Name: single-cell analysis of the expression of pseudomonas syringae genes within the plant tissue
Uploaded: 2022-10-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af projekttilskud RTI2018-095069-B-I00 finansieret af MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ og af "ERDP: A way of making Europe". J.S.R. blev finansieret af Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación (PAIDI 2020). N.L.P. blev finansieret af Project Grant P18-RT-2398 fra Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación.

1. Forberedelse af planter
<ol><li>Forbered Arabidopsis Col-0 planter ved at følge nedenstående trin.<ol><li>Fyld en krukke med en diameter på 10 cm med en 1:3 vermiculit-plantesubstratblanding (se materialetabel), der tidligere er vandet, og dæk potten med et 15 cm x 15 cm metalnet med 1,6 mm x 1,6 mm huller. Juster metalnettet til den våde jord ved hjælp af et gummibånd (figur 1A).</li>
		<li>Med et vådt tandstikker så Arabidopsis-frø i hullern...

<ol>
	<li>Weigel, W. A., Dersch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity:+A+bacterial+virulence+strategy.">Phenotypic heterogeneity: A bacterial virulence strategy.</a> Microbes and Infection. 20 (9-10), 570-577 (2018).</li><li>Hare, P. J., LaGree, T. J., Byrd, B. A., DeMarco, A. M., Mok, W. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+technologies+to+study+phenotypic+heterogeneity+and+bacterial+persisters.">Single-cell technologies to study phenotypic heterogeneity and bacterial persisters.</a> Microorganisms. 9 (11), 2277 (2021).</li><li>Mansfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top+10+plant+pathogenic+bacteria+in+molecular+plant+pathology.">Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13 (6), 614-629 (2012).</li><li>Morris, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+history+of+the+plant+pathogen+Pseudomonas+syringae+is+linked+to+the+water+cycle.">The life history of the plant pathogen Pseudomonas syringae is linked to the water cycle.</a> The ISME Journal. 2 (3), 321-334 (2008).</li><li>Rufi&#225;n, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+reveals+in+planta+dynamic+interactions+between+pathogenic,+avirulent+and+non-pathogenic+Pseudomonas+syringae+strains.">Confocal microscopy reveals in planta dynamic interactions between pathogenic, avirulent and non-pathogenic Pseudomonas syringae strains.</a> Molecular Plant Pathology. 19 (3), 537-551 (2018).</li><li>Macho, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+of+plant+cellular+functions+by+bacterial+type-III+effectors:+Beyond+suppression+of+immunity.">Subversion of plant cellular functions by bacterial type-III effectors: Beyond suppression of immunity.</a> New Phytologist. 210 (1), 51-57 (2016).</li><li>Xiao, Y., Hutcheson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+promoter+sequence+recognized+by+a+newly+identified+alternate+sigma+factor+directs+expression+of+pathogenicity+and+host+range+determinants+in+Pseudomonas+syringae.">A single promoter sequence recognized by a newly identified alternate sigma factor directs expression of pathogenicity and host range determinants in Pseudomonas syringae.</a> Journal of Bacteriology. 176 (10), 3089-3091 (1994).</li><li>Rufi&#225;n, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chromosome-located+transcriptional+fusions+to+fluorescent+proteins+for+single-cell+gene+expression+analysis+in+Pseudomonas+syringae.">Generating chromosome-located transcriptional fusions to fluorescent proteins for single-cell gene expression analysis in Pseudomonas syringae.</a> Methods in Molecular Biology. 1734, 183-199 (2018).</li><li>Rufian, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+syringae+differentiates+into+phenotypically+distinct+subpopulations+during+colonization+of+a+plant+host.">Pseudomonas syringae differentiates into phenotypically distinct subpopulations during colonization of a plant host.</a> Environmental Microbiology. 18 (10), 3593-3605 (2016).</li><li>Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+thaliana-Pseudomonas+syringae+interaction.">The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction.</a> Arabidopsis Book. 1, 0039 (2002).</li><li>Fouts, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomewide+identification+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000+promoters+controlled+by+the+HrpL+alternative+sigma+factor.">Genomewide identification of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 promoters controlled by the HrpL alternative sigma factor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2275-2280 (2002).</li><li>Huber, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Robust Statistics. , (1981).</li><li>Freed, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+screen+to+identify+promoters+conferring+high+levels+of+phenotypic+noise.">A simple screen to identify promoters conferring high levels of phenotypic noise.</a> PLoS Genetics. 4 (12), 1000307 (2008).</li><li>Hirano, S. S., Upper, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+in+the+leaf+ecosystem+with+emphasis+on+Pseudomonas+syringae-a+pathogen,+ice+nucleus,+and+epiphyte.">Bacteria in the leaf ecosystem with emphasis on Pseudomonas syringae-a pathogen, ice nucleus, and epiphyte.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (3), 624-653 (2000).</li><li>Lindeberg, M., Myers, C. R., Collmer, A., Schneider, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roadmap+to+new+virulence+determinants+in+Pseudomonas+syringae:+Insights+from+comparative+genomics+and+genome+organization.">Roadmap to new virulence determinants in Pseudomonas syringae: Insights from comparative genomics and genome organization.</a> Molecular Plant Microbe Interactions. 21 (6), 685-700 (2008).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+leaf+infiltration+assay+for+fine+characterization+of+plant+defense+responses+using+the+Arabidopsis+thaliana-Pseudomonas+syringae+pathosystem.">Bacterial leaf infiltration assay for fine characterization of plant defense responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae pathosystem.</a> Journal of Visualized Experiments. (104), e53364 (2015).</li><li>O'Leary, B. M., Rico, A., McCraw, S., Fones, H. N., Preston, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+infiltration-centrifugation+technique+for+extraction+of+apoplastic+fluid+from+plant+leaves+using+Phaseolus+vulgaris+as+an+example.">The infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using Phaseolus vulgaris as an example.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), e52113 (2014).</li><li>Tornero, P., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+quantifying+growth+of+phytopathogenic+bacteria+in+Arabidopsis+thaliana.">A high-throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 28 (4), 475-481 (2001).</li></ol>

