورقة وتتكاثر بسرعة داخل apoplast ، وتشكل مستعمرات دقيقة تشغل الفضاء بين الخلايا. يسمح التعبير التأسيسي للبروتينات الفلورية بواسطة البكتيريا بتصور المستعمرات الدقيقة ومراقبة تطور العدوى على المستوى المجهري. كشفت التطورات الحديثة في تحليل الخلية الواحدة عن التعقيد الكبير الذي وصلت إليه مجموعات البكتيريا المتجانسة المولدة للتنسيج. هذا التعقيد ، الذي يشار إليه باسم عدم التجانس الظاهري ، هو نتيجة للاختلافات من خلية إلى أخرى في التعبير الجيني (غير المرتبط بالاختلافات الجينية) بين المجتمع البكتيري. لتحليل التعبير عن المواقع الفردية على مستوى الخلية الواحدة ، تم استخدام عمليات الاندماج النسخية للبروتينات الفلورية على نطاق واسع. في ظل ظروف الإجهاد ، مثل تلك التي تحدث أثناء استعمار نبات apoplast ، تتمايز P. syringae إلى مجموعات فرعية متميزة بناء على التعبير غير المتجانس لجينات الفوعة الرئيسية (أي نظام إفراز Hrp من النوع الثالث). ومع ذلك ، فإن تحليل الخلية الواحدة لأي مجموعة معينة من P. syringae المستعادة من الأنسجة النباتية يمثل تحديا بسبب الحطام الخلوي المنبعث أثناء الاضطراب الميكانيكي الجوهري لعمليات التلقيح والاستخراج البكتيري. ويفصل هذا التقرير طريقة وضعت لرصد التعبير عن جينات P. syringae ذات الأهمية على مستوى الخلية الواحدة أثناء استعمار نبات الأرابيدوبسيس والفاصوليا. يتم وصف تحضير النباتات والمعلقات البكتيرية المستخدمة للتلقيح باستخدام غرفة مفرغة. كما يتم شرح تعافي البكتيريا الداخلية من الأوراق المصابة عن طريق استخراج السوائل apoplastic هنا. تم تحسين كل من طرق التلقيح البكتيري والاستخراج البكتيري تجريبيا لتقليل تلف الخلايا النباتية والبكتيرية ، مما أدى إلى الاستعدادات البكتيرية المثلى للفحص المجهري وتحليل التدفق الخلوي.

يعد التعبير عن نظام الإفراز من النوع الثالث ضروريا لنمو البكتيريا داخل النبات. يتم تحقيق التعبير في الوقت المناسب عن جينات T3SS من خلال التنظيم المعقد ، وفي مركزه عامل سيغما للوظيفة خارج الهيولى (ECF) HrpL ، المنشط الرئيسي للتعبير عن الجينات المرتبطة ب T3SS11. تم إجراء تحليل للتعبير عن...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue at JoVE.com

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

يصف البروتوكول الحالي طريقة تسمح بتحليل التعبير الجيني أحادي الخلية على مجموعات محاقن Pseudomonas المزروعة داخل نبات apoplast.

تحليل الخلية الواحدة للتعبير عن جينات حقنة الزائفة داخل الأنسجة النباتية

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic ...

