Name: single-cell analysis of the expression of pseudomonas syringae genes within the plant tissue
Uploaded: 2022-10-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door projectsubsidie RTI2018-095069-B-I00, gefinancierd door MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ en door "ERDP: A way of making Europe". J.S.R. werd gefinancierd door Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación (PAIDI 2020). N.L.P. werd gefinancierd door Project Grant P18-RT-2398 van Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación.

1. Plantvoorbereiding
<ol><li>Bereid Arabidopsis Col-0 planten voor volgens de onderstaande stappen.<ol><li>Vul een pot met een diameter van 10 cm met een 1:3 vermiculiet-plantensubstraatmengsel (zie materiaaltabel), eerder bewaterd, en bedek de pot met een metalen gaas van 15 cm x 15 cm met gaten van 1,6 mm x 1,6 mm. Pas het metalen gaas aan op de natte grond met behulp van een elastiekje (figuur 1A).</li>
		<li>Zaai met een natte tandenstoker Arabidopsis...

<ol>
	<li>Weigel, W. A., Dersch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity:+A+bacterial+virulence+strategy.">Phenotypic heterogeneity: A bacterial virulence strategy.</a> Microbes and Infection. 20 (9-10), 570-577 (2018).</li><li>Hare, P. J., LaGree, T. J., Byrd, B. A., DeMarco, A. M., Mok, W. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+technologies+to+study+phenotypic+heterogeneity+and+bacterial+persisters.">Single-cell technologies to study phenotypic heterogeneity and bacterial persisters.</a> Microorganisms. 9 (11), 2277 (2021).</li><li>Mansfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top+10+plant+pathogenic+bacteria+in+molecular+plant+pathology.">Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13 (6), 614-629 (2012).</li><li>Morris, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+history+of+the+plant+pathogen+Pseudomonas+syringae+is+linked+to+the+water+cycle.">The life history of the plant pathogen Pseudomonas syringae is linked to the water cycle.</a> The ISME Journal. 2 (3), 321-334 (2008).</li><li>Rufi&#225;n, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+reveals+in+planta+dynamic+interactions+between+pathogenic,+avirulent+and+non-pathogenic+Pseudomonas+syringae+strains.">Confocal microscopy reveals in planta dynamic interactions between pathogenic, avirulent and non-pathogenic Pseudomonas syringae strains.</a> Molecular Plant Pathology. 19 (3), 537-551 (2018).</li><li>Macho, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+of+plant+cellular+functions+by+bacterial+type-III+effectors:+Beyond+suppression+of+immunity.">Subversion of plant cellular functions by bacterial type-III effectors: Beyond suppression of immunity.</a> New Phytologist. 210 (1), 51-57 (2016).</li><li>Xiao, Y., Hutcheson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+promoter+sequence+recognized+by+a+newly+identified+alternate+sigma+factor+directs+expression+of+pathogenicity+and+host+range+determinants+in+Pseudomonas+syringae.">A single promoter sequence recognized by a newly identified alternate sigma factor directs expression of pathogenicity and host range determinants in Pseudomonas syringae.</a> Journal of Bacteriology. 176 (10), 3089-3091 (1994).</li><li>Rufi&#225;n, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chromosome-located+transcriptional+fusions+to+fluorescent+proteins+for+single-cell+gene+expression+analysis+in+Pseudomonas+syringae.">Generating chromosome-located transcriptional fusions to fluorescent proteins for single-cell gene expression analysis in Pseudomonas syringae.</a> Methods in Molecular Biology. 1734, 183-199 (2018).</li><li>Rufian, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+syringae+differentiates+into+phenotypically+distinct+subpopulations+during+colonization+of+a+plant+host.">Pseudomonas syringae differentiates into phenotypically distinct subpopulations during colonization of a plant host.</a> Environmental Microbiology. 18 (10), 3593-3605 (2016).</li><li>Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+thaliana-Pseudomonas+syringae+interaction.">The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction.</a> Arabidopsis Book. 1, 0039 (2002).</li><li>Fouts, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomewide+identification+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000+promoters+controlled+by+the+HrpL+alternative+sigma+factor.">Genomewide identification of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 promoters controlled by the HrpL alternative sigma factor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2275-2280 (2002).</li><li>Huber, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Robust Statistics. , (1981).</li><li>Freed, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+screen+to+identify+promoters+conferring+high+levels+of+phenotypic+noise.">A simple screen to identify promoters conferring high levels of phenotypic noise.</a> PLoS Genetics. 4 (12), 1000307 (2008).</li><li>Hirano, S. S., Upper, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+in+the+leaf+ecosystem+with+emphasis+on+Pseudomonas+syringae-a+pathogen,+ice+nucleus,+and+epiphyte.">Bacteria in the leaf ecosystem with emphasis on Pseudomonas syringae-a pathogen, ice nucleus, and epiphyte.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (3), 624-653 (2000).</li><li>Lindeberg, M., Myers, C. R., Collmer, A., Schneider, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roadmap+to+new+virulence+determinants+in+Pseudomonas+syringae:+Insights+from+comparative+genomics+and+genome+organization.">Roadmap to new virulence determinants in Pseudomonas syringae: Insights from comparative genomics and genome organization.</a> Molecular Plant Microbe Interactions. 21 (6), 685-700 (2008).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+leaf+infiltration+assay+for+fine+characterization+of+plant+defense+responses+using+the+Arabidopsis+thaliana-Pseudomonas+syringae+pathosystem.">Bacterial leaf infiltration assay for fine characterization of plant defense responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae pathosystem.</a> Journal of Visualized Experiments. (104), e53364 (2015).</li><li>O'Leary, B. M., Rico, A., McCraw, S., Fones, H. N., Preston, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+infiltration-centrifugation+technique+for+extraction+of+apoplastic+fluid+from+plant+leaves+using+Phaseolus+vulgaris+as+an+example.">The infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using Phaseolus vulgaris as an example.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), e52113 (2014).</li><li>Tornero, P., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+quantifying+growth+of+phytopathogenic+bacteria+in+Arabidopsis+thaliana.">A high-throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 28 (4), 475-481 (2001).</li></ol>