Metoden, der præsenteres her, beskriver en ikke-invasiv procedure, der tillader infiltration af bakterier i plantens bladvæv, hvilket muliggør hurtig podning af store mængder, samtidig med at vævsforstyrrelse minimeres. Et af kendetegnene ved P. syringae-artskomplekset er evnen til at overleve og sprede sig inde i planteapoplasten og på planteoverfladen som epifyt14. Således kan muligheden for, at bakterierne ekstraheret ved hjælp af denne protokol kun kommer fra planteapoplasten,...

Patogene bakterier udviser forskelle i forskellige fænotyper, hvilket giver anledning til dannelse af subpopulationer inden for genetisk identiske populationer. Dette fænomen er kendt som fænotypisk heterogenitet og er blevet foreslået som en tilpasningsstrategi under bakterie-værtsinteraktioner1. Nylige fremskridt inden for den optiske opløsning af konfokale mikroskoper, flowcytometri og mikrofluidik kombineret med fluorescerende proteiner har fremmet enkeltcelleanalyser af bakteriepopulationer2.
Den gramnegative Pseudomonas syringae er en arketypisk plantepatogen bakterie på grund af både dens akademiske og økonomiske betydning3. Livscyklussen for P. syringae er knyttet til vandcyklussen4. P. syringae kommer ind i de intercellulære rum mellem mesofylcellerne, plantebladets apoplast, gennem naturlige åbninger såsom stomata eller sår5. En gang inden for apoplasten er P. syringae afhængig af type III-sekretionssystemet (T3SS) og de type III-translokerede effektorer (T3E) for at undertrykke planteimmunitet og manipulere plantecellulære funktioner til gavn for patogenet6. Ekspressionen af T3SS og T3E afhænger af masterregulatoren HrpL, en alternativ sigmafaktor, der binder til hrp-box-motiverne i promotorregionen af målgenerne7. 
Ved at generere kromosomlokaliserede transkriptionelle fusioner til fluorescerende proteingener nedstrøms for genet af interesse, kan man overvåge genekspression baseret på fluorescensniveauerne udsendt på enkeltcelleniveau8. Ved hjælp af denne metode er det blevet fastslået, at ekspressionen af hrpL er heterogen både inden for bakteriekulturer dyrket i laboratoriet og inden for bakteriepopulationer genvundet fra planten apoplast 8,9. Selvom genekspressionsanalyse på enkeltcelleniveau typisk udføres i bakteriekulturer dyrket i laboratoriemedier, kan sådanne analyser også udføres på bakteriepopulationer, der vokser i planten, hvilket giver værdifuld information om dannelsen af subpopulationer i den naturlige sammenhæng. En potentiel begrænsning for analysen af bakteriepopulationer ekstraheret fra planten er, at klassiske podningsmetoder ved sprøjtetrykinfiltration i apoplasten efterfulgt af bakterieekstraktion ved maceration af bladvævet typisk genererer en stor mængde cellulært planteaffald, der forstyrrer nedstrømsanalyse10. De fleste cellulære affald består af autofluorescerende fragmenter af kloroplaster, der overlapper GFP-fluorescens, hvilket resulterer i vildledende resultater.
Denne protokol beskriver processen med at analysere enkeltcelle genekspressionsheterogenitet i to modelpatosystemer: den dannet af P. syringae pv. tomatstamme DC3000 og Arabidopsis thaliana (Col-0), og den anden af P. syringae pv. phaseolicola stamme 1448A og bønneplanter (Phaseolus vulgaris cultivar Canadian Wonder). Der foreslås en podningsmetode baseret på vakuuminfiltration ved hjælp af et vakuumkammer og en pumpe, hvilket resulterer i en hurtig og skadefri metode til at infiltrere hele blade. Som en forbedring af konventionelle protokoller anvendes desuden en blidere metode til at ekstrahere bakteriepopulationen fra apoplasten, der signifikant reducerer vævsforstyrrelse, baseret på ekstraktion af apoplastisk væske ved at anvende cyklusser med positivt og negativt tryk ved hjælp af en lille mængde volumen i en sprøjte.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.17 mm coverslip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.6 x 1.6 mm metal mesh</td>