يوفر بروتوكولنا طريقة لطيفة لتلقيح واستخراج النباتات تسمح باستعادة المجموعات البكتيرية المزروعة في أبوبلاست الأوراق المناسبة لتحليل التعبير الجيني أحادي الخلية مثل قياس التدفق الخلوي. تسمح هذه الطريقة باستخراج كمية كبيرة من البكتيريا من apoplast دون تلويث العينات بشكل كبير بالحطام الخلوي للنبات. يمكن تطبيق هذه الطريقة المثلى لاستعادة البكتيريا apoplastic مباشرة أو مع تعديلات طفيفة على عدد من الأنظمة البكتيرية النباتية التي تضم إما البكتيريا المسببة للأمراض النباتية أو البكتيريا الداخلية المفيدة.سيكون عرض الإجراء نيفيس لوبيز باغان ، طالب دكتوراه من مختبرنا. للبدء ، املأ أصيصا بقطر 10 سم بمزيج ركيزة نبات الفيرميكوليت 1: 3 الذي تم تسويته مسبقا. غطي الوعاء بشبكة معدنية مثقبة واضبط الشبكة المعدنية على التربة الرطبة باستخدام شريط مطاطي.بعد ذلك ، زرع بذور Arabidopsis في ثقوب الشبكة المعدنية باستخدام مسواك مبلل. ضع ثلاث إلى أربع بذور في مواضع بعيدة داخل الأصيص. غطي الوعاء بقبة بلاستيكية للحفاظ على رطوبة نسبية عالية واحتضانه للتقسيم الطبقي عند أربع درجات مئوية لمدة 72 ساعة.انقل الوعاء إلى غرفة نمو النبات في ظل ظروف يوم قصير. للكشف عن الوعاء ، قم بإزالة القبة البلاستيكية. بمجرد أن تنبت البذور ، استخدم الملقط لإزالة معظم الشتلات ، مع الاحتفاظ بشتلة واحدة في كل موضع من مواضع الوعاء.ثم قم بإعداد نباتات الفاصوليا Phaseolus vulgaris عن طريق تغطية قاع طبق بتري بقطعة مبللة من منشفة ورقية ووضع بذور الفاصوليا فوقها. ختم طبق بتري بشريط جراحي واحتضانه عند 28 درجة مئوية لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام. انقل البذور النابتة إلى وعاء قطره 10 سم مملوء بمزيج ركيزة نبات الفيرميكوليت الرطب 1: 3 واحتضانه في غرفة نمو النبات في ظل إعدادات يوم طويل.قم بإخراج مخزون الجلسرين من سلالة Pseudomonas syringae ذات الأهمية من 80 درجة مئوية تحت الصفر في صفيحة LB مكملة بالمضادات الحيوية المناسبة. احتضان اللوحة عند 28 درجة مئوية لمدة 40 إلى 48 ساعة. كشط الكتلة الحيوية البكتيرية وإعادة تعليقها في خمسة ملليلتر من كلوريد المغنيسيوم 10 ملليمولار.قم بقياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر واضبطها على 0.1 بإضافة 10 مليمول من كلوريد المغنيسيوم. قم بإجراء التخفيفات التسلسلية في كلوريد المغنيسيوم 10 مليمولار للحصول على تركيز لقاح نهائي يبلغ خمسة في 10 إلى CFU الخامس لكل ملليلتر. ثم قم بإعداد 200 ملليلتر من اللقاح لنباتات أرابيدوبسيس و 50 ملليلتر لنباتات الفاصوليا.قبل التلقيح ، أضف الفاعل بالسطح Silwet L-77 إلى تركيز نهائي قدره 0.02٪ لتلقيح الفاصوليا و 0.01٪ ل Arabidopsis. لتسلل Arabidopsis ، ضع اثنين من العصي الخشبية لتشكيل X فوق القدر ووضع القدر متجها لأسفل فوق طبق بتري قطره 14 سم يحتوي على 200 مل من اللقاح. لتلقيح أوراق الفاصوليا ، أدخل النباتات ومحلول اللقاح في غرفة مفرغة وأدخل الورقة في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 ملليلتر يحتوي على اللقاح.أعط نبضة 500 مليبار لمدة 30 ثانية للتسلل إلى الأوراق. استنزاف محلول اللقاح الزائد بقطعة من الورق وأعد الخطط إلى غرفة النمو المقابلة لها. بعد أربعة أيام من التلقيح ، قم بقطع الجزء الجوي من نبات Arabidopsis أو الورقة الملقحة من نبات الفاصوليا ووضعها في حقنة سعة 20 مل بدون إبرة.بالنسبة لأوراق الفاصوليا ، لف الورقة على نفسها ، تاركا الوجه المحوري للخارج. أضف كمية كافية من الماء المقطر لتغطية الأنسجة. بعد ذلك ، أدخل المكبس الذي يحمل المحقنة في وضع رأسي وقم بإزالة الهواء الزائد وفقاعات الهواء داخل المحقنة عن طريق النقر برفق على البرميل حتى يقع كل الهواء بالقرب من الطرف ، وبعد إزالة الهواء ، قم بتغطية طرف برميل المحقنة بفيلم البارافين.