De hier gepresenteerde methode beschrijft een niet-invasieve procedure die de infiltratie van bacteriën in het bladweefsel van planten mogelijk maakt, waardoor de snelle inenting van grote volumes mogelijk is en tegelijkertijd weefselverstoring wordt geminimaliseerd. Een van de kenmerken van het P. syringae-soortencomplex is het vermogen om te overleven en zich te vermenigvuldigen in de plantenapoplast en op het plantoppervlak als epifyt14. De mogelijkheid dat de bacteriën die volgens h...

Pathogene bacteriën vertonen verschillen in verschillende fenotypen, wat aanleiding geeft tot de vorming van subpopulaties binnen genetisch identieke populaties. Dit fenomeen staat bekend als fenotypische heterogeniteit en is voorgesteld als een aanpassingsstrategie tijdens interacties tussen bacteriënen gastheer 1. Recente ontwikkelingen in de optische resolutie van confocale microscopen, flowcytometrie en microfluïdica, gecombineerd met fluorescerende eiwitten, hebben eencellige analyses van bacteriële populaties bevorderd2.
De Gram-negatieve Pseudomonas syringae is een archetypische plantpathogene bacterie vanwege zowel zijn academische als economische belang3. De levenscyclus van P. syringae is gekoppeld aan de watercyclus4. P. syringae komt de intercellulaire ruimtes tussen de mesofylcellen, de apoplast van het plantenblad, binnen via natuurlijke openingen zoals huidmondjes of wonden5. Eenmaal in de apoplast vertrouwt P. syringae op het type III-secretiesysteem (T3SS) en de type III-getransloceerde effectoren (T3E) om de immuniteit van planten te onderdrukken en de cellulaire functies van planten te manipuleren ten behoeve van de ziekteverwekker6. De expressie van T3SS en T3E is afhankelijk van de hoofdregulator HrpL, een alternatieve sigmafactor die zich bindt aan de hrp-boxmotieven in het promotorgebied van dedoelgenen 7. 
Door chromosoom-gelokaliseerde transcriptionele fusies te genereren naar fluorescerende eiwitgenen stroomafwaarts van het gen van belang, kan men genexpressie volgen op basis van de fluorescentieniveaus die worden uitgezonden op het niveau van één cel8. Met behulp van deze methode is vastgesteld dat de expressie van hrpL heterogeen is, zowel binnen bacterieculturen die in het laboratorium worden gekweekt als binnen bacteriepopulaties die zijn hersteld uit de plant apoplast 8,9. Hoewel genexpressieanalyse op eencellig niveau meestal wordt uitgevoerd in bacterieculturen die in laboratoriummedia worden gekweekt, kunnen dergelijke analyses ook worden uitgevoerd op bacteriepopulaties die in de plant groeien, waardoor waardevolle informatie wordt verkregen over de vorming van subpopulaties in de natuurlijke context. Een mogelijke beperking voor de analyse van bacteriële populaties die uit de plant worden geëxtraheerd, is dat klassieke inentingsmethoden door infiltratie van de spuitdruk in de apoplast, gevolgd door bacteriële extractie door maceratie van het bladweefsel, meestal een grote hoeveelheid cellulair plantenresten genereren die de stroomafwaartse analyse verstoort10. Het meeste cellulaire puin bestaat uit autofluorescerende fragmenten van chloroplasten die overlappen met GFP-fluorescentie, wat resulteert in misleidende resultaten.
Het huidige protocol beschrijft het proces van het analyseren van heterogeniteit van eencellige genexpressie in twee modelpathosystemen: die gevormd door de P. syringae pv. tomatenstam DC3000 en Arabidopsis thaliana (Col-0), en de andere door de P. syringae pv. phaseolicola stam 1448A en bonenplanten (Phaseolus vulgaris cultivar Canadian Wonder). Een inentingsmethode wordt voorgesteld op basis van vacuüminfiltratie met behulp van een vacuümkamer en een pomp, wat resulteert in een snelle en schadevrije methode om hele bladeren te infiltreren. Bovendien wordt, als een verbetering van conventionele protocollen, een zachtere methode gebruikt om de bacteriële populatie uit de apoplast te extraheren die weefselverstoring aanzienlijk vermindert, gebaseerd op de extractie van apoplastische vloeistof door cycli van positieve en negatieve druk toe te passen met behulp van een kleine hoeveelheid volume in een spuit.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.17 mm coverslip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.6 x 1.6 mm metal mesh</td>
			<td>Buzifu</td>
			<td></td>
			<td>Fiberglass screen mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm diameter pots</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>140 mm Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological agar</td>
			<td>Roko</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope Stellaris</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSVerse cell analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin sulfate</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>G-0124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
			<td>Phytotechnology</td>
			<td>K378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant substrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet L-77</td>
			<td>Cromton Europe Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum chamber 25 cm diameter</td>
			<td>Kartell</td>
			<td>554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>GAST</td>
			<td>DOA-P504-BN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell analysis of the expression of pseudomonas syringae genes within the plant tissue