			<td>Buzifu</td>
			<td></td>
			<td>Fiberglass screen mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm diameter pots</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>140 mm Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological agar</td>
			<td>Roko</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope Stellaris</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSVerse cell analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin sulfate</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>G-0124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
			<td>Phytotechnology</td>
			<td>K378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant substrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet L-77</td>
			<td>Cromton Europe Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum chamber 25 cm diameter</td>
			<td>Kartell</td>
			<td>554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>GAST</td>
			<td>DOA-P504-BN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell analysis of the expression of pseudomonas syringae genes within the plant tissue

En overflod af patogene mikroorganismer angriber konstant planter. Pseudomonas syringae-artskomplekset omfatter gramnegative plantepatogene bakterier af særlig relevans for et stort antal værter. P. syringae kommer ind i planten fra bladoverfladen og multiplicerer hurtigt inden for apoplasten og danner mikrokolonier, der optager det intercellulære rum. Bakteriernes konstitutive ekspression af fluorescerende proteiner muliggør visualisering af mikrokolonierne og overvågning af infektionens udvikling på mikroskopisk niveau. Nylige fremskridt inden for enkeltcelleanalyse har afsløret den store kompleksitet, som klonale isogene bakteriepopulationer når frem til. Denne kompleksitet, kaldet fænotypisk heterogenitet, er konsekvensen af celle-til-celle forskelle i genekspression (ikke knyttet til genetiske forskelle) blandt bakteriesamfundet. For at analysere ekspressionen af individuelle loci på enkeltcelleniveau er transkriptionelle fusioner til fluorescerende proteiner blevet anvendt i vid udstrækning. Under stressforhold, såsom dem, der forekommer under kolonisering af planteapoplasten, differentierer P. syringae sig i forskellige subpopulationer baseret på den heterogene ekspression af nøglevirulensgener (dvs. Hrp type III-sekretionssystemet). Imidlertid er enkeltcelleanalyse af en given P. syringae-population , der er genvundet fra plantevæv, udfordrende på grund af det cellulære affald, der frigives under den mekaniske forstyrrelse, der er iboende i podnings- og bakterieekstraktionsprocesserne. Denne rapport beskriver en metode udviklet til at overvåge ekspressionen af P. syringae-gener af interesse på enkeltcelleniveau under koloniseringen af Arabidopsis og bønneplanter. Fremstillingen af planterne og de bakteriesuspensioner, der anvendes til podning ved hjælp af et vakuumkammer, er beskrevet. Genoprettelsen af endofytiske bakterier fra inficerede blade ved apoplastisk væskeekstraktion forklares også her. Både bakteriepodnings- og bakterieekstraktionsmetoderne er empirisk optimeret for at minimere plante- og bakteriecelleskader, hvilket resulterer i bakterielle præparater, der er optimale til mikroskopi og flowcytometrianalyse.