الآن اضغط بعناية على المكبس لتوليد ضغط إيجابي حتى يصبح النسيج أغمق. ثم اسحب المكبس لتوليد ضغط سلبي. قم بإزالة فيلم البارافين والمكبس واجمع السائل الذي يحتوي على البكتيريا المستخرجة من أبوبلاست.لتحليل خلية واحدة ، قم بإعداد محلول أغاروز 1.5٪ في الماء المقطر. بمجرد الذوبان ، أضف حجما كافيا لملء الفراغ بين شريحتين مجهريتين موضوعتين جنبا إلى جنب وضع شريحة أخرى في الأعلى. دعهم يقودون لمدة 15 دقيقة وأزل الشريحة الموضوعة في الأعلى بعناية.باستخدام شفرة ، قم بقطع وسادة الأغاروز إلى قطع خمسة ملليمترات في خمسة ملليمترات قبل الاستخدام. بالتوازي ، أجهزة الطرد المركزي ملليمتر واحد من البكتيريا المستخرجة من apoplast. قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة وأعد تعليق الحبيبات في 20 ميكرولترا من الماء لتركيز الخلايا.ضع قطرة من الخلايا المركزة بحجم ميكرولتر على غطاء 0.17 ملم وقم بتغطية القطرة بقطعة من وسادة الأغاروز. تصور التحضير البكتيري تحت المجهر متحد البؤر لتحديد البكتيريا الفلورية الخضراء باستخدام ليزر معين. تحديد جميع البكتيريا باستخدام المجال الساطع ودمج كلا الحقلين.لإجراء التحليل عن طريق قياس التدفق الخلوي ، خذ حصة من معلقات البكتيريا المستخرجة من apoplast. تحليل باستخدام مقياس التدفق الخلوي والحصول على 100،000 الأحداث. يتم مراقبة التعبير عن HRPL GFP بواسطة مضان GFP.تظهر الرسوم البيانية للرسم النقطي توزيع شدة التألق ل GFP مقابل حجم الخلية في السكان ، بينما تظهر الرسوم البيانية شدة مضان GFP مقابل عدد الخلايا. كانت النسب المئوية ل hrpL ON أعلى من النسب المئوية المقابلة ل hrpL OFF. تظهر صور الفحص المجهري الفلوري مستويات غير متجانسة من GFP المرتبطة بالتعبير عن hrpL.لوحظت البكتيريا التي تظهر مضان GFP منخفض أو معدوم. للحصول على أفضل النتائج ، كن لطيفا أثناء خطوات استخراج البكتيريا لتجنب إتلاف الأنسجة النباتية وبالتالي الحد من التلوث من المحتوى الخلوي للنبات. يمكن استخدام عينات البكتيريا التي تم الحصول عليها لأغراض أخرى حيث يكون الحد من تلوث النبات ميزة ، مثل استخراج الحمض النووي للتحليل الجيني البكتيري أو النسخي اللاحق.

Research

JoVE Journal

Biology

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

وحيد الخلية في الجسم الحي Electroporation داخل الدماغ سليمة النامية

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

الروبوتات والتحليل الديناميكي صورة للدراسات في التعبير الجيني في أنسجة النبات

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

إعادة إعماره في المختبر من أحدث T. castaneum تيلوميراز

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

تحليل التعبير عن الأنواع الفرعية رابط-هيستون الثدييات

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure.  H1 is essential ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

مضان-المجهري الفحص والجيل القادم التسلسل الجيني: أدوات مفيدة لتحديد الجينات المسؤولة عن النزاهة العضيم

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

تحليل الحمض النووي الريبي العالمي التجميعي على مستوى خلية واحدة نقص الأكسجة التالي

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

التصوير إعادة التنظيم المكاني لMAPK اشارة المسار باستخدام نظام التعبير عابر التبغ

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

بروتوكول CUBIC يتصور التعبير البروتين في قرار خلية واحدة في كامل الاستعدادات الجلد جبل

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

تصور التردد Stromule مع مضان المجهر

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

تشريح السمعية بولا بعد الولادة في الفئران: عزل العظام الأذن الوسطى وتحليل النسيجي

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...