Name: single-cell analysis of the expression of pseudomonas syringae genes within the plant tissue
Uploaded: 2022-10-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט מענק RTI2018-095069-B-I00 במימון MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ ועל ידי "ERDP דרך לעשות אירופה". J.S.R. מומן על ידי Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación (PAIDI 2020). N.L.P. מומן על ידי פרויקט Grant P18-RT-2398 מ-Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación.

1. הכנת הצמח
<ol><li>הכינו צמחי Arabidopsis Col-0 לפי השלבים הבאים.<ol><li>ממלאים עציץ בקוטר 10 ס"מ בתערובת מצע ורמיקוליט-צמח ביחס 1:3 (ראו טבלת חומרים), שהושקה בעבר, ומכסים את העציץ ברשת מתכת בגודל 15X15 ס"מ עם חורים בגודל 1.6 מ"מ x 1.6 מ"מ. התאימו את רשת המתכת לאדמה הרטובה באמצעות גומייה (<strong class="xf...

<ol>
	<li>Weigel, W. A., Dersch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity:+A+bacterial+virulence+strategy.">Phenotypic heterogeneity: A bacterial virulence strategy.</a> Microbes and Infection. 20 (9-10), 570-577 (2018).</li><li>Hare, P. J., LaGree, T. J., Byrd, B. A., DeMarco, A. M., Mok, W. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+technologies+to+study+phenotypic+heterogeneity+and+bacterial+persisters.">Single-cell technologies to study phenotypic heterogeneity and bacterial persisters.</a> Microorganisms. 9 (11), 2277 (2021).</li><li>Mansfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top+10+plant+pathogenic+bacteria+in+molecular+plant+pathology.">Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13 (6), 614-629 (2012).</li><li>Morris, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+history+of+the+plant+pathogen+Pseudomonas+syringae+is+linked+to+the+water+cycle.">The life history of the plant pathogen Pseudomonas syringae is linked to the water cycle.</a> The ISME Journal. 2 (3), 321-334 (2008).</li><li>Rufi&#225;n, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+reveals+in+planta+dynamic+interactions+between+pathogenic,+avirulent+and+non-pathogenic+Pseudomonas+syringae+strains.">Confocal microscopy reveals in planta dynamic interactions between pathogenic, avirulent and non-pathogenic Pseudomonas syringae strains.</a> Molecular Plant Pathology. 19 (3), 537-551 (2018).</li><li>Macho, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+of+plant+cellular+functions+by+bacterial+type-III+effectors:+Beyond+suppression+of+immunity.">Subversion of plant cellular functions by bacterial type-III effectors: Beyond suppression of immunity.</a> New Phytologist. 210 (1), 51-57 (2016).</li><li>Xiao, Y., Hutcheson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+promoter+sequence+recognized+by+a+newly+identified+alternate+sigma+factor+directs+expression+of+pathogenicity+and+host+range+determinants+in+Pseudomonas+syringae.">A single promoter sequence recognized by a newly identified alternate sigma factor directs expression of pathogenicity and host range determinants in Pseudomonas syringae.</a> Journal of Bacteriology. 176 (10), 3089-3091 (1994).</li><li>Rufi&#225;n, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chromosome-located+transcriptional+fusions+to+fluorescent+proteins+for+single-cell+gene+expression+analysis+in+Pseudomonas+syringae.">Generating chromosome-located transcriptional fusions to fluorescent proteins for single-cell gene expression analysis in Pseudomonas syringae.