Name: single-cell analysis of the expression of pseudomonas syringae genes within the plant tissue
Uploaded: 2022-10-06T15:00:00
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Ce travail a été soutenu par la subvention Projet RTI2018-095069-B-I00 financée par MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ et par « ERDP A way to Making Europe ». J.S.R. a été financé par Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación (PAIDI 2020). N.L.P. a été financé par la subvention de projet P18-RT-2398 de Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación.

1. Préparation des plantes
<ol><li>Préparez les plantes d’Arabidopsis Col-0 en suivant les étapes ci-dessous.<ol><li>Remplissez un pot de 10 cm de diamètre avec un mélange de substrat vermiculite-plante de 1:3 (voir le tableau des matières), préalablement arrosé, et couvrez le pot d’un treillis métallique de 15 cm x 15 cm avec des trous de 1,6 mm x 1,6 mm. Ajustez le treillis métallique au sol humide à l’aide d’un élastique (figure 1A)....

<ol>
	<li>Weigel, W. A., Dersch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity:+A+bacterial+virulence+strategy.">Phenotypic heterogeneity: A bacterial virulence strategy.</a> Microbes and Infection. 20 (9-10), 570-577 (2018).</li><li>Hare, P. J., LaGree, T. J., Byrd, B. A., DeMarco, A. M., Mok, W. W. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+screen+to+identify+promoters+conferring+high+levels+of+phenotypic+noise.">A simple screen to identify promoters conferring high levels of phenotypic noise.</a> PLoS Genetics. 4 (12), 1000307 (2008).</li><li>Hirano, S. S., Upper, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+in+the+leaf+ecosystem+with+emphasis+on+Pseudomonas+syringae-a+pathogen,+ice+nucleus,+and+epiphyte.">Bacteria in the leaf ecosystem with emphasis on Pseudomonas syringae-a pathogen, ice nucleus, and epiphyte.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (3), 624-653 (2000).</li><li>Lindeberg, M., Myers, C. R., Collmer, A., Schneider, D. 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(104), e53364 (2015).</li><li>O'Leary, B. M., Rico, A., McCraw, S., Fones, H. N., Preston, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+infiltration-centrifugation+technique+for+extraction+of+apoplastic+fluid+from+plant+leaves+using+Phaseolus+vulgaris+as+an+example.">The infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using Phaseolus vulgaris as an example.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), e52113 (2014).</li><li>Tornero, P., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+quantifying+growth+of+phytopathogenic+bacteria+in+Arabidopsis+thaliana.">A high-throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 28 (4), 475-481 (2001).</li></ol>

La méthode présentée ici décrit une procédure non invasive qui permet l’infiltration de bactéries dans le tissu foliaire de la plante, permettant l’inoculation rapide de grands volumes tout en minimisant la perturbation tissulaire. L’une des caractéristiques du complexe d’espèces P. syringae est sa capacité à survivre et à proliférer à l’intérieur de l’apoplaste de la plante et à la surface de la plante en tant qu’épiphyte14. Ainsi, la possibilité que les ba...