Een overvloed aan pathogene micro-organismen vallen voortdurend planten aan. Het Pseudomonas syringae-soortencomplex omvat Gram-negatieve plantpathogene bacteriën van bijzonder belang voor een groot aantal gastheren. P. syringae komt de plant binnen vanaf het bladoppervlak en vermenigvuldigt zich snel binnen de apoplast en vormt microkolonies die de intercellulaire ruimte bezetten. De constitutieve expressie van fluorescerende eiwitten door de bacteriën maakt visualisatie van de microkolonies mogelijk en monitoring van de ontwikkeling van de infectie op microscopisch niveau. Recente ontwikkelingen in eencellige analyse hebben de grote complexiteit aangetoond die wordt bereikt door klonale isogene bacteriële populaties. Deze complexiteit, fenotypische heterogeniteit genoemd, is het gevolg van cel-tot-cel verschillen in genexpressie (niet gekoppeld aan genetische verschillen) tussen de bacteriële gemeenschap. Om de expressie van individuele loci op eencellig niveau te analyseren, zijn transcriptionele fusies met fluorescerende eiwitten op grote schaal gebruikt. Onder stressomstandigheden, zoals die optreden tijdens de kolonisatie van de apoplast van de plant, differentieert P. syringae in verschillende subpopulaties op basis van de heterogene expressie van belangrijke virulentiegenen (d.w.z. het Hrp type III-secretiesysteem). Eencellige analyse van een bepaalde P. syringae-populatie hersteld uit plantenweefsel is echter een uitdaging vanwege het cellulaire puin dat vrijkomt tijdens de mechanische verstoring die inherent is aan de inentings- en bacteriële extractieprocessen. Het huidige rapport beschrijft een methode die is ontwikkeld om de expressie van P. syringae-genen van belang op eencellig niveau te volgen tijdens de kolonisatie van Arabidopsis en bonenplanten. De bereiding van de planten en de bacteriële suspensies die worden gebruikt voor inenting met behulp van een vacuümkamer worden beschreven. Het herstel van endofytische bacteriën uit geïnfecteerde bladeren door apoplastische vloeistofextractie wordt hier ook uitgelegd. Zowel de bacteriële inentings- als de bacteriële extractiemethoden zijn empirisch geoptimaliseerd om schade aan planten en bacteriële cellen te minimaliseren, wat resulteert in bacteriële preparaten die optimaal zijn voor microscopie en flowcytometrie-analyse.