</a> Methods in Molecular Biology. 1734, 183-199 (2018).</li><li>Rufian, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+syringae+differentiates+into+phenotypically+distinct+subpopulations+during+colonization+of+a+plant+host.">Pseudomonas syringae differentiates into phenotypically distinct subpopulations during colonization of a plant host.</a> Environmental Microbiology. 18 (10), 3593-3605 (2016).</li><li>Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+thaliana-Pseudomonas+syringae+interaction.">The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction.</a> Arabidopsis Book. 1, 0039 (2002).</li><li>Fouts, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomewide+identification+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000+promoters+controlled+by+the+HrpL+alternative+sigma+factor.">Genomewide identification of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 promoters controlled by the HrpL alternative sigma factor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2275-2280 (2002).</li><li>Huber, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Robust Statistics. , (1981).</li><li>Freed, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+screen+to+identify+promoters+conferring+high+levels+of+phenotypic+noise.">A simple screen to identify promoters conferring high levels of phenotypic noise.</a> PLoS Genetics. 4 (12), 1000307 (2008).</li><li>Hirano, S. S., Upper, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+in+the+leaf+ecosystem+with+emphasis+on+Pseudomonas+syringae-a+pathogen,+ice+nucleus,+and+epiphyte.">Bacteria in the leaf ecosystem with emphasis on Pseudomonas syringae-a pathogen, ice nucleus, and epiphyte.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (3), 624-653 (2000).</li><li>Lindeberg, M., Myers, C. R., Collmer, A., Schneider, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roadmap+to+new+virulence+determinants+in+Pseudomonas+syringae:+Insights+from+comparative+genomics+and+genome+organization.">Roadmap to new virulence determinants in Pseudomonas syringae: Insights from comparative genomics and genome organization.</a> Molecular Plant Microbe Interactions. 21 (6), 685-700 (2008).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+leaf+infiltration+assay+for+fine+characterization+of+plant+defense+responses+using+the+Arabidopsis+thaliana-Pseudomonas+syringae+pathosystem.">Bacterial leaf infiltration assay for fine characterization of plant defense responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae pathosystem.</a> Journal of Visualized Experiments. (104), e53364 (2015).</li><li>O'Leary, B. M., Rico, A., McCraw, S., Fones, H. N., Preston, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+infiltration-centrifugation+technique+for+extraction+of+apoplastic+fluid+from+plant+leaves+using+Phaseolus+vulgaris+as+an+example.">The infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using Phaseolus vulgaris as an example.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), e52113 (2014).</li><li>Tornero, P., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+quantifying+growth+of+phytopathogenic+bacteria+in+Arabidopsis+thaliana.">A high-throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 28 (4), 475-481 (2001).</li></ol>