Les bactéries pathogènes présentent des différences dans divers phénotypes, ce qui donne lieu à la formation de sous-populations au sein de populations génétiquement identiques. Ce phénomène est connu sous le nom d’hétérogénéité phénotypique et a été proposé comme stratégie d’adaptation lors des interactions bactérien-hôte1. Les progrès récents dans la résolution optique des microscopes confocaux, la cytométrie en flux et la microfluidique, combinés aux protéines fluorescentes, ont favorisé les analyses unicellulaires des populations bactériennes2.
La Pseudomonas syringae à Gram négatif est une bactérie phytopathogène archétypale en raison de son importance académique et économique3. Le cycle de vie de P. syringae est lié au cycle de l’eau4. P. syringae pénètre dans les espaces intercellulaires entre les cellules mésophylles, l’apoplaste foliaire de la plante, par des ouvertures naturelles telles que les stomates ou les plaies5. Une fois dans l’apoplaste, P. syringae s’appuie sur le système de sécrétion de type III (T3SS) et les effecteurs transloqués de type III (T3E) pour supprimer l’immunité des plantes et manipuler les fonctions cellulaires des plantes au profit de l’agent pathogène6. L’expression de T3SS et T3E dépend du régulateur maître HrpL, un facteur sigma alternatif qui se lie aux motifs hrp-box dans la région promotrice des gènes cibles7. 
En générant des fusions transcriptionnelles situées sur les chromosomes vers des gènes de protéines fluorescentes en aval du gène d’intérêt, on peut surveiller l’expression des gènes en fonction des niveaux de fluorescence émis au niveauunicellulaire 8. En utilisant cette méthode, il a été établi que l’expression de hrpL est hétérogène tant au sein des cultures bactériennes cultivées en laboratoire qu’au sein des populations bactériennes récupérées de la plante apoplast 8,9. Bien que l’analyse de l’expression génique au niveau d’une seule cellule soit généralement effectuée dans des cultures bactériennes cultivées dans des milieux de laboratoire, de telles analyses peuvent également être effectuées sur des populations bactériennes qui se développent dans la plante, fournissant ainsi des informations précieuses sur la formation de sous-populations dans le contexte naturel. Une limitation potentielle pour l’analyse des populations bactériennes extraites de la plante est que les méthodes classiques d’inoculation par infiltration sous pression de seringue dans l’apapoplaste, suivie d’une extraction bactérienne par macération du tissu foliaire, génèrent généralement une grande quantité de débris cellulaires végétaux qui interfèrent avec l’analyse en aval10. La plupart des débris cellulaires sont constitués de fragments autofluorescents de chloroplastes qui chevauchent la fluorescence GFP, ce qui entraîne des résultats trompeurs.
Le présent protocole décrit le processus d’analyse de l’hétérogénéité de l’expression génique unicellulaire dans deux pathosystèmes modèles: celui formé par le P. syringae pv. souche de tomate DC3000 et Arabidopsis thaliana (Col-0), et l’autre par P. syringae pv. phaseolicola souche 1448A et plants de haricots (cultivar Phaseolus vulgaris Canadian Wonder). Une méthode d’inoculation est proposée basée sur l’infiltration sous vide à l’aide d’une chambre à vide et d’une pompe, ce qui permet d’obtenir une méthode rapide et sans dommage pour infiltrer les feuilles entières. En outre, comme amélioration par rapport aux protocoles conventionnels, une méthode plus douce est utilisée pour extraire la population bactérienne de l’apoplaste qui réduit considérablement la perturbation tissulaire, basée sur l’extraction du liquide apoplastique en appliquant des cycles de pression positive et négative en utilisant une petite quantité de volume dans une seringue.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.17 mm coverslip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.6 x 1.6 mm metal mesh</td>
			<td>Buzifu</td>
			<td></td>
			<td>Fiberglass screen mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm diameter pots</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>140 mm Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological agar</td>
			<td>Roko</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope Stellaris</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSVerse cell analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin sulfate</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>G-0124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
			<td>Phytotechnology</td>
			<td>K378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant substrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet L-77</td>
			<td>Cromton Europe Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum chamber 25 cm diameter</td>
			<td>Kartell</td>
			<td>554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>GAST</td>
			<td>DOA-P504-BN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell analysis of the expression of pseudomonas syringae genes within the plant tissue

Une pléthore de micro-organismes pathogènes attaquent constamment les plantes. Le complexe d’espèces Pseudomonas syringae englobe des bactéries phytopathogènes à Gram négatif d’une importance particulière pour un grand nombre d’hôtes. P. syringae pénètre dans la plante par la surface des feuilles et se multiplie rapidement dans l’apoplaste, formant des microcolonies qui occupent l’espace intercellulaire. L’expression constitutive des protéines fluorescentes par les bactéries permet de visualiser les microcolonies et de suivre le développement de l’infection au niveau microscopique. Les progrès récents dans l’analyse unicellulaire ont révélé la grande complexité atteinte par les populations bactériennes isogéniques clonales. Cette complexité, appelée hétérogénéité phénotypique, est la conséquence de différences intercellulaires dans l’expression des gènes (non liées aux différences génétiques) au sein de la communauté bactérienne. Pour analyser l’expression des loci individuels au niveau unicellulaire, les fusions transcriptionnelles avec des protéines fluorescentes ont été largement utilisées. Dans des conditions de stress, comme celles qui se produisent lors de la colonisation de l’apoplaste végétal, P. syringae se différencie en sous-populations distinctes en fonction de l’expression hétérogène de gènes clés de virulence (c.-à-d. le système de sécrétion Hrp de type III). Cependant, l’analyse unicellulaire d’une population donnée de P. syringae récupérée à partir de tissus végétaux est difficile en raison des débris cellulaires libérés lors de la perturbation mécanique intrinsèque aux processus d’inoculation et d’extraction bactérienne. Le présent rapport décrit en détail une méthode mise au point pour surveiller l’expression des gènes d’intérêt de P. syringae au niveau unicellulaire pendant la colonisation d’Arabidopsis et de haricots. La préparation des plantes et les suspensions bactériennes utilisées pour l’inoculation à l’aide d’une chambre à vide sont décrites. La récupération des bactéries endophytes à partir de feuilles infectées par extraction de liquide apoplastique est également expliquée ici. Les méthodes d’inoculation bactérienne et d’extraction bactérienne sont optimisées empiriquement pour minimiser les dommages aux cellules végétales et bactériennes, ce qui donne des préparations bactériennes optimales pour la microscopie et l’analyse par cytométrie en flux.