Ekspressionen af type III-sekretionssystemet er afgørende for bakterievækst i planten. Den rettidige ekspression af T3SS-gener opnås gennem indviklet regulering, hvis centrum er den ekstracytoplasmatiske funktion (ECF) sigmafaktor HrpL, nøgleaktivatoren for ekspressionen af T3SS-relaterede gener11. En analyse af ekspressionen af hrpL blev tidligere udført under anvendelse af en kromosomlokaliseret transkriptionel fusion til et nedstrøms promotorløst gfp-gen og ved at følg...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue at JoVE.com

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

Denne protokol beskriver en metode, der tillader enkeltcelle genekspressionsanalyse på Pseudomonas syringae-populationer dyrket inden for planteapoplasten.

Enkeltcelleanalyse af ekspressionen af Pseudomonas syringae-gener i plantevævet

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic ...

Vores protokol giver en skånsom planteinokulations- og ekstraktionsmetode, der gør det muligt at genvinde bakteriepopulationer dyrket i bladapoplasten, der er egnet til enkeltcelle genekspressionsanalyse såsom flowcytometri. Denne metode tillader ekstraktion af en betydelig mængde bakterier fra apoplasten uden signifikant forurening af prøverne med plantecellulært affald. Denne optimerede metode til genvinding af apoplastiske bakterier kan anvendes direkte eller med mindre ændringer på en række plantebakterielle systemer, der omfatter enten plantepatogene bakterier eller gavnlige endocytiske bakterier.Demonstration af proceduren vil være Nieves Lopez-Pagan, en ph.d.-studerende fra vores laboratorium. Til at begynde med skal du fylde en gryde med en diameter på 10 centimeter med tidligere vandet 1: 3 vermiculit plantesubstratblanding. Dæk gryden med et perforeret metalnet og juster metalnettet til den våde jord ved hjælp af et gummibånd.Så derefter Arabidopsis-frø i hullerne i metalnettet med et vådt tandstikker. Placer tre til fire frø i fjerne positioner i potten. Dæk gryden med en plastikkuppel for at opretholde høj relativ luftfugtighed og inkuber til stratificering ved fire grader Celsius i 72 timer.Overfør potten til et plantevækstkammer under korte dagsforhold. For at afdække gryden skal du fjerne plastkuplen. Når frøene er spiret, skal du bruge pincetten til at fjerne de fleste frøplanter og holde en frøplante i hver af pottens positioner.Forbered derefter Phaseolus vulgaris bønneplanter ved at dække bunden af en petriskål med et vådt stykke køkkenrulle og placere bønnefrøene oven på det. Forsegl petriskålen med kirurgisk tape og inkuber ved 28 grader Celsius i tre til fire dage. Overfør de spirede frø til en 10 centimeter diameter gryde fyldt med våd 1: 3 vermiculit plantesubstrat, bland og inkuber i et plantevækstkammer under lange dagsindstillinger.Stribe glycerolstammen af Pseudomonas syringae-stamme af interesse fra minus 80 grader Celsius ud i en LB-plade suppleret med de relevante antibiotika. Inkuber pladen ved 28 grader Celsius i 40 til 48 timer. Skrab bakteriebiomassen og resuspender den i fem ml 10 millimolært magnesiumchlorid.Mål den optiske densitet ved 600 nanometer og juster den til 0,1 ved at tilføje 10 millimolært magnesiumchlorid. Udfør serielle fortyndinger i 10 millimolært magnesiumchlorid for at få en endelig inokulumkoncentration på fem gange 10 til den femte CFU pr. milliliter. Forbered derefter 200 ml inokulum til Arabidopsis-planterne og 50 ml til bønneplanterne.Før podning tilsættes det overfladeaktive stof Silwet L-77 til en endelig koncentration på 0,02% til bønnepodning og 0,01% til arabidopsis. Til Arabidopsis-infiltration skal du placere to træpinde, der danner et X over gryden, og placere potten nedad over en petriskål med en diameter på 14 centimeter, der indeholder 200 ml podning. Til podning af bønneblade indsættes planterne og inokulumopløsningen i et vakuumkammer og indfører bladet i et 50 ml konisk centrifugerør indeholdende inokulumet.Giv en puls på 500 millibar i 30 sekunder for at infiltrere bladene. Tøm