השיטה המוצגת כאן מתארת הליך לא פולשני המאפשר חדירת חיידקים לרקמת העלווה של הצמח, ומאפשר חיסון מהיר של נפחים גדולים תוך מזעור הפרעה לרקמות. אחד המאפיינים של קומפלקס מיני מזרקי P . הוא היכולת לשרוד ולהתרבות בתוך אפופלסט הצמח ועל פני הצמח כאפיפיט14. לפיכך, לא ניתן לשלול את האפ?...

חיידקים פתוגניים מציגים הבדלים בפנוטיפים מגוונים, מה שגורם להיווצרות תת-אוכלוסיות בתוך אוכלוסיות זהות גנטית. תופעה זו ידועה בשם הטרוגניות פנוטיפית והוצעה כאסטרטגיית הסתגלות במהלך אינטראקציות חיידקים-מארחים1. ההתקדמות האחרונה ברזולוציה האופטית של מיקרוסקופים קונפוקליים, ציטומטריית זרימה ומיקרופלואידיקה, בשילוב עם חלבונים פלואורסצנטיים, טיפחה אנליזות חד-תאיות של אוכלוסיות חיידקים2.
מזרקי Pseudomonas גראם-שליליים הם חיידקים פתוגניים צמחיים ארכיטיפיים בשל חשיבותם האקדמית והכלכלית3. מחזור החיים של מזרקי P. קשור למחזור המים4. מזרקי P. נכנסים לחללים הבין-תאיים שבין תאי המזופיל, אפופלסט עלה הצמח, דרך פתחים טבעיים כגון פיוניות או פצעים5. ברגע שהוא בתוך האפופלסט, מזרקי P. מסתמכים על מערכת ההפרשה מסוג III (T3SS) ועל המשפיעים המועתקים מסוג III (T3E) כדי לדכא את חסינות הצמח ולתפעל את תפקודי התא הצמחי לטובת הפתוגן6. הביטוי של T3SS ו-T3E תלוי בווסת הראשי HrpL, גורם סיגמא חלופי הנקשר למוטיבים של תיבת HRP באזור המקדם של גני המטרה7.
על ידי יצירת איחוי שעתוק הממוקם בכרומוזומים לגנים חלבוניים פלואורסצנטיים במורד הזרם של הגן המעניין, ניתן לעקוב אחר ביטוי גנים בהתבסס על רמות הפלואורסצנטיות הנפלטות ברמת התא הבודד8. בשיטה זו נקבע כי ביטוי HRPL הוא הטרוגני הן בתרביות חיידקים הגדלות במעבדה והן באוכלוסיות חיידקים שנמצאו מהצמח אפופלסט 8,9. למרות שניתוח ביטוי גנים ברמת התא הבודד מבוצע בדרך כלל בתרביות חיידקים הגדלות באמצעי מעבדה, ניתוחים כאלה יכולים להתבצע גם על אוכלוסיות חיידקים הגדלות בתוך הצמח, ובכך לספק מידע רב ערך על היווצרות תת-אוכלוסיות בהקשר הטבעי. מגבלה פוטנציאלית לניתוח אוכלוסיות חיידקים המופקות מהצמח היא ששיטות חיסון קלאסיות על ידי חדירת לחץ מזרק לאפופלסט, ואחריה מיצוי חיידקים על ידי השרייה של רקמת העלה, מייצרות בדרך כלל כמות גדולה של פסולת צמחית תאית המפריעה לניתוח במורד הזרם10. רוב פסולת התא מורכבת מקטעים אוטופלואורסצנטיים של כלורופלסטים החופפים לפלואורסצנטיות GFP, והתוצאה היא תוצאות מטעות.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את תהליך ניתוח ההטרוגניות של ביטוי גנים חד-תאיים בשתי מערכות מודל: זו שנוצרה על ידי מזרקי P. pv. זן עגבניות DC3000 ו Arabidopsis thaliana (Col-0), והשני על ידי P. מזרקים pv. זן פאזוליקולה 1448A וצמחי שעועית (Phaseolus vulgaris cultivar Canadian Wonder). שיטת חיסון מוצעת המבוססת על חדירת ואקום באמצעות תא ואקום ומשאבה, וכתוצאה מכך שיטה מהירה ונטולת נזקים לחדירת עלים שלמים. יתר על כן, כשיפור לפרוטוקולים הקונבנציונליים, משתמשים בשיטה עדינה יותר למיצוי אוכלוסיית החיידקים מהאפופלסט המפחיתה באופן משמעותי את הפרעה הרקמות, המבוססת על מיצוי נוזל אפופלסטי על ידי הפעלת מחזורים של לחץ חיובי ושלילי באמצעות כמות קטנה של נפח בתוך מזרק.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.17 mm coverslip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.6 x 1.6 mm metal mesh</td>
			<td>Buzifu</td>
			<td></td>
			<td>Fiberglass screen mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm diameter pots</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>140 mm Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological agar</td>
			<td>Roko</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope Stellaris</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSVerse cell analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin sulfate</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>G-0124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
			<td>Phytotechnology</td>
			<td>K378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant substrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet L-77</td>
			<td>Cromton Europe Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum chamber 25 cm diameter</td>
			<td>Kartell</td>
			<td>554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>GAST</td>
			<td>DOA-P504-BN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell analysis of the expression of pseudomonas syringae genes within the plant tissue