L’expression du système de sécrétion de type III est essentielle à la croissance bactérienne au sein de la plante. L’expression opportune des gènes T3SS est obtenue grâce à une régulation complexe, au centre de laquelle se trouve le facteur sigma de la fonction extracytoplasmique (ECF) HrpL, l’activateur clé de l’expression des gènes liés à T3SS11. Une analyse de l’expression de hrpL a été précédemment réalisée en utilisant une fusion transcriptionnelle situé...

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Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

Le présent protocole décrit une méthode qui permet l’analyse de l’expression génique unicellulaire sur des populations de Pseudomonas syringae cultivées dans l’apoplaste végétal.

Analyse unicellulaire de l’expression des gènes de Pseudomonas syringae dans le tissu végétal

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic ...

Notre protocole fournit une méthode douce d’inoculation et d’extraction des plantes qui permet de récupérer les populations bactériennes cultivées dans l’apoplast foliaire adaptée à l’analyse de l’expression génique unicellulaire telle que la cytométrie en flux. Cette méthode permet d’extraire une quantité considérable de bactéries de l’apoplast sans contaminer de manière significative les échantillons avec des débris cellulaires végétaux. Cette méthode optimisée pour la récupération des bactéries apoplastiques peut être appliquée directement ou avec des modifications mineures à un certain nombre de systèmes bactériens végétaux comprenant soit des bactéries phytopathogènes, soit des bactéries endocytaires bénéfiques.La démonstration de la procédure sera Nieves Lopez-Pagan, une doctorante de notre laboratoire. Pour commencer, remplissez un pot de 10 centimètres de diamètre avec un mélange de substrat végétal 1:3 de vermiculite préalablement arrosé. Couvrir le pot avec un treillis métallique perforé et ajuster le treillis métallique au sol humide à l’aide d’un élastique.Ensuite, semez les graines d’Arabidopsis dans les trous du treillis métallique avec un cure-dent humide. Placez trois à quatre graines dans des positions éloignées dans le pot. Couvrir le pot avec un dôme en plastique pour maintenir une humidité relative élevée et incuber pour la stratification à quatre degrés Celsius pendant 72 heures.Transférez le pot dans une chambre de croissance des plantes dans des conditions de journée courte. Pour découvrir le pot, retirez le dôme en plastique. Une fois les graines germées, utilisez la pince à épiler pour enlever la plupart des plants, en gardant un plant dans chacune des positions du pot.Ensuite, préparez des plants de haricots Phaseolus vulgaris en recouvrant le fond d’une boîte de Petri avec un morceau de serviette en papier humide et en plaçant les graines de haricots dessus. Scellez la boîte de Petri avec du ruban chirurgical et incuber à 28 degrés Celsius pendant trois à quatre jours. Transférer les graines germées dans un pot de 10 centimètres de diamètre rempli d’un mélange humide de substrat de vermiculite 1:3 et incuber dans une chambre de croissance des plantes sous de longues journées.Étaler le stock de glycérol de la souche d’intérêt de Pseudomonas syringae de moins 80 degrés Celsius dans une plaque LB complétée par les antibiotiques appropriés. Incuber la plaque à 28 degrés Celsius pendant 40 à 48 heures. Grattez la biomasse bactérienne et remettez-la en suspension dans cinq millilitres de chlorure de magnésium 10 millimolaires.Mesurez la densité optique à 600 nanomètres et ajustez-la à 0,1 en ajoutant du chlorure de magnésium de 10 millimolaires. Effectuer des dilutions en série dans du chlorure de magnésium de 10 millimolaires pour obtenir une concentration finale d’inoculum de cinq fois 10 à la cinquième UFC par millilitre. Ensuite, préparez 200 millilitres d’inoculum pour les plantes d’Arabidopsis et 50 millilitres pour les plants de haricots.Avant l’inoculation, ajouter le tensioactif Silwet L-77 à une concentration finale de 0,02 % pour l’inoculation des haricots et de 0,01 % pour Arabidopsis. Pour l’infiltration d’Arabidopsis, placez deux bâtons de bois formant un X sur le pot et placez le pot face vers le bas sur une boîte de Petri de 14 centimètres de diamètre contenant 200 millilitres d’inoculum. Pour l’inoculation des feuilles de