De expressie van het type III secretiesysteem is essentieel voor de bacteriegroei in de plant. De tijdige expressie van T3SS-genen wordt bereikt door ingewikkelde regulatie, met als middelpunt de extracytoplasmatische functie (ECF) sigmafactor HrpL, de belangrijkste activator van de expressie van T3SS-gerelateerde genen11. Een analyse van de expressie van hrpL werd eerder uitgevoerd met behulp van een chromosoom-gelokaliseerde transcriptionele fusie naar een downstream promotorloos gf...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue at JoVE.com

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

Het huidige protocol beschrijft een methode die eencellige genexpressieanalyse mogelijk maakt op Pseudomonas syringae-populaties die in de apoplast van de plant worden gekweekt.

Eencellige analyse van de expressie van Pseudomonas syringae-genen in het plantenweefsel

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic ...

Ons protocol biedt een zachte planteninentings- en extractiemethode waarmee bacteriepopulaties die in de bladapoplast zijn gekweekt, kunnen worden hersteld die geschikt zijn voor eencellige genexpressieanalyse zoals flowcytometrie. Deze methode maakt de extractie van een aanzienlijke hoeveelheid bacteriën uit de apoplast mogelijk zonder de monsters aanzienlijk te besmetten met plantencellulair afval. Deze geoptimaliseerde methode voor het herstel van apoplastische bacteriën kan direct of met kleine aanpassingen worden toegepast op een aantal plantaardige bacteriële systemen die bestaan uit plantpathogene bacteriën of nuttige endocytische bacteriën.De procedure wordt gedemonstreerd door Nieves Lopez-Pagan, een promovendus van ons laboratorium. Vul om te beginnen een pot met een diameter van 10 centimeter met eerder bewaterde 1:3 vermiculiet plantensubstraatmix. Dek de pot af met een geperforeerd metalen gaas en pas het metalen gaas aan op de natte grond met behulp van een elastiekje.Zaai vervolgens Arabidopsis-zaden in de gaten van het metalen gaas met een natte tandenstoker. Plaats drie tot vier zaden op verre plaatsen in de pot. Bedek de pot met een plastic koepel om een hoge relatieve luchtvochtigheid te behouden en incuber voor stratificatie bij vier graden Celsius gedurende 72 uur.Breng de pot over naar een plantengroeikamer onder omstandigheden van korte dagen. Om de pot bloot te leggen, verwijdert u de plastic koepel. Zodra de zaden zijn ontkiemd, gebruikt u het pincet om de meeste zaailingen te verwijderen en één zaailing in elk van de posities van de pot te houden.Bereid vervolgens Phaseolus vulgaris bonenplanten door de bodem van een petrischaal te bedekken met een nat stuk keukenpapier en de bonenzaden erop te leggen. Sluit de petrischaal af met chirurgische tape en incubeer drie tot vier dagen bij 28 graden Celsius. Breng de gekiemde zaden over in een pot met een diameter van 10 centimeter gevuld met natte 1:3 vermiculiet plantensubstraatmix en incubeer in een plantengroeikamer onder langdurige omgevingen.Streep de glycerolvoorraad van Pseudomonas syringae-stam van belang van min 80 graden Celsius uit in een LB-plaat aangevuld met de juiste antibiotica. Incubeer de plaat bij 28 graden Celsius gedurende 40 tot 48 uur. Schraap de bacteriële biomassa en resuspensie in vijf milliliter 10-millimolair magnesiumchloride.Meet de optische dichtheid op 600 nanometer en stel deze in op 0,1 door 10 millimolair magnesiumchloride toe te voegen. Voer seriële verdunningen uit in 10-millimolair magnesiumchloride om een uiteindelijke entconcentratie van vijf keer 10 tot de vijfde CFU per milliliter te krijgen. Bereid vervolgens 200 milliliter entmateriaal voor de Arabidopsis-planten en 50 milliliter voor de bonenplanten.Voeg vóór de inenting de oppervlakteactieve stof Silwet L-77 toe aan een eindconcentratie van 0,02% voor boneninenting en 0,01% voor Arabidopsis. Voor Arabidopsis-infiltratie plaatst u twee houten stokken die een X vormen over de pot en plaatst u de pot met de voorkant naar beneden over een petrischaal met een diameter van 14 centimeter met 200 milliliter entmateriaal. Voor inenting van bonenbladeren plaatst u de planten en de entoplossing in een vacuümkamer en brengt u het blad in een conische centrifugebuis van 50 milliliter met het entmateriaal.Geef een puls van 500 millibar gedurende 30 seconden om de bladeren te infiltreren. Giet de overtollige entoplossing af met een stuk papier en breng de plannen terug naar de bijbehorende groeikamer. Snijd vier dagen na de inenting het bovenste deel van de Arabidopsis-plant of het geënte