שפע של מיקרואורגניזמים פתוגניים תוקפים כל הזמן צמחים. קומפלקס מיני מזרקי Pseudomonas כולל חיידקים גראם-שליליים צמחיים-פתוגניים בעלי רלוונטיות מיוחדת למספר רב של פונדקאים. מזרקי P . נכנסים לצמח מפני השטח של העלה ומתרבים במהירות בתוך האפופלסט, ויוצרים מיקרו-מושבות המאכלסות את החלל הבין-תאי. הביטוי המכונן של חלבונים פלואורסצנטיים על ידי החיידקים מאפשר הדמיה של המיקרוקולוניות ומעקב אחר התפתחות הזיהום ברמה המיקרוסקופית. ההתקדמות האחרונה באנליזה של תא בודד חשפה את המורכבות הגדולה שאליה מגיעות אוכלוסיות חיידקים איזוגניים משובטים. מורכבות זו, המכונה הטרוגניות פנוטיפית, היא תוצאה של הבדלים בין תאים בביטוי גנים (שאינם קשורים להבדלים גנטיים) בקרב קהילת החיידקים. כדי לנתח את הביטוי של אתרים בודדים ברמת התא היחיד, נעשה שימוש נרחב באיחוי שעתוק לחלבונים פלואורסצנטיים. בתנאי עקה, כמו אלה המתרחשים במהלך קולוניזציה של אפופלסט הצמח, מזרקי P. מתמיינים לתת-אוכלוסיות נפרדות בהתבסס על ביטוי הטרוגני של גנים אלימים מרכזיים (כלומר, מערכת ההפרשה מסוג Hrp III). עם זאת, ניתוח חד-תאי של כל אוכלוסיית מזרקי P . נתונה שהתאוששה מרקמת הצמח הוא מאתגר בשל הפסולת התאית המשתחררת במהלך השיבוש המכני המהותי לתהליכי החיסון ומיצוי החיידקים. הדו"ח הנוכחי מפרט שיטה שפותחה כדי לעקוב אחר ביטוי של גנים בעלי עניין של P. syringae ברמת התא הבודד במהלך ההתיישבות של Arabidopsis וצמחי שעועית. מתוארים הכנת הצמחים והתרחיפים החיידקיים המשמשים לחיסון באמצעות תא ואקום. ההתאוששות של חיידקים אנדופיטיים מעלים נגועים על ידי מיצוי נוזל אפופלסטי מוסברת גם כאן. הן שיטות החיסון החיידקי והן שיטות מיצוי החיידקים ממוטבות אמפירית כדי למזער את הנזק לצמחים ולתאי חיידקים, וכתוצאה מכך ההכנות החיידקיות אופטימליות למיקרוסקופיה ולניתוח ציטומטריית זרימה.

ביטוי מערכת ההפרשה מסוג III חיוני לצמיחת חיידקים בתוך הצמח. הביטוי בזמן של גנים T3SS מושג באמצעות ויסות מורכב, שבמרכזו גורם הסיגמה של הפונקציה החוץ-ציטופלזמית (ECF) HrpL, המפעיל העיקרי של ביטוי גנים הקשורים ל- T3SS11. ניתוח הביטוי של hrpL בוצע בעבר באמצעות איחוי שעתוק הממוקם כרומוזום ?...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue at JoVE.com

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה המאפשרת ניתוח ביטוי גנים של תא בודד על אוכלוסיות מזרקי Pseudomonas הגדלות בתוך אפופלסט הצמח.

אנליזה חד-תאית של ביטוי גנים של מזרקי Pseudomonas בתוך רקמת הצמח

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic ...