overskydende inokulumopløsning med et stykke papir og returner planerne til deres tilsvarende vækstkammer. Fire dage efter podning skal du skære enten luftdelen af Arabidopsis-planten eller det inokulerede blad fra bønneplanten og placere det i en 20 ml sprøjte uden en nål.For bønneblade skal du rulle bladet på sig selv og efterlade det abaxiale ansigt udad. Tilsæt nok volumen destilleret vand til at dække vævet. Indsæt derefter stemplet, der holder sprøjten, i lodret position, og fjern overskydende luft og luftbobler inde i sprøjten ved forsigtigt at banke på cylinderen, indtil al luften er placeret nær spidsen, og dæk spidsen af sprøjtecylinderen med paraffinfilm, når du har fjernet luften.Tryk nu forsigtigt på stemplet for at generere positivt tryk, indtil vævet bliver mørkere. Træk derefter i stemplet for at generere undertryk. Fjern paraffinfilmen og stemplet og opsaml væsken indeholdende de apoplastekstraherede bakterier.Til en enkeltcelleanalyse fremstilles en 1,5% agaroseopløsning i destilleret vand. Når du er smeltet, skal du tilføje nok volumen til at udfylde mellemrummet mellem to mikroskopi-dias side om side og placere et andet dias ovenpå. Lad dem køre i 15 minutter, og fjern forsigtigt diaset, der er placeret øverst.Brug et blad til at skære agarosepuden i fem millimeter gange fem millimeter stykker før brug. Parallelt centrifugeres en millimeter af de apoplastekstraherede bakterier. Supernatanten fjernes forsigtigt med en pipette og opslæmmes igen i 20 mikroliter vand for at koncentrere cellerne.Placer en dråbe på to mikroliter af de koncentrerede celler på en 0,17 millimeter dæksel og dæk dråben med et stykke agarosepude. Visualiser bakteriepræparatet under det konfokale mikroskop for at identificere grønne fluorescerende bakterier ved hjælp af specifikke lasere. Identificer alle bakterierne ved hjælp af lysfeltet og flet begge felter.For at udføre analyse ved flowcytometri skal du tage en prøve af de apoplastekstraherede bakteriesuspensioner. Analyser ved hjælp af flowcytometeret og erhverver 100.000 begivenheder. Ekspression af hrpL GFP overvåges ved GFP-fluorescens.Prikplotgraferne viser fluorescensintensitetsfordelingen af GFP versus cellestørrelse i befolkningen, mens histogrammerne viser fluorescensintensiteten af GFP versus celletal. HrpL ON-procenterne var højere end de tilsvarende procentdele af hrpL OFF. Fluorescensmikroskopibilleder viser heterogene niveauer af GFP forbundet med ekspressionen af hrpL.Bakterierne, der viser lav eller ingen GFP-fluorescens, observeres. For optimale resultater skal du være forsigtig under bakterieekstraktionstrinnene for at undgå at beskadige plantevævet og dermed begrænse forurening fra plantens cellulære indhold. De opnåede bakterieprøver kan anvendes til andre formål, hvor reduktion af planteforurening er en fordel, såsom nukleinsyreekstraktioner til efterfølgende bakteriel genomisk eller transkriptomisk analyse.

Research

JoVE Journal

Biology

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

Ekspression Analyse af mammale Linker-histon Undertyper

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure.  H1 is essential ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Fluorescens-mikroskopi Screening og næste generation sekventering: Nyttige værktøjer til identifikation af gener involveret i organel Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analyse af Global RNA-syntese på enkelt celle niveau efter Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Imaging Rumlig Reorganisering af et MAPK signalvej Brug af tobak Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

CUBIC protokol Visualiserer Protein Expression på Single Cell Opløsning i Whole Mount Skin Forberedelser

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Visualisere Stromule Frekvens med Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

Dissektion af Auditory Bulla i postnatale mus: Isolering af mellemøret Knogler og Histologisk analyse

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...