blad van de bonenplant en plaats het in een spuit van 20 milliliter zonder naald.Voor bonenbladeren rolt u het blad op zichzelf en laat u het abaxiale gezicht naar buiten. Voeg voldoende volume gedestilleerd water toe om het weefsel te bedekken. Plaats vervolgens de zuiger die de spuit rechtop houdt en verwijder de overtollige lucht en luchtbellen in de spuit door zachtjes op het vat te tikken totdat alle lucht zich in de buurt van de punt bevindt en, na het verwijderen van de lucht, bedek de punt van de spuitvat met paraffinefilm.Druk nu voorzichtig op de zuiger om positieve druk te genereren totdat het weefsel donkerder wordt. Trek vervolgens aan de zuiger om negatieve druk te genereren. Verwijder de paraffinefilm en de zuiger en verzamel de vloeistof met de apoplast-geëxtraheerde bacteriën.Bereid voor een eencellige analyse een 1,5% agarose-oplossing in gedestilleerd water. Eenmaal gesmolten, voeg je voldoende volume toe om de ruimte tussen twee microscopiedia's naast elkaar te vullen en plaats je er nog een dia op. Laat ze 15 minuten rijden en verwijder de schuif die op de bovenkant is geplaatst voorzichtig.Snijd met een mesje het agarosekussen voor gebruik in stukjes van vijf millimeter bij vijf millimeter. Parallel centrifugeer je een millimeter van de apoplast-geëxtraheerde bacteriën. Verwijder het supernatant voorzichtig met behulp van een pipet en resuspensie de pellet in 20 microliter water om de cellen te concentreren.Plaats een druppel van twee microliter van de geconcentreerde cellen op een afdekplaat van 0,17 millimeter en bedek de druppel met een stuk agarosepad. Visualiseer het bacteriële preparaat onder de confocale microscoop om groene fluorescerende bacteriën te identificeren met behulp van specifieke lasers. Identificeer alle bacteriën met behulp van het heldere veld en voeg beide velden samen.Om de analyse door flowcytometrie uit te voeren, neemt u een aliquot van de apoplast-geëxtraheerde bacteriesuspensies. Analyseer met behulp van de flowcytometer en verzamel 100.000 gebeurtenissen. Expressie van hrpL GFP wordt gecontroleerd door GFP-fluorescentie.De dot plot grafieken tonen de fluorescentie-intensiteitsverdeling van GFP versus celgrootte in de populatie, terwijl de histogrammen de fluorescentie-intensiteit van GFP versus celtellingen tonen. De hrpL ON percentages waren hoger dan de overeenkomstige percentages van hrpL OFF. Fluorescentie microscopie beelden tonen heterogene niveaus van GFP geassocieerd met de expressie van hrpL.De bacteriën met een lage of geen GFP-fluorescentie worden waargenomen. Voor optimale resultaten, wees voorzichtig tijdens de bacterie-extractiestappen om te voorkomen dat het plantenweefsel wordt beschadigd en zo besmetting door de cellulaire inhoud van de plant wordt beperkt. De verkregen bacteriemonsters kunnen worden gebruikt voor andere doeleinden waar het verminderen van plantenverontreiniging een voordeel is, zoals nucleïnezuurextracties voor daaropvolgende bacteriële genomische of transcriptomische analyse.

Research

JoVE Journal

Biology

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single Cell Elektroporatie in vivo binnen de Intact ontwikkeling van de hersenen

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Robotica en Dynamic Image Analysis voor Studies van genexpressie in plantenweefsels

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro reconstitutie van de Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

Expressie analyse van zoogdieren Linker-histon Subtypes

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure.  H1 is essential ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Fluorescentie-microscopie Screening en next-generation sequencing: Handige hulpmiddelen voor de identificatie van genen betrokken bij organel Integriteit

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analyse van Global RNA synthese in de Single Cell Level volgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Beeldvorming Ruimtelijke Reorganisatie van een MAPK signaalroute Met behulp van de Tabak Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

CUBIC Protocol Visualiseert Protein Expression op enkel cel resolutie in Whole Mount Skin Voorbereidingen

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Visualiseren Stromule Frequency met fluorescentiemicroscopie

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

Dissectie van de auditieve Bulla in postnatale muizen: Isolatie van het middenoor botten en histologische analyse

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...