הפרוטוקול שלנו מספק שיטת חיסון ומיצוי צמחית עדינה המאפשרת לשחזר אוכלוסיות חיידקים הגדלות באפופלסט העלה המתאים לניתוח ביטוי גנים של תא בודד כגון ציטומטריית זרימה. שיטה זו מאפשרת מיצוי של כמות ניכרת של חיידקים מהאפופלסט מבלי לזהם משמעותית את הדגימות בפסולת תאית צמחית. שיטה אופטימלית זו לשחזור חיידקים אפופלסטיים יכולה להיות מיושמת ישירות או עם שינויים קלים במספר מערכות חיידקים צמחיות הכוללות חיידקים פתוגניים צמחיים או חיידקים אנדוציטיים מועילים.מי שתדגים את ההליך תהיה ניבס לופז-פגאן, דוקטורנטית מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל, מלאו עציץ בקוטר 10 ס"מ בתערובת מצע צמחי ורמיקוליט 1:3 שהושקה בעבר. מכסים את העציץ ברשת מתכת מחוררת ומתאימים את רשת המתכת לאדמה הרטובה באמצעות גומייה.לאחר מכן, לזרוע זרעי Arabidopsis לתוך החורים של רשת מתכת עם קיסם רטוב. מניחים שלושה-ארבעה זרעים במקומות מרוחקים בתוך העציץ. מכסים את הסיר בכיפת פלסטיק כדי לשמור על לחות יחסית גבוהה ודגרים לריבוד בארבע מעלות צלזיוס למשך 72 שעות.מעבירים את העציץ לתא גידול של הצמח בתנאים קצרים. כדי לחשוף את הסיר, הסירו את כיפת הפלסטיק. לאחר שהזרעים נובטים, השתמשו בפינצטה כדי להסיר את רוב השתילים, תוך שמירה על שתיל אחד בכל אחד ממיקומי העציץ.לאחר מכן הכינו צמחי שעועית Phaseolus vulgaris על ידי כיסוי תחתית צלחת פטרי בחתיכת מגבת נייר רטובה והנחת זרעי השעועית מעליה. אוטמים את צלחת הפטרי בסרט כירורגי ודגרים בחום של 28 מעלות צלזיוס למשך שלושה עד ארבעה ימים. מעבירים את הזרעים המונבטים לעציץ בקוטר 10 ס"מ מלא בתערובת רטובה של מצע צמחי ורמיקוליט ביחס 1:3 ודגרים בתא גידול של צמחים בתנאים ארוכי יום.פזרו את מלאי הגליצרול של זן מזרקי Pseudomonas המעניין ממינוס 80 מעלות צלזיוס לתוך צלחת LB בתוספת אנטיביוטיקה מתאימה. לדגור על הצלחת ב 28 מעלות צלזיוס במשך 40 עד 48 שעות. לגרד את הביומסה החיידקית ולהשהות אותה מחדש בחמישה מיליליטר של מגנזיום כלורי 10 מילימולרי.מדוד את הצפיפות האופטית ב- 600 ננומטר והתאם אותה ל- 0.1 על ידי הוספת מגנזיום כלורי 10 מילימולרי. בצע דילולים סדרתיים במגנזיום כלורי של 10 מילימולר כדי לקבל ריכוז חיסוני סופי של פי חמש פי 10 עד החמישי CFU למיליליטר. לאחר מכן, להכין 200 מיליליטר של inoculum עבור צמחי Arabidopsis ו 50 מיליליטר עבור צמחי שעועית.לפני החיסון, יש להוסיף את חומר פעילי השטח סילווט L-77 לריכוז סופי של 0.02% לחיסון שעועית ו-0.01% לארבידופסיס. לחדירת ארבידופסיס מניחים שני מקלות עץ היוצרים X מעל הסיר ומניחים את הסיר עם הפנים כלפי מטה מעל צלחת פטרי בקוטר 14 ס"מ המכילה 200 מיליליטר אינקולום. לחיסון עלי שעועית, הכניסו את הצמחים ואת תמיסת האינקולום לתא ואקום והכניסו את העלה לצינור צנטריפוגה חרוטי של 50 מיליליטר המכיל את החיסון.תן דופק של 500 מיליבר במשך 30 שניות כדי לחדור את העלים. מסננים את תמיסת החיסון העודפת בעזרת פיסת נייר ומחזירים את התוכניות לתא הגידול המתאים להן. ארבעה ימים לאחר החיסון, חותכים את החלק האווירי של צמח הארבידופסיס או את העלה המחוסן מצמח השעועית ומניחים אותו במזרק של 20 מיליליטר ללא מחט.עבור עלי שעועית, לגלגל את העלה על עצמו, משאיר את הפנים abaxial כלפי חוץ. מוסיפים מספיק נפח של מים מזוקקים כדי לכסות את הרקמה. לאחר מכן, הכנס את הבוכנה המחזיקה את המזרק במצב זקוף והסר את עודפי האוויר ובועות האוויר בתוך המזרק על ידי הקשה עדינה על החבית עד שכל האוויר ממוקם ליד הקצה, ולאחר הסרת האוויר, כסה את קצה חבית המזרק בסרט פרפין.