haricot, insérer les plantes et la solution d’inoculum dans une chambre à vide et introduire la feuille dans un tube centrifugeur conique de 50 millilitres contenant l’inoculum.Donnez une impulsion de 500 millibars pendant 30 secondes pour infiltrer les feuilles. Égoutter l’excès de solution d’inoculum avec un morceau de papier et remettre les plans dans leur chambre de croissance correspondante. Quatre jours après l’inoculation, coupez soit la partie aérienne de la plante d’Arabidopsis, soit la feuille inoculée du haricot et placez-la dans une seringue de 20 millilitres sans aiguille.Pour les feuilles de haricot, roulez la feuille sur elle-même, en laissant la face abaxiale vers l’extérieur. Ajouter suffisamment d’eau distillée pour couvrir le tissu. Ensuite, insérez le piston qui maintient la seringue en position verticale et retirez l’excès d’air et les bulles d’air à l’intérieur de la seringue en tapotant doucement le canon jusqu’à ce que tout l’air soit situé près de l’embout et, après avoir retiré l’air, couvrez l’extrémité du corps de la seringue avec un film de paraffine.Maintenant, appuyez soigneusement sur le piston pour générer une pression positive jusqu’à ce que le tissu devienne plus foncé. Ensuite, tirez sur le piston pour générer une pression négative. Retirez le film de paraffine et le piston et recueillez le liquide contenant les bactéries extraites de l’apoplaste.Pour une analyse unicellulaire, préparer une solution d’agarose à 1,5% dans de l’eau distillée. Une fois fondu, ajoutez suffisamment de volume pour remplir l’espace entre deux lames de microscopie placées côte à côte et placez une autre lame sur le dessus. Laissez-les conduire pendant 15 minutes et retirez soigneusement la glissière placée sur le dessus.À l’aide d’une lame, couper le tampon d’agarose en morceaux de cinq millimètres sur cinq millimètres avant utilisation. En parallèle, centrifuger un millimètre de la bactérie extraite de l’apoplaste. Retirez délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette et remettez la pastille en suspension dans 20 microlitres d’eau pour concentrer les cellules.Placez une goutte de deux microlitres des cellules concentrées sur un couvercle de 0,17 millimètre et couvrez la goutte avec un morceau de tampon d’agarose. Visualisez la préparation bactérienne au microscope confocal pour identifier les bactéries fluorescentes vertes à l’aide de lasers spécifiques. Identifiez toutes les bactéries à l’aide du champ clair et fusionnez les deux champs.Pour effectuer une analyse par cytométrie en flux, prendre une partie aliquote des suspensions de bactéries extraites de l’apoplaste. Analysez à l’aide du cytomètre en flux et obtenez 100 000 événements. L’expression de la GFP hrpL est surveillée par fluorescence GFP.Les graphiques à points montrent la distribution de l’intensité de fluorescence de la GFP par rapport à la taille des cellules dans la population, tandis que les histogrammes montrent l’intensité de fluorescence de la GFP par rapport au nombre de cellules. Les pourcentages hrpL ON étaient plus élevés que les pourcentages correspondants de hrpL OFF. Les images de microscopie à fluorescence montrent des niveaux hétérogènes de GFP associés à l’expression de hrpL.Les bactéries présentant une fluorescence faible ou nulle de GFP sont observées. Pour des résultats optimaux, soyez doux lors des étapes d’extraction des bactéries pour éviter d’endommager le tissu végétal et ainsi limiter la contamination par le contenu cellulaire végétal. Les échantillons de bactéries obtenus peuvent être utilisés à d’autres fins où la réduction de la contamination des plantes est un avantage, telles que les extractions d’acides nucléiques pour une analyse génomique bactérienne ou transcriptomique ultérieure.

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CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

Protocole CUBIC Visualise Protein Expression à cellule unique Résolution dans les préparations entières de la peau de montage

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Visualisation Fréquence Stromule avec Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

Dissection de l&#39;Auditory Bulla chez les souris postnatale: Isolation des os de l&#39;oreille moyenne et l&#39;analyse histologique

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...