עכשיו בזהירות לחץ על הבוכנה כדי ליצור לחץ חיובי עד הרקמה הופך כהה יותר. לאחר מכן, משוך את הבוכנה כדי ליצור לחץ שלילי. הסר את סרט הפרפין ואת הבוכנה ולאסוף את הנוזל המכיל את החיידקים שחולצו אפופלסט.לאנליזה של תא בודד, הכינו תמיסת אגרוז של 1.5% במים מזוקקים. לאחר ההמסה, הוסף מספיק נפח כדי למלא את החלל בין שתי שקופיות מיקרוסקופיה המונחות זו לצד זו והניחו שקופית נוספת למעלה. תן להם לנהוג במשך 15 דקות והסר את המגלשה שהונחה על החלק העליון בזהירות.בעזרת להב, חותכים את כרית האגרוז לחמישה מילימטר על חמישה מילימטר לפני השימוש. במקביל, צנטריפוגה מילימטר אחד של החיידק המופק אפופלסט. בזהירות להסיר את supernatant באמצעות פיפטה ו resuspend את הגלולה לתוך 20 מיקרוליטר מים כדי לרכז את התאים.מניחים טיפה של שני מיקרוליטר של התאים המרוכזים על מכסה 0.17 מ"מ ומכסים את הטיפה עם חתיכת כרית אגרוז. דמיינו את הכנת החיידקים תחת המיקרוסקופ הקונפוקלי כדי לזהות חיידקים פלואורסצנטיים ירוקים באמצעות לייזרים ספציפיים. זהה את כל החיידקים באמצעות השדה הבהיר ומיזג את שני השדות.כדי לבצע ניתוח על ידי ציטומטריית זרימה, לקחת aliquot של תרחיפים חיידקים אפופלסט. לנתח באמצעות ציטומטר זרימה ולרכוש 100, 000 אירועים. ביטוי של hrpL GFP מנוטר על ידי פלואורסצנטיות GFP.גרפי תרשים הנקודות מראים את התפלגות עוצמת הפלואורסצנטיות של GFP לעומת גודל התא באוכלוסייה, ואילו ההיסטוגרמות מראות את עוצמת הפלואורסצנטיות של GFP לעומת ספירת תאים. אחוזי hrpL ON היו גבוהים מהאחוזים המקבילים של hrpL OFF. תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מראות רמות הטרוגניות של GFP הקשורות לביטוי של hrpL.החיידקים המציגים פלואורסצנטיות GFP נמוכה או ללא פלואורסצנטיות נצפים. לקבלת תוצאות מיטביות, היו עדינים במהלך שלבי מיצוי החיידקים כדי למנוע פגיעה ברקמת הצמח ובכך להגביל את הזיהום מתכולת תאי הצמח. דגימות החיידקים המתקבלות יכולות לשמש למטרות אחרות שבהן הפחתת זיהום הצמח היא יתרון, כגון מיצוי חומצות גרעין לניתוח גנומי חיידקי או שעתוק לאחר מכן.

Research

JoVE Journal

Biology

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

תא יחיד electroporation in vivo בתוך המוח המתפתח אינטקט

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

רובוטיקה ניתוח תמונה דינאמית ללימודים של ביטוי גנים ברקמות הצמח

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

ב הכינון במבחנה של ט פעילים castaneum שהטלומרז

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

הביטוי ניתוח Linker-היסטון תת סוגים יונקים

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure.  H1 is essential ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

פלואורסצנטי, מיקרוסקופ הקרנת ואת הדור הבא הרצף: כלים שימושיים לזיהוי גנים המעורבים אברון Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

ניתוח של גלובל RNA סינתזה ברמת התא בודד הבאות היפוקסיה

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

הדמית ארגון מחדש מרחבית של מסלול איתות MAPK שימוש במערכת הביטוי החולפת הטבק

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

פרוטוקול מעוקב מדמיין ביטוי החלבון ברזולוציה תא יחיד תכשירים לעור הר שלם

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

חזותי תדר Stromule עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

דיסקציה של בולה השמיעה של עכברים אחרי לידה: בידוד של עצמות באוזן התיכונה ניתוח היסטולוגית

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...